Ce travail a été soutenu par la division de la recherche intra-muros au National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) et un Lenfant biomédicale postdoctorale attribués à DAL.

1. Préparation du matériel requis pour explant Brains troisième stade larvaire <ol><li> Préparer les outils nécessaires pour microdissection. <ol><li> Forge deux outils de dissection (un scalpel et un crochet) en plaçant d&#39;abord un axe de dissection unique dans chaque support de broche. Garantir les broches étroitement main et l&#39;aide de pinces (La figure 1C). </li><li> Utilisez une paire de vieilles pinces à plier une broche de dissection à un angle d&#39;environ 120 °. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour s&#39;assurer que la moitié supérieure de la broche à plat lorsque le support de broche est tenu dans la main. Cet outil sera utilisé comme un scalpel de maintenir enfoncée ou couper à travers le tissu. </li><li> Utilisez une paire de vieilles pinces à plier la seconde broche en forme de crochet qui sera utilisé pour contenir et gratter les tissus. </li><li> Couvrir chaque outil de dissection avec une pointe de pipette pour protéger les outils de dommages. Avec des soins, des outils bien formés peuvent être utilisés pour la dissection indéfiniment. Remplacer les broches endommagées ou déformées si nécessaire. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Préparer dissection moyen. <ol><li> Dans une hotte de culture tissulaire, diluer le supplément de l&#39;antibiotique antifongique dans le milieu de culture de Schneider. Agiter les médias à intégrer le supplément. </li><li> Préparer plusieurs aliquotes de 5 ml des milieux supplémentés. Conservez tous les médias à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Réchauffer une portion aliquote de 5 ml de milieu additionné à température ambiante. Tracer le milieu dans une seringue stérile de 5 ml et le visser sur un filtre à seringue de 0,2 um stérile. </li></ol></li><li> Sélectionnez larves pour la dissection. Utiliser une sonde de dissection pour sélectionner ramper troisième stade larvaire que le cerveau sera plus facile à disséquer. En option: le dépôt des larves sur une plaque de gélose de raisin. Note: Ne pas utiliser les flacons ou bouteilles trop bondés avec &quot;la nourriture humide», comme ils ont tendance à forcer deuxième ou larves de premier stade de ramper prématurément. Remarque: Certains milieux génétiques nécessiteront l&#39;aide de jeunes larves. Cela n&#39;affecte pas le protocole, mais ne fait la dissection plus difficile. </li></ol> 2. Dissection du système nerveux central <ol><li> Sur une lame de verre unique, créer deux piscines de 50 ml de médias de dissection chaudes séparées d&#39;environ 3 cm. Une piscine sera utilisé pour la dissection brut et autres utilisées pour dissection fine (figure 1C). </li><li> Transférer plusieurs larves à l&#39;une des gouttes de médias. </li><li> Déplacer la lamelle couvre-objet avec des larves d&#39;un microscope à dissection. Faire un zoom dans la piscine contenant des larves de telle sorte que les extrémités antérieure et postérieure des larves sont discernables. </li><li> Utilisez une paires de pinces pour saisir la mi-région d&#39;une seule larve. Prenez une seconde paire de pinces dans l&#39;autre main et saisir la larve près de la même région. Tirez sur les deux paires de pinces à part pour le déchirer doucement la larve de moitié. Répétez les deux étapes précédentes pour toutes les larves sur la lamelle. </li><li> Éliminer les moitiés postérieures du corps des larves en les transférant à un tissu. </li><li> Zoomez sur une larve de sorte que ee antérieures mouthhooks sont clairement visibles. Utiliser les deux paires de pinces pour créer une petite incision ou encoche, sur des côtés opposés des larves mouthhooks entre la troisième et la première thoracique bandes de denticle antérieures. </li><li> Saisissez les mouthhooks avec la pince dans la main non dominante. Utilisez la pince dans l&#39;autre main pour éplucher doucement cuticule dans une direction antérieure à postérieure. Continuer à peler lentement cuticule jusqu&#39;à ce que le système nerveux central est exposé. </li><li> Isoler le système nerveux central du reste de la larve par déchirement des tissus avec la pince. Faites attention de ne pas perturber le système nerveux central. Étape critique: Ne pas tirer sur le système nerveux central! Jeter échantillons endommagés par un cordon déchiré ventral de nerf (figure 2A) ou lobes optiques déformées (figures 2B et 2B). </li><li> Répétez les deux étapes précédentes pour toutes les larves sur la lamelle. Transférer le tissu sain explantée à ladeuxième (propre) Piscine de milieu sur la lamelle pour la phase de dissection amende. </li><li> Utilisez les outils de broches de dissection pour déblayer les tissus périphériques (par exemple, les yeux, les ailes et les jambes disques) du cerveau. Faites glisser le scalpel entre le voulu (cerveau) et le tissu non désirée, épinglant le tissu conjonctif de la lamelle. Utilisez le crochet pour taquiner doucement le tissu indésirable tout en appuyant sur le scalpel à la lamelle dans les mouvements de scie, etc. </li><li> Étape cruciale: Travaillez lentement et délibérément de supprimer tous les disques de chaque cerveau. Faites attention de ne pas perturber la morphologie du cerveau. Un cerveau sain aura un cordon intact ventrale de nerf et symétrique, lobes optiques rondes (figure 2C). </li></ol> 3. Montage Brains explantées pour l&#39;imagerie en direct <ol><li> Inverser une boîte de culture de 50 mm perméable au gaz avec le film transparent vers le haut (figure 2D). Appuyer sur la seringue pour déposer une petite goutte (environ 30 pi) de support sur til centre de l&#39;assiette. </li><li> Transférer les cerveaux isolés, un à la fois, à la goutte de milieu sur le plat. Utilisez l&#39;outil de crochet pour ramasser un cerveau sous les lobes optiques. Vous pouvez également utiliser une pince pour saisir axones de la corde nerveuse ventrale. </li><li> Recueillir 5-10 cerveau dans la goutte de milieu. Immerger les cerveaux en utilisant les outils de broches de dissection pour pousser le cerveau des individus à la partie inférieure de la goutte de milieu en tant que nombre d&#39;entre eux seront piégés au niveau du ménisque (figure 2E). </li><li> Orientez le cerveau en utilisant les outils de broches de dissection d&#39;aligner cerveau en fonction de la notifiés à imager (figure 3A). À l&#39;image de la NBs dorsale, placez la corde nerveuse ventrale vers le bas (le long de la membrane). À l&#39;image de la BNS de antéro-ventral, placent le cerveau avec la corde nerveuse ventrale vers le haut (loin de la membrane). Aligner les cerveaux de telle sorte que tous les cordons nerveux ventraux pointent dans la même direction dans le plan xy. </li><li> Utiliser une seringue ou en plastique transfert pipette de placer 4 halocarbures (HC) des gouttes d&#39;huile (environ 30 pi de chacun) sur la membrane perméable aux gaz. Le volume de chaque goutte d&#39;huile doit être équivalente à l&#39;autre et à la goutte de milieu. L&#39;espace des gouttes d&#39;huile de correspondent aux quatre coins d&#39;une lamelle couvre-objet centré autour de la goutte de milieu de culture. Une fois terminé, les cinq gouttes (quatre gouttes d&#39;huile et une goutte de milieu dans le centre) ressembleront les cinq facettes sur de style occidental dés (figure 3B). </li><li> Abaisser une lamelle # 1,5 mm 22 sur l&#39;assemblage de telle sorte qu&#39;il frappe l&#39;ensemble des cinq gouttes en même temps. Le maintien d&#39;une pression, même à travers les échantillons réduit la probabilité qu&#39;ils seront perturbés. Attendre environ 3 minutes, comme de l&#39;huile et de milieu de dispersion sous le poids de la lamelle. Une forme de croix de médias se former (figures 3C et 3D). </li><li> Étape cruciale: Abaisser la lamelle sur la surface du cerveau en enlevant l&#39;excès médias utilisant une mèche de papier tissu (Figure 3C). Pour ce faire, tout en regardant l&#39;échantillon sous le microscope à dissection. Comme les médias est enlevé, la lamelle sera inférieur. Arrêtez une fois la lamelle touche le cerveau. Ne pas trop mèche au risque de provoquer de distorsion du tissu ou du cerveau explosions. </li><li> Si l&#39;imagerie dorsale notifiés (figure 3F), passez à l&#39;étape 3.9. Si imagerie NBs de antéro-ventrale, la lamelle doit être légèrement déplacé (en poussant doucement avec une pince) dans le sens des conseils nerf de la moelle ventrale. Cela provoque le cerveau à tourner, ce qui amène les lobes du cerveau en contact direct avec la lamelle couvre-objet pour faciliter la formation d&#39;image (figure 3F). </li><li> Sceller la chambre en entourant la lamelle couvre-objet avec de petites quantités d&#39;huile d&#39;hydrocarbure halogéné (Figure 3D). L&#39;excès d&#39;huile qui suinte de la lamelle doit être minimisée et effacé loin avec un tissu. </li></ol> 4. Imagerie en direct de Central Neuroblastes cerveau Note: Pour ce travail, un disque tournant Nikon Eclipse TiMicroscope confocal (microscope inversé) a été utilisée pour l&#39;imagerie en temps réel; détails de notre installation ont déjà été publiés 31. En variante, l&#39;échantillon peut être imagé en utilisant un système à la verticale. <ol><li> Ajouter une goutte d&#39;huile d&#39;immersion à la lamelle juste au-dessus des cerveaux montés. Cela vous aidera à centrer l&#39;objectif directement au-dessus de l&#39;échantillon. </li><li> Étape cruciale: Maintenir cerveau à une température constante de 25 ° C avec un incubateur d&#39;étape. Positionnez délicatement l&#39;échantillon monté dans l&#39;incubateur de la scène et couvrir la chambre avec son couvercle. </li><li> Localiser NBs centrales du cerveau en utilisant la lumière transmise en se concentrant sur ​​les grandes cellules rondes qui résident dans les zones centrales et médiales des lobes optiques, ne pas utiliser épi-fluorescence. Cela devient plus facile avec la pratique. Il est très important d&#39;exposer l&#39;échantillon à la moindre quantité de lumière que possible. Ne perdez pas de cerveau d&#39;imagerie de temps qui sont endommagés. </li><li> Une fois en place, prendre des positions rapides utilisant le confocale àdéterminer l&#39;emplacement et la profondeur adéquate. Limiter la profondeur à la première 10-15 um. Ajustez au besoin, et prendre une autre image de test. <ol><li> Étape facultative: Recueillir un film d&#39;essai de la corde nerveuse ventrale pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de dérive de xy. Si la dérive est détectée, attendre 15-30 minutes pour l&#39;échantillon à régler. Si la dérive ne s&#39;installe pas en 30 min, préparer un nouvel échantillon. Dérive majeure peut généralement être retracée à l&#39;ajout de l&#39;excès d&#39;huile, ou la taille inégale des gouttes d&#39;huile pendant le montage. </li></ol></li><li> Pour éliminer la dérive axiale (z-dérive) utiliser un dispositif de focalisation automatique en continu qui utilise une LED infrarouge. Sinon, corriger manuellement le plan focal. </li><li> Une fois NB d&#39;intérêt est identifiée, procéder à l&#39;imagerie régime. Comme avec tous imagerie des cellules vivantes, la quantité de lumière laser, temps d&#39;exposition, la caméra binning, grossissement de l&#39;objectif, du temps et / ou l&#39;intervalle z étapes doivent toutes être empiriquement optimisé pour une expérience particulière pour répondre à la question à portée de main. L&#39;objectif est de minimiser barrage lumièretandis que de l&#39;âge encore la collecte de données utiles. Voir la discussion pour des informations supplémentaires. <ol><li> L&#39;image de la totalité du volume du NB 12-14 en recueillant des images espacées de 1 um dans l&#39;axe z. Réglez la résolution de temps pour capturer cycles cellulaires simples ou multiples de la même NB. En règle générale, utiliser 10-30 seconde d&#39;intervalle pour l&#39;imagerie du cycle cellulaire unique et 1-3 minutes d&#39;intervalle pour les cycles cellulaires multiples. </li></ol></li><li> Étape cruciale: Assurez-vous que l&#39;échantillon est sain en contrôlant la durée de la mitose. Si la mitose prend plus de 15 minutes, passer à un autre cerveau. Un cerveau sain montrera de nombreux organismes notifiés dans le même champ de vue de subir plusieurs cycles de mitose. A noter que chaque cycle cellulaire est légèrement plus long que le précédent en raison de dommages de la lumière. </li><li> Une fois l&#39;imagerie terminée, démonter la chambre d&#39;incubation, et jetez tout mais les plats de culture perméables aux gaz. Rincer la surface de la boîte de culture avec 95% d&#39;éthanol et essuyez bien avec un tissu. Répéter deux autres fois. </li&gt; </ol> 5. Préparation de Brains pour immunofluorescence <ol><li> Recueillir 20 ou plus expiantes cerveau dans un tube de 1,5 ml, contenant environ 0,2 ml de milieu supplémenté. </li><li> Éliminer le milieu du tube et rincer une fois avec de cerveaux 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS, avec 0,3% de Triton X-100). Laissez cerveaux se déposent au fond du tube entre tous les échanges de liquide. Le détergent Triton X-100 est utilisé pour perméabiliser les tissus. Rinçage prend généralement moins de 30 secondes; il suffit de retirer le PBSTx fois cerveaux se sont installés au fond du tube. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml de paraformaldehyde à 9% d&#39;électrons à niveau de la microscopie dilué dans PBSTx. Incuber avec nutation pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Disposer de fixateur conformément à la réglementation sur les déchets dangereux. </li><li> Laver les échantillons par 0,5 ml PBSTx pendant 15 min. Répétez l&#39;étape de lavage avec PBSTx frais deux fois de plus. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml PBT (PBS, 1% Albumine de sérum bovin (BSA) et 0,1% de Tween-20). Incuber avec nutation pendant 1 heure à température ambiante. Cette blocs de l&#39;étape de liaison non spécifique de l&#39;anticorps au tissu. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml anticorps primaire dilué dans PBT complété avec 4% de sérum de chèvre normal (NGS). Incuber avec nutation pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Jeter ou mettre l&#39;anticorps primaire dilué. </li><li> Laver les échantillons par 0,5 ml PBT pendant 15 min. Répétez l&#39;étape de lavage avec PBT frais deux fois de plus. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml de modification PBT (PBS, BSA 2%, 0,1% de Tween-20, et 4% NGS). Incuber avec nutation pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml anticorps secondaire dilué en PBT modifié. Incuber avec nutation pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml de PBST (PBS avec 0,1% de Tween-20). Incuber avec nutation pendant 15 min à température ambiante. Répétez l&#39;étape de lavage au PBS frais deux fois de plus. </li></ol><ol><li> Transférer soigneusement les échantillons comme une goutte sur une lame de verre, ce qui limite la chute vers la gauche du centre de la diapositive. </li><li> Ajouter une baisse importante (environ 2 cm de diamètre) de milieu de montage (par exemple, Aqua-Poly/Mount) au centre de la diapositive. Évitez la piscine de PBST qui est vers la gauche. </li><li> Utilisez une pince à transférer les cerveaux de la piscine de PBST à la piscine de milieu de montage. Ajout de milieu de montage directement sur le cerveau peut perturber leur orientation et doit être évitée. </li><li> Sous un microscope optique, organiser les échantillons dans le milieu de montage avec le côté qui sera imagé vers le haut. </li><li> Avec la lame sous le microscope optique, abaissez lentement une lamelle de verre # 1.5 sur le dessus des échantillons. Étape facultative: Déloger les bulles d&#39;air mineures en poussant légèrement sur la lamelle. </li><li> Laisser le milieu de montage à polymériser pendant plusieurs heures, ou toute la nuit, par le mensonge diapositives plat, la lumièreprotégé, à la température ambiante. </li><li> Les lames peuvent être imagé le lendemain, ou stocké avant l&#39;imagerie. </li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Imagerie des cellules vivantes est une approche précieuse utilisée pour étudier les mécanismes qui régulent ACD de cellules souches, la différenciation des lignées cellulaires, et la morphogenèse des tissus complexes. Bien que les groupes de recherche ont toujours utilisé une variété de techniques pour visualiser NB ACD, ces approches peuvent généralement être regroupés en deux catégories qui diffèrent principalement quant à savoir si le tissu cérébral est laissé intact ou dissocié. <p class="j...

Les cellules souches de maintenir un équilibre de la différenciation et de l&#39;auto-renouvellement pour générer la diversité cellulaire au cours du développement précoce et remplacer les cellules endommagées dans les tissus adultes. Le règlement de cette homéostasie empêche à la fois la perte et la sur-expansion de la population de cellules souches, ce qui peut entraîner une dégénérescence tissulaire néfaste ou la tumorigenèse. Neuroblastes (NBS) sont les cellules souches neurales largement étudiés du système nerveux central chez la drosophile (figure 1A) que première forme embryonnaire pendant 1, 2. NBs subissent des cycles répétés de la division cellulaire asymétrique (ACD) pour produire deux cellules inégalement malheureuse: une cellule souche auto-renouvellement et une cellule de différenciation. ACD est guidé par centrosomes, les organites non-membraneux qui agissent comme des centres microtubules organisation de la plupart des cellules 3. Au cours de la mitose, centrosomes NB organisent et orientent le fuseau mitotique bipolaire long de la polaire apicale-basaleaxe lité. Lors du clivage de la division NB, les déterminants du devenir apical qui spécifient le destin des cellules souches, et les déterminants du devenir basales qui spécifient la différenciation, sont séparés dans les cellules filles inégales. Dans le cerveau des larves central, deux types de NBs peuvent être distingués par leur nombre, la position, l&#39;expression du facteur de transcription, et la lignée cellulaire (figure 1A) 6.4. Type I ON sont les plus abondants, et environ 90 d&#39;entre eux peuplent les côtés antérieur et postérieur de chaque lobe optique du cerveau 7. Ces organismes notifiés expriment le facteur de transcription Asense (Ase), et ils se divisent caractéristique dans un auto-renouvellement NB et un plus petit ganglion cellule mère (GMC, figure 1B). Chaque GMC subit une seule division borne à générer deux neurones ou des cellules gliales (figure 1B). En revanche, les organismes notifiés huit de type II qui peuplent la face postérieure de chaque lobe optique manquent Ase expression 5. Ils subissent ACDpour produire une auto-renouvellement NB et un progéniteur neural intermédiaire (INP). Le INP, à son tour, se divise de manière asymétrique trois à cinq fois. Chacun de ces résultats des divisions dans la régénération de l&#39;INP et la production d&#39;un seul GMC 4. Collectivement, l&#39;identité spécifique NB et l&#39;ordre temporel de naissance GMC donne lieu à la diversité étonnante de neurones du système nerveux central adulte. Compréhension de la biologie cellulaire qui sous-tend NB ACD a été grandement améliorée par l&#39;utilisation de techniques d&#39;imagerie des cellules. Protocoles publiés utilisées par les chercheurs à l&#39;image NBs vivants varient considérablement. Dans l&#39;ensemble, cependant, ces méthodes peuvent être regroupées en deux catégories générales se distinguent par le fait que le cerveau larvaire est laissé intact ou mécaniquement dissocié. Les deux techniques ont des avantages et des inconvénients distincts en fonction de la demande du chercheur. Les premiers rapports révélant en direct division cellulaire NBsions impliquent un certain degré de dissociation manuel du cerveau larvaire. Ces protocoles détail bavures 8 ou 9 taquiner à part le cerveau afin de développer des cultures primaires à court terme de la BNS sur des lamelles de verre. Pour améliorer l&#39;imagerie, les organismes notifiés rondes sont généralement aplatis sur les lamelles soit avec des lames de verre 8 ou 9 pads agarose. Bien que les cellules aplaties ont amélioré l&#39;optique, ces techniques entraînent souvent des défauts NB mitotiques, y compris la régression du sillon de clivage et l&#39;incapacité à diviser plus d&#39;une fois. Par conséquent, les protocoles qui impliquent à la fois manuel et la distorsion dissociation physique du tissu cérébral larves ne sont généralement adaptés à court terme (c.-à-., Un cycle cellulaire ou moins) très applications. De même, semi-écrasement ou aplatissement complètement cerveaux intacts entre des lames de verre et des lamelles limite le temps on peut passer imagerie un échantillon donné, à une période d&#39;environ 30 min 10. Malgré cette limitation, this approche a été utilisée avec succès 11-14. Les efforts récents de l&#39;image en direct dissociés limite NBs distorsion physique des cellules isolées. Ces techniques sont particulièrement utiles pour des applications où il est nécessaire de maintenir des cultures de cellules pour plusieurs cycles de division cellulaire. Par exemple, les cellules dispersées dans des cerveaux dissociées manuellement peuvent être partiellement noyés dans un caillot fabriqué à partir du mélange de fibrinogène et de la thrombine 15 pour l&#39;imagerie à long terme 16. En variante, les cerveaux explantées peuvent être dissociées premier chimiquement avec l&#39;enzyme collagénase, la prochaine perturbation manuellement par passage répété à travers un embout de pipette, et ensuite étalées sur des boîtes de poly-L-lysine à fond de verre 17, 18. Revêtement plats en verre avec soit fibrinogène ou poly-L-lysine favorise l&#39;attachement et légère propagation des cellules rondes, leur apportant le plus près de la lamelle possible sans distorsion majeure physique. En additisur, ces méthodes impliquent la culture de la notifiés dans un milieu qui peut être facilement échangé des expériences de perturbation pharmacologiques 18. Dans l&#39;ensemble, le placage directement dispersé NBs améliore optique d&#39;imagerie sans sacrifier les capacités d&#39;imagerie à long terme. Récemment, un protocole décrivant la culture à long terme des organismes notifiés dissocié a été détaillé 19. Cependant, cette approche n&#39;est pas sans limites. Il ya plusieurs mises en garde à l&#39;imagerie NBs direct dissociées. Dans un champ de cellules dispersées, par exemple, il est difficile d&#39;identifier des lignées de NB spécifiques qui sont organisées spatialement dans le cerveau intact 1. De même, la distinction du type I par rapport type II notifiés dans le tissu dissocié est également difficile sans l&#39;expression de marqueurs de la lignée ou transgènes spécifiques des sous-types, tels que worniu-GAL4, GAL80 aSENSE-20. Bien que ces transgènes sont très utiles pour certaines applications, ils ne limitent les chercheurs à ceux transgènes expressé sous le contrôle de l&#39;élément UAS d&#39;activateur 21 et nécessitent des systèmes génétiques complexes. Les études qui concernent la mise au point spatial ou temporel du NB, par conséquent, nécessitent l&#39;imagerie in vivo dans le cadre d&#39;un tissu intact. En outre, des études sur les ON embryonnaires dissociées indiquent que le contact physique de cellules adjacentes est critique pour la localisation d&#39;interphase de polarité clé Déterminants 22, 23. Ces études montrent complètement isolé NBs plus maintenir l&#39;axe de fuseau mitotique invariant. Au lieu de cela, ces cellules présentent un axe de broche plus aléatoires et de larges angles de séparation entre les bourgeons GMC successives, peut-être en raison de la perte de positionnement du centrosome apicale 22. Bien que la relation entre les organismes notifiés larves et leurs cellules voisines n&#39;a pas été étudié, il est intéressant de considérer que le microenvironnement des cellules souches larvaire peut empiéter sur la polarité cellulaire ou autrecomportements. Pour maintenir le contexte physiologique des larves de NB, nous l&#39;image ACD à partir de cerveaux entiers. Compte tenu des limites inhérentes à l&#39;imagerie dissocié NB, notre laboratoire et d&#39;autres ont établi des protocoles à l&#39;image des cycles successifs de NB ACD du cerveau larves entières. Les techniques à l&#39;image cerveaux intacts remplacent souvent la surface de verre rigide d&#39;un côté de la chambre de culture avec une membrane flexible pour empêcher la déformation ou endommagement des tissus et pour permettre l&#39;échange de gaz. Certains procédés impliquent le montage cerveaux explantées dans un mélange de milieu de culture d&#39;insecte, le sérum, et l&#39;acide ascorbique avec les corps gras isolés à partir de dix larves 24. Les corps gras isolées sont ajoutés parce qu&#39;ils sécrètent un mitogène connu pour stimuler la division cellulaire NB 25. Ce protocole préserve l&#39;intégrité du tissu pendant plus de 3 heures et est, par conséquent, se prêtent à l&#39;imagerie à long terme 24, 26-28. Récemment, un protocole décrivant la lonimagerie g terme de cerveaux larves intactes en présence de l&#39;acide ascorbique, le sérum et corps gras a été détaillé 29. Il est important, parce que le tissu n&#39;est ni exposé ni immobilisé, cette approche est moins utile pour des applications où milieu de culture est échangé (par exemple, des études de médicaments, immunodéplétion, etc.). Notre laboratoire a simplifié l&#39;ensemble de la préparation de montage de cerveaux de larves vivantes pour l&#39;imagerie à long terme 30, 31. Le principal avantage de notre protocole sur les autres est sa simplicité: nos observations indiquent ni sérum, l&#39;acide ascorbique, de l&#39;insuline, ni corps gras sont les additifs nécessaires à l&#39;image des cycles successifs de NB ACD. Bien que des additifs tels que l&#39;insuline, ont été utiles pour l&#39;imagerie prolongée de divisions de cellules souches 32 et migration collective de cellules dans les ovaires chez la drosophile 33, ils semblent être indispensables pour NB ACD, comme notre moyen d&#39;imagerie consiste en un simple mélange de standard insecte milieu de culture cellulaire supplémenté avec l&#39;antibiotique-antimycosique pour éviter la contamination. Grâce à l&#39;utilisation de plats gaz-perméables ou en verre réutilisables culture sur le fond, nous avons été en mesure de soutenir plusieurs séries de successives NB ACD. Les mêmes échantillons expiantes peuvent facilement être utilisés pour l&#39;immunofluorescence et d&#39;autres procédures avec tissu fixé. Dans ce protocole, nous détaillons la dissection des cerveaux de larves intactes, ainsi que la préparation des cerveaux pour analyse à la fois en direct et fixe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td style="width:167px;">A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Schneider&#39;s S2 Medium</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider&#39;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Glass coverslips, #1.5 22X22 mm</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Minutien dissecting pins</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissecting needle/probe with plastic handle</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe filter, 0.22 mm pore size</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">plastic transfer pipet</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S30467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:380px;">paraformaldehyde, 32% EM-grade</td>
			<td style="width:185px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714</td>
			<td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">DAPI (4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18606-20</td>
			<td>A water-soluble mounting medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

Les cellules souches se divisent de façon asymétrique pour générer deux cellules filles ayant un potentiel de sort inégal: une cellule souche auto-renouvellement et de différenciation d&#39;une cellule. Compte tenu de leur importance pour le développement et la maladie, la compréhension des mécanismes qui régissent la division des cellules souches asymétrique a été une zone robuste d&#39;étude. Parce qu&#39;ils sont génétiquement docile et soumis à des cycles successifs de la division cellulaire environ une fois toutes les heures, les cellules souches du système nerveux central chez la drosophile, ou neuroblastes, sont des modèles indispensables pour l&#39;étude de la division des cellules souches. Environ 100 cellules souches neurales sont situés près de la surface de chacun des deux lobes du cerveau des larves, ce qui rend ce système modèle particulièrement utile pour des études de microscopie d&#39;imagerie en temps réel. Dans ce travail, nous passons en revue plusieurs approches couramment utilisées pour visualiser les divisions de cellules souches, et nous abordons les avantages et les inconvénients de ces techniques qui emploient indissociables contre tissus cérébraux intacts. Nous avons également en détail notre simplified protocole utilisé pour explantation cerveaux entiers de troisième stade larvaire pour l&#39;imagerie des cellules vivantes et des applications d&#39;analyse fixes.

Imagerie en temps réel a élucidé un certain nombre de mécanismes qui régulent NB ACD. Avant l&#39;acquisition des images, il est nécessaire de déterminer les conditions optimales d&#39;imagerie. Il est nécessaire d&#39;équilibrer le taux de capture d&#39;image avec la durée d&#39;imagerie des cellules vivantes. Pour l&#39;analyse cellulaire fine, par exemple, a augmenté temporelle et la résolution optique peut être nécessaire. Quand la visualisation d&#39;un cycle cellulaire NB unique (figure 4A),<...

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l&#39;imagerie des cellules vivantes dans le cadre d&#39;un cerveau intact larvaire. Approches d&#39;imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l&#39;étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d&#39;autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.7K vues.  National Institutes of Health.  Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment. 

Vidéo: Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

Spectroscopie par résonance magnétique du direct Drosophila melanogaster En utilisant Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Recherche

Neurosciences

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisation des larves nerfs segmentaires en 3 Rd Instar Drosophile Les préparatifs des larves

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analyse fonctionnelle du circuit d&#39;alimentation des larves dans Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire Ramper Comportement

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Imagerie en direct de

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Spectroscopie par résonance magnétique du direct Drosophila melanogaster En utilisant Magic Angle Spinning

Visualisation des larves nerfs segmentaires en 3^Rd Instar Drosophile Les préparatifs des larves

Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire

Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d'organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte

Analyse fonctionnelle du circuit d'alimentation des larves dans Drosophila

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au

Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile