Ce protocole nous permet d’effectuer une manipulation génétique in vivo dans un modèle animal clé qui nous permet d’étudier l’expansion et le pliage d’un néocortex en développement. Le principal avantage de cette méthode est d’utiliser une grande spécificité spatiale et temporelle pour cibler les cellules souches neurales qui sont le type de cellule clé pour le développement du cerveau. Avant de commencer l’intervention, tirez des capillaires en verre sur un pull de micro pipette et utilisez des forceps pour couper la partie distale du capillaire pour ajuster le diamètre de la pointe capillaire.
Le jour embryonnaire 33, ajouter la concentration appropriée d’ADN dans PBS, complétée par 0,1% Vert rapide avec mélange doux, et placer un furet femelle à jeun de 3 heures, anesthésié, enceinte sur une table d’opération avec un coussin chauffant. Confirmez le niveau approprié de sedation en touchant la peau périoculaire et en pinçant la peau entre les deuxième et troisième ou troisième orteils des deux membres postérieurs. L’isoflurane peut causer des effets indésirables, y compris des nausées et des étourdissements.
Lors de la manipulation de l’isoflurane sous forme liquide, utilisez l’équipement de protection. Pendant la chirurgie, utilisez les bidons appropriés pour capturer le gaz. Injecter l’animal sous-cutanée avec analgésique, antibiotique et glucose, et placer de l’onguent sur les yeux de l’animal.
Utilisez des tondeuses pour raser l’abdomen et nettoyer la peau exposée avec une solution d’eau, de savon et d’iode. Ensuite, séchez la peau avec des écouvillons de gaze et désinfectez avec de l’alcool et des gommages à l’iode. Pour une électroporation in utero, placez un drapé stérile sur l’animal et utilisez un scalpel pour faire une incision cutanée d’environ 5 centimètres au linea alba.
Utilisez des ciseaux pour couper à travers la couche musculaire et placer des écouvillons de gaze autour du site d’incision. Mouiller la gaze avec PBS et placer l’utérus sur les écouvillons. À l’aide d’une pipette avec une longue pointe, chargez l’un des capillaires en verre tirés avec 5 microlitres de solution d’ADN par embryon à injecter.
Fixez le capillaire chargé à un support et connectez l’autre côté du support à un tube et à un embout buccal. Localiser la tête du premier embryon et placer une source de lumière à fibres optiques à côté de la tête. En utilisant l’iris pigmenté comme point de référence, pénétrer la peau, le crâne et le tissu cérébral avec la pointe du capillaire en verre et utiliser le pipetage de la bouche pour faciliter la livraison de 3-5 microlitres de la solution d’injection dans le ventricule de l’un des hémisphères cérébraux.
Puisque la solution injectée contient 0.1% vert rapide, une injection réussie aura comme conséquence une coloration vert foncé du ventricule injecté, qui sera maintenant visible comme structure en forme de rein. Après l’injection, placez les électrodes de la pince à épiler sur l’utérus au-dessus de la tête de l’embryon avec le pôle positif au-dessus de la zone à cibler et le pôle négatif sous la zone injectée. Réglez la longueur d’impulsion de l’électroporate à 50 millisecondes, la tension d’impulsion à 100 volts, l’intervalle d’impulsion à une seconde, et le nombre d’impulsions à cinq.
Lorsque tous les paramètres ont été définis, appuyez sur Pulse » et déposez rapidement plusieurs gouttes de PBS chaud sur l’embryon électroporé. Lorsque tous les embryons ont été électroporés, retournez l’utérus dans la cavité péritonéale et utilisez une suture 4-0 pour fermer la couche musculaire avec le péritoine. Fermez la peau de la même manière et couvrez la plaie d’un spray en aluminium.
Puis remettre l’animal dans sa cage avec une source de chaleur et de surveillance jusqu’à ce que la charge complète. Quatre jours après l’électroporation au jour embryonnaire 37, la plupart des cellules ciblées et leur progéniture sont encore dans les zones germinales et les cellules sont rarement observées plus basally dans la plaque corticale. L’identité progénitrice peut être examinée par immunofluorésence pour les marqueurs des cellules cyclistes, telles que PCNA, tandis qu’un sous-ensemble d’progéniteurs subissant la mitose peut être montré par des marqueurs tels que phospho-histone 3.
Au jour zéro postnatal, huit jours après l’électroporation, la descendance des cellules ciblées s’est propagée à toutes les couches histologiques. À l’aide d’une combinaison de marqueurs de facteurs de transcription, différentes populations d’ancêtre basal peuvent être révélées. Par exemple, Sox2 est un marqueur de cellules progénitrices prolifératives, y compris les gliales radiales basales.
Et la protéine cérébrale T-box 2 est un marqueur des progéniteurs basiques neurogéniques, qui sont principalement des progéniteurs intermédiaires. Au jour postnatal 16, la majorité des cellules ciblées cessent de se diviser et de se différencier en neurones et en gliales, le jour postnatal du furet 16 néocortex présentant le modèle pliant caractéristique. L’électroporation in utero des embryons de furet est une méthode extrêmement puissante pour étudier la fonction des gènes.
Il nous a permis d’étudier les gènes qui ont été impliqués dans l’expansion du néocortex dans l’évolution, y compris les gènes spécifiques à l’homme. Et en utilisant cette méthode puissante, nous avons en effet été en mesure de découvrir les principales caractéristiques de la façon dont l’expansion évolutive du néocortex humain a probablement fonctionné.
