Shalom.The BW Reporter System permet d’étudier les interactions récepteur-ligand. Il est extrêmement utile dans les cas où le ligand d’un récepteur spécifique est inconnu ou dans les cas où les expériences avec le ligand endogène sont techniquement difficiles. Cette méthode est sensible et spécifique à un récepteur individuel, facile à utiliser et reproductible.
Shira Kahlon, postdoc pour mon laboratoire, démontrera la procédure. La veille de la transfection, plaquez 10 plaques avec 10 millilitres de 100 000 cellules BW5147, et complétons un RPMI. Ensuite, placez 100 microgrammes du plasmide pcDNA3 dans un tube.
Ajouter l’acétate de sodium au pH 5.3 au tube. Après cela, ajouter 2,5 volumes de 100% d’éthanol au mélange de plasmides. Puis incuber le mélange de plasmides pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius.
24 heures après le placage des cellules BW, recueillir les cellules dans deux tubes de 50 millilitres. Puis centrifuger les cellules à 515 g pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Resuspendez le peloton RPMI sans ajouts et répétez la centrifugation.
Resuspendez la pastille résultante dans 1 millilitre de RPMI sans ajouts. Transférer la pastille résuspendée sur une couette de 4 centimètres sur la glace. Centrifugeuse du plasmide qui a subi des précipitations d’éthanol.
Ensuite, lavez le plasmide avec un millilitre de 70% d’éthanol. Et répéter la centrifugation pendant encore 20 minutes. Retirer tout l’éthanol et laisser sécher partiellement la pastille.
Puis résuspendez la pastille en 100 microlitres de RPMI préchauffé, sans ajouts. Après cela, ajouter le plasmide résuspendé aux cellules dans cuvet. Incuber les cellules sur la glace pendant cinq minutes.
Ensuite, électroporer les cellules. Transférer ensuite les cellules électroporées dans un tube de 50 millilitres. Ajouter 50 millilitres de milieu complet au tube et à la centrifugeuse pendant cinq minutes, à 515 g.
Jetez le supernatant, et resuspendez les cellules dans 50 millilitres de milieu complet. Ensuite, plaquez les cellules dans des plats de culture de 24 puits, et couvez les cellules pendant 48 heures. Après cela, ajouter un millilitre de milieu complet, complété par 10 milligrammes par millilitre de G418 à chaque puits.
48 heures plus tard, jeter un millilitre du volume supérieur de chaque puits. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu complet complété par cinq milligrammes par millilitre de G418 à chaque puits. Utilisez 50 000 cellules BW transfectées avec leurs cibles désirées, dans un seul puits d’une plaque de 96 puits.
Incuber la plaque pendant 48 heures. Congelez ensuite la plaque à moins 20 degrés Celsius. Enduire une plaque ELISA d’anticorps ANTI-souris IL-2.
Placer 05 microgrammes d’anti-souris IL-2, dans un volume de 50 microlitres de PBS dans chaque puits. Incuber la plaque enduite pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Utilisez une brève période d’incubation à 37 degrés Celsius, pour décongeler les cellules BW congelées, qui étaient auparavant incubées avec leurs cibles.
Ensuite, centrifugez la plaque, et transférez 100 microlitres du supernatant de chaque puits à la plaque ELISA pré-enduite. Et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après cela ajouter biotine anti-souris IL-2 à la plaque ELISA.
Ensuite, après l’incubation et le lavage, ajouter la streptavidine conjuguée HRP à la plaque. Après incubation et lavage, ajouter 100 microlitres de la solution de substrat TMB à chaque puits de la plaque ELISA. Enfin lire la plaque ELISA à 650 nanomètres.
Dans cet exemple, les cellules CLL ont été pré-incubées avec différents anticorps anti-CD20. Et puis co-incubé avec des cellules BW transfected qui expriment les récepteurs Fc CD16, avant d’être analysé avec ELISA. Après analyse avec ELISA, les résultats ont été quantifiés.
Les niveaux de densité optique ont été convertis en concentrations de souris IL-2, basées sur la courbe standard. Dans une expérience supplémentaire, différentes doses d’anticorps anti-CD20 ont été pré-incubées avec des cellules CLL. Et puis incubé avec les cellules BW transfectées.
La particule contient quatre parties principales. Clonage, transfection des cellules BW, activation et ELISA. Chacune des pièces doit être vérifiée indépendamment.
Après cette procédure, des expériences supplémentaires peuvent être réalisées avec des cellules qui expriment les récepteurs endogènes, tels que tuer les acides avec les cellules NK pour étudier les interactions avec les récepteurs cellulaires NK. Nous avons utilisé ce système pour découvrir de nouveaux ligands de récepteurs cellulaires NK. Par exemple, l’hémagglutinine est un ligand de NKp46, et PVL est un ligand de TG.
