Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

L’âge, l’infection et les médicaments ototoxiques peuvent provoquer une dégénérescence des cellules ciliées de l’oreille interne, ce qui entraîne chez nous une perte auditive. Chez les vertébrés non mammifères, tels que les poussins, les cellules ciliées peuvent être régénérées. Les techniques décrites ici utilisent la rentabilité du travail sur les embryons de poussins, la facilité d’obtention d’embryons et le bon développement exologique des explants tissulaires.

Comprendre le développement et la régénération des poils de l’oreille interne aviaire peut fournir des informations importantes sur la perte auditive et les thérapies potentielles, et la culture d’explantation peut être importante pour évaluer les effets ototoxiques de divers médicaments. Avant de commencer l’expérience, procurez-vous des œufs fraîchement pondus et nettoyez-les avec de l’éthanol à 70% pour éviter toute contamination. Incuber les œufs pendant 3,5 à 4 jours, à 37 à 38 degrés Celsius avec 45% d’humidité.

Après l’incubation, repositionnez l’embryon au sommet du jaune en plaçant un œuf sur le côté pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez une pince pour faire un petit trou en haut et à l’extrémité émoussée de l’œuf pour qu’une aiguille de calibre 21 passe à travers. À l’aide d’une seringue de cinq millilitres et d’une aiguille de calibre 21, retirez deux millilitres d’albumine d’un trou à l’extrémité émoussée de l’œuf.

Couvrez le trou à l’extrémité émoussée à l’aide de ruban adhésif transparent. Pour faire la fenêtre de l’œuf, fixez le ruban transparent sur le dessus de la coquille d’œuf. Tenez les aiguilles de la micro-injection à partir de capillaires de verre standard à l’aide d’un extracteur de pipette vertical.

Après avoir tiré, cassez l’extrémité capillaire à l’aide d’une pince fine pour obtenir un diamètre d’embout d’environ 50 micromètres avec une extrémité conique. Pour l’expérience d’élimination du gène, mélangez les trois constructions, à savoir le plasmide guide, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP dans un rapport de un à un avec un microgramme de protéine SP Cas9, 30% de saccharose et 0,1% de colorant vert rapide, et un volume final de 10 microlitres. Lors de l’électroporation de plusieurs plasmides, assurez-vous que la concentration finale d’ADN est d’au moins quatre microgrammes par microlitre.

À l’aide de ciseaux à ressort, coupez une fenêtre de deux centimètres de long et 1,5 centimètre de large et exposez l’embryon. Ensuite, utilisez des pinces pour ouvrir les membranes chorioniques recouvrant l’embryon, permettant ainsi l’accès à l’embryon. Injectez environ 200 nanolitres de mélange de solution d’ADN pour remplir la vésicule otique.

Pour déterminer l’efficacité de l’ARN guide, effectuez un test d’endonucléase T7. Ajoutez des gouttes de solution saline à 0,719% à l’embryon pour abaisser la résistance électrique et éviter la surchauffe. Ensuite, placez l’électrode positive à travers le trou fait du côté émoussé de l’œuf et manœuvrez l’électrode de sorte qu’elle soit sous le jaune.

Placez l’électrode négative sur l’otocyste rempli. Pour transfecter le plasmide dans la vésicule otique avec électroporation, utilisez un générateur d’impulsions carrées et appliquez cinq impulsions de 25 volts pendant 100 millisecondes chacune, espacées de 50 millisecondes. Déterminer les conditions empiriquement sur la base d’une installation d’électroporation individuelle.

Après électroporation, hydratez l’embryon en ajoutant quelques gouttes de solution saline à 0,719%. Refermez l’œuf avec du ruban adhésif transparent et retournez dans l’incubateur humidifié à une température de 37 à 38 degrés Celsius pour une incubation ultérieure. Désinfectez la table chirurgicale, la scène du microscope et la zone environnante en utilisant de l’éthanol à 70 % et de la chaleur, ou stérilisez à l’alcool l’équipement de microdissection, y compris les ciseaux à ressort minimal, le micro-curet et deux paires de pinces fines.

Préparez les plaques de dissection, y compris une boîte de Petri en verre avec une base en silicone noir, une boîte de Petri en plastique de 90 millimètres et une boîte de Petri de 60 millimètres. Gardez le PBS réfrigéré ou la solution saline équilibrée de Hanks, également connue sous le nom de HBSS, prête pour les dissections. Casser doucement l’œuf dans la boîte de Petri de 90 millimètres.

Ensuite, identifiez l’oreille externe du poussin et transférez la tête dans une boîte de Petri de 60 millimètres remplie de PBS glacé. Ensuite, orientez l’embryon avec le haut du bec tourné vers l’intérieur et tenez le bec à l’aide de l’une des pinces numéro cinq. Retirez les yeux à l’aide de la deuxième pince numéro cinq.

Ensuite, du rostral au caudale, coupez le long du crâne le long de sa ligne médiane et retirez le cerveau. Ajoutez plus de PBS glacé, ou HBSS, et localisez les deux otolithes de la lagène comme des structures brillantes à l’extrémité du canal cochléaire et près de la ligne médiane. Pour isoler deux oreilles internes, coupez entre les deux lagenas, et bien au-dessus et au-dessous de la région.

Ensuite, sous un éclairage oblique, visualisez le contour de l’oreille interne et retirez les tissus étrangers et le vestibule. Transférer la cochlée isolée sur une plaque de base en silicone noir avec du PBS glacé. Décollez la capsule cochléaire cartilagineuse à l’aide de la pince numéro cinq pour obtenir le canal cochléaire.

Ensuite, localisez la couche ondulée ou le tegmentum du canal cochléaire et retirez-le à l’aide d’une pince numéro 55 pour exposer la papille basilaire ou la PA. Ensuite, retirez la membrane tectoriale pour exposer les cellules ciliées et les cellules de soutien à l’aide d’une pince numéro 55. Pour la culture membranaire de la papille basilaire, prendre une plaque de culture tissulaire à six puits et disposer un insert de membrane de culture par puits. Prélever un peu de milieu dans une pipette de 200 microlitres, puis aspirer la papille basilaire disséquée explant avec un tampon X HBSS.

Transférez l’explant sur une membrane et orientez-le de manière à ce que la papille basilaire soit orientée vers le haut et que les cheveux et les cellules de soutien soient visibles du haut. Une fois que l’explant est positionné, aspirez lentement le tampon HBSS de la surface de la membrane de culture. Dans ce processus, l’explant se fixera à la membrane de culture.

Remplissez le puits de la plaque des six puits en ajoutant 1,2 millilitre de milieu aigle modifié de dulbecco, ou milieu de culture DMEM, entre l’insert de membrane et la paroi du puits. Pour préparer la culture de collagène du canal cochléaire, ajoutez trois gouttes de mélange de collagène fraîchement préparé dans chaque puits d’une plaque de quatre puits et transférez le canal cochléaire disséqué à chaque goutte de collagène. Incuber la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius, et 5% de dioxyde de carbone pour durcir la matrice de collagène.

Pour un traitement à petite molécule des cultures, remplacer le milieu de culture par 700 microlitres de milieux complétés par le modulateur pharmacologique, tel que la pénicilline, et incuber les plaques comme démontré précédemment. Remplacer 50% des milieux de culture chaque jour. Après un temps d’incubation approprié, retirer le milieu de culture et utiliser les explants pour les essais en aval.

Dans la configuration de l’électroporation, le positionnement correct de l’électrode a entraîné une expression plus élevée de la GFP dans l’oreille interne dans les deux organes vestibulaires et une papille basilaire auditive confirmant la transfection. CRISPR Cas9 a médié l’élimination du gène Atoh1 dans l’oreille interne, entraînant une perte de cellules ciliées. L’élimination du gène Atoh1 via une ovo-électroporation suivie d’une incubation jusqu’à ce que E10 ait montré un développement réduit des cellules ciliées par rapport au contrôle plasmidique vide.

Bien que l’électroporation soit une mosaïque, les cellules électroporées de contrôle ont pu former des cellules ciliées. Dans les échantillons électroporés d’ARNg Atoh1, les cellules vertes fluorescentes positives aux protéines n’ont jamais montré les marqueurs du développement des cellules ciliées. La culture d’organes de la papille basilaire dans une matrice 3D, comme le collagène et la coloration avec des anticorps contre l’antigène des cellules ciliées, a fourni l’excellente préservation de la morphologie tissulaire jusqu’à cinq jours.

L’organisation des cellules ciliées et des cellules de soutien a été maintenue dans ces conditions de culture. Les cultures d’organes sur une membrane peuvent être maintenues jusqu’à cinq jours tout en maintenant l’intégrité du faisceau pileux. Cela peut être vu dans l’image représentative par la localisation de la protéine de liaison de pointe, la protocadhérine 15.

Pour étudier le développement du faisceau de cheveux, l’imagerie à plus haute résolution, telle que la microscopie à super résolution ou la microscopie électronique à balayage, peut fournir plus d’informations. Les conditions stériles doivent être maintenues tout au long de la procédure. Pendant l’électropore, assurez-vous que les embryons ne se dessèchent pas.

Lors du titrage des inhibiteurs pharmacologiques, on peut réduire la concentration pour surmonter toute létalité. Les embryons et les explants peuvent être prélevés pour des expériences d’imagerie. Soit en effectuant une microscopie vidéo en temps réel, soit une microscopation confocale électronique à lumière statique, comme indiqué dans le protocole.

Compte tenu de la facilité et de l’accessibilité de l’utilisation d’explants de l’oreille interne de poussin, nous pouvons utiliser un milieu grâce à un criblage de preuves pour identifier de nouvelles molécules essentielles à la régénération des cellules ciliées.