Nous remercions les membres de la Division des sciences du génome et le laboratoire de biologie des systèmes et la médecine, RCAST, l’Université de Tokyo. Nous remercions tout particulièrement m. H. Aburatani, Dr T. Kodama, (LSBM, RCAST, l’Université de Tokyo), Dr K. Tomizuka, Dr A. et Dr T. Yoshida Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) pour des discussions utiles et soutien. Ce travail a été partiellement soutenu par la subvention pour scientifique (A) (26710005, T.O.), Young subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (26116711 et 16 H 01567, T.O.) et subvention pour défier Recherche exploratoire (16K 14605, T.O.) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon, le FNS Takeda (T.O.), la Fondation Kobayashi de recherche sur le Cancer (T.O.) et le projet de recherche sur le Cancer et Evolution thérapeutique (P-créer) et la pratique en recherche pour la lutte contre le Cancer innovateur de la Japan Agency for Medical Research and Development, AMED (T.O.).

1. préparation du milieu de Culture acide
<ol><li>
Préparation du contrôle (pH 7,4) et le milieu de culture de faible pH (pH 6,8)
	<ol>
<li>Dissoudre 4,75 g de poudre DMEM sans L-glutamine dans 500 mL d’eau.</li>
		<li>Préparer 0,33 M NaHCO3 solution dans un flacon étanche à la pression. ATTENTION : Il est important d’utiliser une bouteille étanche pression émet de NaHCO3 CO2 gaz lorsqu’il est chauffé et thermiquement décomposée.</li>
		<li>Stériliser le milieu et la solution. Permettre à ces tampons refroidir à 25 ° C.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de 200 mM de L-glutamine, 5 mL de pénicilline-streptomycine et 50 mL de sérum de veau fœtal dans 500 mL de DMEM sans bicarbonate.</li>
		<li>Pour fluide de pilotage (pH 7,4), ajouter 2,4 mL de 0,33 M NaHCO3 solution par 100 mL de DMEM sans bicarbonate. Pour les moyennes de faible pH (pH 6,8), ajouter 0,6 mL de 0,33 M NaHCO3 solution par 100 mL de DMEM sans bicarbonate.</li>
		<li>Vérifier le pH du milieu après 24 h d’incubation à 37 ° C de moins de 5 % de CO2. Remarque : La quantité de NaHCO3 solution doit être ajustée selon le pH du milieu, qui peut différer selon la teneur en CO2 de l’incubateur et la pression de l’air. Dans l’idéal, pour la première fois, il est préférable de mesurer le pH du milieu avec différentes concentrations de bicarbonate pour déterminer le montant approprié de NaHCO3 solution ajouter à DMEM.<ol>
<li>Récupérer le milieu de culture immédiatement après avoir enlevé la boîte de Pétri de l’incubateur à CO2 et mesurer le pH à l’aide d’un pH-mètre. Maintenez la température moyenne à 37 ° C avec un bain d’eau si nécessaire. Mesurer le pH du milieu trois fois indépendamment. NOTE : NaHCO3 solution doit être conservée à 4 ° C et chaque media doit être fraîchement préparées. Produits disponibles dans le commerce qui peuvent être utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la Table des matières.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer le milieu de culture acide induite par le lactate ou induite par l’HCl
	<ol>
<li>Ajouter 74 µL de solution de lactate ou 125 µL de 1 M HCl à 100 mL de milieu de contrôle (préparé à l’étape 1.1.5).</li>
		<li>Vérifier le pH du milieu après 24 h d’incubation à 37 ° C de moins de 5 % de CO2. Remarque : La quantité de lactate ou HCl solution doit également être ajustée en fonction du pH du milieu, qui peut différer selon la teneur en CO2 dans l’incubateur et la pression de l’air. Idéalement, il est préférable de mesurer le pH du milieu avec serial lactate ou des concentrations de HCl pour déterminer le montant approprié pour l’ajuster au pH désiré du milieu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. la récolte et le traitement des cellules
<ol><li>Commencer à cultiver des cellules à 37 ° C, moins de 5 % de CO2 au moins 1 semaine avant d’effectuer des expériences. Remarque : Les lignées cellulaires utilisées dans cette étude sont répertoriées dans la Table des matières.</li>
	<li>Cellules de passage lorsqu’ils atteignent la confluence de 70 à 90 %. Ne laissez pas les cellules à devenir confluentes. Changer le milieu tous les 2-3 jours pendant la culture quotidienne.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 5 mL de PBS. Aspirer le PBS et ajouter enzyme détachant tels que 1 mL de la trypsine.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont arrondies et commencent à se détacher.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de milieu de culture pour les cellules individuelles et désactiver l’enzyme. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 3 min à 300 x g. aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec milieu de culture.</li>
	<li>Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et le bleu Trypan.</li>
	<li>5 graines 5.0 x 10 cellules/puits d’un plat de 10 cm dans 10 mL de milieu. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C moins de 5 % de CO2.</li>
	<li>Aspirez le milieu de culture, laver les cellules avec 5 mL de PBS et ajouter 10 mL de milieu de culture acide préparé dans la Section 1. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C moins de 5 % de CO2.</li>
</ol>3. les ARN
<ol><li>Milieu de culture d’aspirer et laver les cellules avec 5 mL de PBS. Perturber les cellules par ajout de réactif d’extraction d’ARN (voir Tableaux des matériaux).</li>
	<li>Gratter le plat brièvement, puis retirez le réactif d’extraction d’ARN avec une pipette et déposer le RNA extraction réactif/lysat cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Laisser à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 250 chloroforme µL et agiter le tube vigoureusement pendant environ 15 s. congé à température ambiante pendant 5 min et centrifuger à ≥ 8, 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer délicatement la phase aqueuse à l’aide d’une pipette. Laissez derrière certains de la phase aqueuse. Placer dans un autre tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 550 µL isopropanol dans la phase aqueuse et mélanger doucement. Laisser à température ambiante pendant 5 min. centrifugeuse à vitesse maximale (≥ 20, 000 x g) pendant 20 min à 4 ° C.</li>
	<li>Décanter l’isopropanol et ajouter 1 mL d’éthanol 75 % au DEPC l’eau traitée. Mélanger doucement. Centrifuger à 8 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Pipetter, au large de l’éthanol et les laisser que sécher à l’air les pellets.</li>
	<li>Ajouter qu'environ 15 à 25 µL (selon le taux de rendement) de DEPC l’eau traitée au culot RNA. Mélanger soigneusement.</li>
	<li>Mesurer la concentration de l’ARN isolé en mesurant le diamètre extérieur à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
</ol>4. synthèse de cDNA
<ol><li>Combiner les composants suivants dans un tube de réaction PCR : jusqu'à 5 µg d’ARN total, 1 µL Oligo dT (50 µM) ou mélange aléatoire de Primer (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP et exempte de nucléase eau pour un volume total de 14 µL.</li>
	<li>Mélanger et centrifuger brièvement les composants à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse petite (~ 5 s). Dénaturer l’échantillon/amorce d’ARN pendant 5 min à 65 ° C. Tourner brièvement (~ 5 s) à l’aide d’une petite table centrifuger et mettre l’échantillon rapidement sur la glace pendant au moins 1 minute.</li>
	<li>Ajoutez les composants suivants : 4 µL 5 x tampon Reverse Transcription, 1 µL de la Transcriptase inverse (200 U/µL), 1 µL inhibiteur de RNase (40 U/µL). NOTE : Exemples de kits disponibles dans le commerce sont montrées dans la Table des matières
</li>
	<li>Bouchon du tube, mélanger et centrifuger brièvement le contenu à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse petite (~ 5 s). Incuber le mélange de réaction combinée à 50-55 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Inactiver la réaction en incubant à 80 ° C pendant 10 min.</li>
</ol>5. mesure de l’Expression des gènes sensibles aux acides à l’aide de la PCR en temps réel
<ol><li>Combiner les composants suivants dans une plaque 384 puits réaction : 1 µL modèle cDNA, µL 0.75 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µL 50 µM avec impatience apprêt, 0,3 µL 50 µM reverse primer, 1 µL Taq polymérase, 2,5 µL 10 x mémoire tampon de la Taq polymérase, 2,5 µL 20 mM dNTP, 16,65 µL eau. NOTE : Exemple des kits disponibles dans le commerce sont montrées dans la Table des matières. Une liste d’amorces est indiquée dans le tableau 1. Une plaque 96 puits de réaction peut être également utilisée dans cette étape. Autres sondes (p. ex., sonde Taqman) peuvent également être utilisés.</li>
	<li>Mettre en place l’expérience et le programme PCR suivant sur un système de PCR en temps réel : 50 ° C pendant 2 min, 1 cycle ; 95 ° C pendant 10 min, 1 cycle ; 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 1 min, 40 cycles ; 95 ° C pendant 15 s, 1 cycle ; 60 ° C pendant 15 s, 1 cycle ; 95 ° C pendant 15 s, 1 cycle.</li>
	<li>Placer la plaque dans l’instrument de qPCR. Démarrez le programme. NOTE : Stimulation de l’expression des gènes sensibles pH MSMO1, INSIG1et IDI1 peuvent être mesurée par le taux de protéines.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

L’auteur Ayano Kondo est un employé de Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Ici, nous avons décrit un système simple de pH acide de la culture et de son processus d’évaluation. La combinaison des trois méthodes d’acidification moyenne, c'est-à-dire, concentration de bicarbonate réduit, ajout de lactate et addition de HCl, nous a permis d’étudier le mécanisme de pH-réponse soigneusement et de comparer la réponse cellulaire à l’autre tumeur conditions micro-environnementales telles que l’hypoxie ou nutriment famine.
La clé de cette méthod...

Le microenvironnement tumoral joue un rôle crucial dans la progression tumorale et cancer cell metabolism1,2,3. Cellules cancéreuses sont souvent exposés à des conditions telles que l’hypoxie, appauvrissement nutritif et acide pH extracellulaire (pHe). Cependant, le rôle de pHe dans la progression tumorale n’a pas été précisé aussi largement comme la famine d’hypoxie ou d’éléments nutritifs. La pHe dans le tissu de la tumeur peut devenir acide, atteignant environ pH 6,84,5. Le pH acide résulte de l’excrétion de glycolyse aérobie et anaérobie des protons (H+) et lactate par la prolifération du cancer cellules5,6.
Des études récentes ont révélé que histone pHe induite par l’acide désacétylation, oxydation des acides gras et exocytose des lysosomes acides pour l’adaptation à l’environnement acide sévère7,8,9,10. Cependant, les mécanismes par lequel l’acidification extracellulaire affecte comportement du cancer et l’identité de la clé dans le microenvironnement tumoral de pH acide, les organismes de réglementation n’ont pas été entièrement établis. En outre, plusieurs rapports décrivent divers milieux de pH acide en utilisant des concentrations peu claires de bicarbonate, de tampon HEPES, Tris et tuyaux ou de lactate et de HCl, mais il y a peu de rapports pour démontrer la stabilité de l’ajusté moyenne ni complète Comparaison de plusieurs milieux de culture acides distincts7,8,9,10
Afin d’élucider les régulateurs clés et des changements métaboliques dans les cellules cancéreuses dans le contexte de l’acidification extracellulaire, nous avons établi un modèle de culture simple in vitro afin de maintenir un acide pHe et a examiné le rôle de pHe dans le cancer des cellules11. En utilisant cette méthode, nous avons maintenu un milieu de culture acide avec un pHe de 6,8 à 37 ° C moins de 5 % CO2, en utilisant des concentrations réduites de bicarbonate dans le milieu de culture. pH 7,4 a été utilisé comme d’habitude et moyen de contrôle. Le pH du milieu a été maintenu pendant au moins 24 h et progressivement diminué après 72 h au cours de la culture de cellules de cancer du pancréas PANC-1 et CNPA-1. Parce que la glycolyse améliorée accélère l’excrétion de non seulement des protons, mais aussi des lactate7,8,9, nous avons aussi établi une méthode de culture imitant acidose induite par le lactate par ajout de lactate, plutôt que de réduire la concentration de bicarbonate. En outre, induite par l’HCl acide pHe dans le milieu nous permet d’exclure la possibilité que des réponses cellulaires à pH acide milieu de culture ne sont pas en raison d’une diminution de la concentration de bicarbonate. En outre, à l’aide de différents médias avec un pH de 6,4 à 7,4 avec concentration de bicarbonate différents, nous pouvons évaluer l’étendue des effets de pHe sur les réponses cellulaires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Conditions du microenvironnement tumoral, telles que l’hypoxie ou à la famine en éléments nutritifs, jouent un rôle crucial dans la progression du cancer et des tumeurs malignes. Cependant, le rôle des acides pH extracellulaire à l’agressivité de la tumeur et son mécanisme sous-jacent n'a pas été étudié par rapport à des conditions de famine hypoxique ou en éléments nutritifs. En outre, une méthode de culture bien définie pour imiter le microenvironnement de la tumeur extracellulaire acide n’a été entièrement signalée.
Nous présentons ici une méthode de culture simple in vitro afin de maintenir à l’aide de l’acide pH extracellulaire réduit de bicarbonate et une augmentation de lactate ou HCl concentration dans le milieu de culture. Le pH du milieu a été maintenu pendant au moins 24 h et progressivement diminué de 72 h après culture des cellules de cancer du pancréas PANC-1 et CNPA-1. Trois conditions de milieu acide distincts dans cette étude hautement surexprimés des gènes sensibles aux pH tels que MSMO1, INSIG1et IDI1 comparativement à l’hypoxie ou à la famine en nutriments. La stimulation de l’expression de ces gènes peut servir comme indicateur de pH acide. Ces techniques simples sont bénéfiques pour élucider les mécanismes sous-jacents de la malignité de la tumeur sous microenvironnement tumoral acides. Notre système de culture extracellulaire acide pH permet donc, découverte des réponses cellulaires acides pH non seulement dans les cellules cancéreuses, mais aussi dans les cellules primaires, telles que les cellules tubulaires rénales, en ce qui concerne les autres acides troubles notamment, acidocétose diabétique, l’acidose lactique, l’acidose tubulaire rénale et une acidose respiratoire.

Pour déterminer la concentration de bicarbonate approprié, nous avons préparé DMEM à distance de 0 - 8 mM NaHCO3 (concentration finale dans le milieu de culture) et succède à la préparation de milieux de culture avec un pH allant de 6,4 à 7,4 (Figure 1). Nous avons préparé DMEM avec 8 mM NaHCO3 (pH 7,4) comme un moyen de contrôle et de 2 millimètres NaHCO3 (pH 6,8) comme un moyen avec un pH acide selon un précéd...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Le microenvironnement tumoral acide joue un rôle crucial dans la progression tumorale. Afin d’évaluer les effets des acides pH extracellulaire sur le cancer des cellules in vitro, nous avons établi des systèmes de culture acides simples.

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

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Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

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14.5K vues.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Le microenvironnement tumoral acide joue un rôle crucial dans la progression tumorale. Afin d’évaluer les effets des acides pH extracellulaire sur le cancer des cellules in vitro, nous avons établi des systèmes de culture acides simples.

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Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The plant hormone auxin rapidly stimulates cell elongation in young stems and similar tissues at least in part by an acid-growth mechanism 2, 3. Auxin activates a H+ pump in the plasma membrane, causing acidification of the cell wall solution. Wall acidification activates expansins, which are endogenous cell wall-loosening proteins 4, causing the cell wall to yield to the wall tensions created by cell turgor pressure. As a result, the cell begins to enlarge rapidly. This 'acid growth' phenomenon is readily measured in isolated (nonliving) cell wall specimens. The ability of cell walls to undergo acid-induced extension is not simply the result of the structural arrangement of the cell wall polysaccharides (e.g. pectins), but depends on the activity of expansins 5. Expansins do not have any known enzymatic activity and the only way to assay for expansin activity is to measure their induction of cell wall extension. This video report details the sources and preparation techniques for obtaining suitable wall materials for expansin assays and goes on to show acid-induced extension and expansin-induced extension of wall samples prepared from growing cucumber hypocotyls.
 To obtain suitable cell wall samples, cucumber seedlings are grown in the dark, the hypocotyls are cut and frozen at -80 &deg;C. Frozen hypocotyls are abraded, flattened, and then clamped at constant tension in a special cuvette for extensometer measurements. To measure acid-induced extension, the walls are initially buffered at neutral pH, resulting in low activity of expansins that are components of the native cell walls. Upon buffer exchange to acidic pH, expansins are activated and the cell walls extend rapidly. We also demonstrate expansin activity in a reconstitution assay. For this part, we use a brief heat treatment to denature the native expansins in the cell wall samples. These inactivated cell walls do not extend even in acidic buffer, but addition of expansins to the cell walls rapidly restores their ability to extend.

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

We demonstrate the use of a constant-force extensometer to measure long-term extension (creep) of plant cell wall specimens induced by acidic buffers and expansin protein.

Mesure Extension mur cellulaire végétale (Creep) induite par un pH acide et par Alpha-expansine

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Recherche

Biologie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d&#39;imagerie et de microchirurgie

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de culture à étudier la thyroïde développement

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Développement d&#39;un système d&#39;insertion Co-culture de deux types cellulaires en l&#39;absence de Cell-Cell Contactez

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

Mise en place d’une Culture clonale d’algues unicellulaires de conjugaison

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

Culture d’organoïdes 3D intestinaux de porcelet à partir de cryptes épithéliales cryoconservées et établissement de monocouches cellulaires

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Amélioration de l’isolement des vésicules extracellulaires bactériennes pour la multi-omique du microbiote

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

Pleins feux sur l’auteur : Accélérer la recherche sur la séparation et l’hétérogénéité des vésicules extracellulaires bactériennes 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.

Isolement et purification de vésicules extracellulaires bactériennes à partir de matières fécales humaines à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité