Ce travail a été financé par la subvention pilote et étude de faisabilité de l&#39;UCLA-CURE Center, la maladie de Crohn et la colite Foundation of America Award de développement de carrière (# 2691) et l&#39;Institut National de la Santé NIDDK K01 (DK084256) le financement à l&#39;honorable Wai Koon. Opération d&#39;irradiation de la moelle osseuse a été aidé par Bernard Levin et cuisine Scott de l&#39;UCLA Center for AIDS Research souris / humain installation de base Chimera. Opération de cytométrie en flux a été aidé par l&#39;UCLA installation de base de vecteur.

1. Avant-vous-start Considérations techniques <ol><li> Nous vous recommandons d&#39;utiliser les deux C57/BL6 souris de type sauvage et des souris knock-out pour l&#39;expérience parce que les souris avec des molécules CD correspondantes peuvent être achetés auprès de fournisseurs majeurs de souris. </li><li> Comme il est difficile de suivre les souris de type sauvage et des souris knock-out dérivées des cellules du donneur après transplantation de moelle osseuse, il est nécessaire d&#39;utiliser des souris CD45.1 pour représenter souris de type sauvage. (CD45.1 C57/SJL WT souris Jackson Laboratories stock # 002014). </li><li> La plupart des colonies de souris sont CD45.2. Nos souris knock-out appartiennent à CD45.2 génotype (encore un CD45.2 source de souris WT: Jackson Laboratories stock # 000664). La détermination du génotype CD45.1 ou CD45.2 peut être effectuée en utilisant la cytométrie en flux de moelle osseuse et le sang périphérique tel que mentionné à l&#39;article 7 du présent protocole. </li><li> Souris après irradiation ont un système immunitaire fragilisé. Gardez souris dans usine exempte de pathogène. </li><li> Opération de irradiateur nécessite spécial de sécurité clearance et de la formation. Pour gagner du temps dans les processus de formation et d&#39;agrément, il est préférable de collaborer avec un laboratoire technicien qualifié qui est en mesure d&#39;opérer l&#39;irradiateur. </li><li> De nombreuses institutions ont des laboratoires de cytométrie de flux avec des techniciens expérimentés. Afin de minimiser les problèmes de fonctionnement cytométrie en flux, il est préférable de discuter de votre plan d&#39;expérience cytométrie de flux avec le technicien expérimenté avant de commencer. </li><li> Les souris ont été affectés de cette manière (10 souris par groupe): </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Groupe </td><td></td><td> Donneur de moelle osseuse au destinataire </td><td> Traitement </td></tr><tr><td> A </td><td> BM échange </td><td> WT CD45.1 à CD45.2 KO </td><td> DSS colite </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> Maîtrise de l&#39;eau normale </td></tr><tr><td> C </td><td> BM échange </td><td> CD45.2 KO à CD45.1 WT </td><td> DSS colite </td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td> Maîtrise de l&#39;eau normale </td></tr><tr><td> E </td><td> Comédie </td><td> CD45.1 WT à WT CD45.1 </td><td> DSS colite </td></tr><tr><td> Fa </td><td></td><td></td><td> Maîtrise de l&#39;eau normale </td></tr><tr><td> Sol </td><td> Comédie </td><td> CD45.2 KO KO CD45.2 </td><td> DSS colite </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> Maîtrise de l&#39;eau normale </td></tr></tbody></table> * Une brève illustration du protocole expérimental est représenté sur la figure 1. 2. Bénéficiaire souris irradiation <ol><li> Les souris sont élevés et maintenus exempts d&#39;organismes pathogènes dans l&#39;installation. Placez la souris à tarte irradiation autoclave avec filtre. Placer une souris dans chaque fente de tarte irradiation. Placez la tarte dans l&#39;irradiateur et assurez-vous que le plateau tournant et se tournent tarte. </li><li> Mettez la pompe à airpour la ventilation. Fermez la porte d&#39;irradiation et le verrouiller. </li><li> Irradier les souris avec 1.000 rad (ce qui équivaut à 10 Gy) environ 10 min (selon la source de rayonnement et la demi-vie). De ce point du temps, les souris irradiées sont immuno-déprimés et ont leur faible immunité contre l&#39;infection. Après irradiation, prendre la tarte et placer dans un contenant stérile pour le transport d&#39;enceinte de sécurité biologique dans l&#39;animalerie. Évitez d&#39;exposer les souris à l&#39;environnement externe pour réduire les risques d&#39;infection. </li><li> En enceinte de sécurité biologique, de transférer les souris dans des cages de souris autoclave autoclave avec literie (4 souris par cage Ajouter une nouvelle eau stérile avec suspension Sulfatrim -. 3,12 ml par 100 ml d&#39;eau). </li><li> Envelopper la bouteille d&#39;eau avec du papier aluminium que les antibiotiques sont sensibles à la lumière. Secouez pour mélanger le flacon de solution Sulfatrim avant de la charger dans la cage. </li></ol> 3. Extraction Os Marrow Donor <ol><li> Sacrifier des souris avec du dioxyde de carbone ou isoflurment et puis plonger dans la solution de Lysol 1:200. Vaporiser les souris avec de l&#39;éthanol à 70% pour mouiller la peau et les os disséquer ouverts. </li><li> Faire tremper les instruments de dissection dans l&#39;éthanol à 70% pour la stérilisation. </li><li> La dissection dans une enceinte de sécurité biologique. Utiliser les instruments de dissection stériles pour exposer l&#39;humérus, le fémur, le tibia et du péroné os, libre de se fixer des muscles et des ligaments. </li><li> Couper les deux extrémités des os pour montrer la moelle osseuse rouge. Maintenir les os avec une pince. Rincer la moelle osseuse rouge avec du PBS froid avec une seringue de 3 ml et des aiguilles de 25 G sur une boîte de Pétri. Rincer à partir des deux extrémités des os pour obtenir des cellules de moelle osseuse plus. </li><li> Utilisez 6 seringues ml et 18G1 / 2 aiguilles pour briser les bouchons rouges par la moelle osseuse des ponctions répétées et d&#39;éjection. Transfert de moelle osseuse avec tubes Falcon de 50 ml. </li><li> Faites tourner la moelle osseuse dans 1800 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant, resuspendre le culot par vortex pendant 5-10 secondes. </li><li> Diluer 10X tampon de lyse RBC avec de l&#39;eau stérile. Annonced 1X tampon de lyse des globules rouges (5 ml par souris donneuse), vortex à nouveau pendant 5 sec et garder exactement 3 min à température ambiante. </li><li> Après 3 minutes, remplir les tubes avec 20 ml de PBS froid pour arrêter la lyse et mélanger. Verser le contenu dans une passoire cellule 40 um directement dans un nouveau tube Falcon de 50 ml. </li><li> Rincer les tubes d&#39;origine avec 5 ml de PBS et transférer à tamis cellulaire ainsi. Compléter à 50 ml avec du PBS et mélanger. </li></ol> 4. Compter les cellules donneurs de moelle osseuse <ol><li> Ajouter 100 ul de bleu trypan dans un tube Eppendorf et 100 pi de suspension de moelle osseuse dans un tube Eppendorf et mélanger. Introduire à la pipette le mélange de cellules colorées à un hémocytomètre. </li><li> La quantité de cellules est calculé en nombre d&#39;os habitable totale de moelle de cellules dans des tubes Falcon = nombre de cellules non colorées en 16 carrés x 2 (en raison de bleu trypan dilution) x 10.000 x 50 ml </li><li> Centrifuger les cellules de moelle osseuse de tubes Falcon de 50 ml à 2.000 tours par minute pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant. Basésur les numérations cellulaires totales, remettre en suspension le culot dans du PBS à 1 x 10 8 cellules par ml </li></ol> 5. Infusion de souris receveuses <ol><li> Réchauffez les souris receveuses sur un pad thermique et sous une lampe chauffante. Mettez les souris receveuses dans restrainer. Injecter 1 x 10 7 cellules par souris dans 100-200 ul par voie intraveineuse. </li><li> L&#39;injection de moelle osseuse du donneur doit être effectuée entre 4-24 heures après l&#39;irradiation. </li><li> Restez à 4 souris injectées par cage. Maintenir les souris receveuses injectés dans des cages en autoclave avec de l&#39;eau traitée par les antibiotiques pour les 4 premières semaines de l&#39;animalerie exempte de pathogènes et de laisser les souris reprendre l&#39;immunité. Changement des cages, traités aux antibiotiques eau et de la nourriture tous les 4 jours pour maintenir l&#39;hygiène. </li></ol> 6. L&#39;induction de la colite et de l&#39;évaluation de la colite <ol><li> 4 semaines après la greffe de moelle osseuse et d&#39;irradiation, passer à l&#39;eau ordinaire, sans antibiotiques et maintenir la souris pour 2 semaines de plus pour reprendre leurs activités normalesflore microbienne intestinale. </li><li> 6 semaines après l&#39;injection de moelle osseuse, de mesurer le poids corporel initial. Certaines souris sont donnés 5% de sulfate de dextrane à boire l&#39;eau ad libitum pour induire la colite. Certaines souris reçoivent de l&#39;eau potable régulier seulement que les groupes de contrôle normaux. </li><li> 5 jours plus tard, retirer le sang périphérique, transfert à l&#39;héparine tubes revêtus (Vacutainer) et conserver dans la glace. Piscine du sang à partir de 4 souris à 1 tube. Mélanger 300 ul de sang avec 300 pi de tampon de coloration cellulaire = 600 pi. Diviser le sang de 5 tubes Eppendorf, chacun avec 100 pi. </li><li> Sacrifier les souris avec du dioxyde de carbone ou de l&#39;isoflurane. Évaluer les scores des dommages macroscopiques (s&#39;il vous plaît se référer à une autre publication JOVE vidéo pour plus de détails 1). Mesurer changement de poids corporel. Longueur et l&#39;épaisseur de l&#39;intestin mesure avec pied à coulisse numérique. Observez la texture des selles (dur, mou ou sanglante). Déterminer sang occulte dans les selles avec Hemooccult. Disséquer les tissus du côlon et de fixer dans le formol pour H &amp; E coloration. </li><li> Disséquer une bo fémurne par souris, extraire la moelle osseuse et rincer la moelle osseuse avec du PBS froid via une aiguille 25G et seringue de 1 ml. Moelle osseuse Poule 4 bouchons pour 1 tube et garder dans la glace. </li><li> Verser la moelle osseuse à une boîte de Pétri, la prise de cisaillement moelle osseuse avec une aiguille 18G et 5 fois la seringue jusqu&#39;à plusieurs ml sans prise de moelle osseuse est présente. </li><li> Isoler avec 1500 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension avec 600 ul de tampon de cellule coloration. Diviser la moelle osseuse remis en suspension à 5 tubes Eppendorf, chacun avec 100 pi. </li></ol> 7. Contrôle de qualité de la transplantation de moelle osseuse par cytométrie en flux <ol><li> Étiquetez chaque tubes de prélèvement de sang ou de moelle osseuse # 1-5: </li><li> Préparer le mélange d&#39;anticorps pour chaque tube respectif dans l&#39;obscurité. </li></ol> N ° 1 Aucun anticorps # 2 30 ul de contrôle isotype FITC + 30 pl PE isotype contrôle + 15 pl CD16/32 blocage # 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 pl CD16/32 blocage # 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocage # 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocage <table border="1"><tbody><tr><td> Ajouter à rien échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 1 </td></tr><tr><td> Ajouter 5 ul de mélange d&#39;anticorps n ° 2 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 2 </td></tr><tr><td> Ajouter 3 pi de mélange d&#39;anticorps n ° 3 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 3 </td></tr><tr><td> Ajouter 3 pi de mélange d&#39;anticorps n ° 4 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 4 </td></tr><tr><td> Ajouter 5 ul de N ° 5 mélange d&#39;anticorps à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 5 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Gardez à l&#39;foncée de la glace pendant 30 min. </li><li> Ajouter 2 ml de tampon de lyse 1X RBC dans chaque tube. Conserver dans l&#39;obscurité sur la glace pendant 15 min. </li><li> Centrifuger les cellules à 1500 rpm, 5 min à 4 ° C. (GH 3.8 rotor, 1500 rpm = 350 xg) Retirer le surnageant. Reprendre le culot avec 500 ul de tampon de cellule coloration dans l&#39;obscurité, puis brièvement vortex. </li&gt; <li> Vérifier la CD45.1 (représentant WT) et CD45.2 (représentant KO) dans le sang et immunocolorées échantillons de moelle osseuse par cytométrie de flux. Sélectionnez FITC pour représenter WT CD45.1 et PE pour représenter KO CD45.2. </li><li> Analyser les résultats de cytométrie en flux par le logiciel FlowJo. Calculer le rapport de FITC: PE ou PE rapport: rapport FITC pour déterminer si le génotype donneur est génotype dominant dans le sang et la moelle osseuse. </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).</li><li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis.">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette approche greffe de moelle osseuse est adapté à la recherche d&#39;immunologie de la colite, une infection, le cancer, l&#39;obésité et d&#39;autres maladies. Cette expérience greffe de moelle osseuse est nécessaire lorsque le gène d&#39;intérêt est exprimé à la fois dans la moelle osseuse dérivées et les cellules de moelle osseuse non dérivés et le gène d&#39;intérêt est soupçonnée de servir de médiateur maladie par les cellules de la population soit. Par exemple, peptide antimicrobien cathél...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Tampon de coloration cellulaire </td><td> BioLegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X tampon de lyse RBC </td><td> BioLegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC de souris isotype contrôle </td><td> BioLegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE souris isotype contrôle </td><td> BioLegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE anti-souris CD45.2 </td><td> BioLegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC anti-souris CD45.1 </td><td> BioLegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> Anti-blocage souris CD16/32 </td><td> BioLegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 um tamis cellulaire </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td&gt; MP Biomédical </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> L&#39;héparine </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (pêcheur) </td></tr><tr><td> Lysol IC </td><td> Andwin scientifique </td><td> NC9745686 (pêcheur) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> Souris restrainer </td><td> Braintree scientifique </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Irradiateur </td><td> JL Shepherd and Associates </td><td> Mark I 68A </td></tr><tr><td> Cytomètre en flux </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> Éprouvette cytomètre de flux </td><td> Faucon </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> Pied à coulisse digital </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hémoccult TIC </td><td> Beckman Coulter </td><td> G0328QW </td></tr&gt; </tbody></table>

differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation

Pour comprendre le rôle d&#39;un gène dans le développement de la colite, nous avons comparé les réponses des souris de type sauvage et sur les gènes d&#39;intérêts souris knockout déficientes à la colite. Si le gène d&#39;intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et de cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés de l&#39;hôte, mais il est possible de différencier le rôle d&#39;un gène d&#39;intérêt dans des cellules de moelle osseuse dérivées et non de la moelle osseuse des cellules dérivées de la technique de transplantation de moelle osseuse. Pour changer la moelle osseuse de cellules dérivées du génotype des souris, la moelle osseuse d&#39;origine des souris receveuses ont été détruites par l&#39;irradiation, puis remplacé par un nouvel os moelle du donneur du génotype différent. Lorsque de type sauvage moelle osseuse du donneur souris a été transplanté à des souris knock-out, nous avons pu générer des souris knock-out avec l&#39;expression du gène de type sauvage dans des cellules de moelle osseuse dérivées. Alternativement, lorsque les souris knock-out moelle osseuse du donneur a été transplanté à des souris de type sauvage bénéficiaires, souris de type sauvage sans gène d&#39;intérêt exprimantde la moelle osseuse des cellules dérivées ont été produites. Cependant, la greffe de moelle osseuse peut ne pas être 100% complet. Par conséquent, nous avons utilisé cluster de différenciation (CD) molécules (CD45.1 et CD45.2) comme marqueurs de cellules du donneur et du receveur de suivi de la proportion de cellules de moelle osseuse du donneur provenant de souris receveuses et la réussite de la greffe de moelle osseuse. Souris de type sauvage avec des souris knock-out et génotype CD45.1 avec CD45.2 génotype ont été utilisés. Après l&#39;irradiation des souris receveuses, les cellules du donneur de moelle osseuse de différents génotypes ont été infusée dans les souris receveuses. Lorsque la moelle osseuse nouvelle régénérée pour reprendre son immunité, les souris ont été provoquées par un agent chimique (sulfate de sodium dextrane, le MAS 5%) pour induire une colite. Ici, nous avons également montré la méthode pour induire une colite chez la souris et d&#39;évaluer le rôle du gène d&#39;intérêt exprimé à partir de la moelle osseuse des cellules dérivées. Si le gène d&#39;intérêt dans les cellules osseuses dérivées joue un rôle important dans le développement de la maladie (comme Escherichiatis), le phénotype des souris receveuses avec greffe de moelle osseuse peut être significativement modifiée. À la fin des expériences colite, la moelle osseuse de cellules dérivées dans le sang et la moelle osseuse ont été marquées avec des anticorps contre CD45.1 et CD45.2 et leur rapport quantitatif de l&#39;existence pourrait être utilisée pour évaluer la réussite de la greffe de moelle osseuse par cytométrie en flux. Succès de la transplantation de moelle osseuse doit montrer une grande majorité de génotype donneur (en terme de marqueur molécule CD) sur le génotype destinataire à la fois dans la moelle osseuse et le sang des souris receveuses.

Si le gène d&#39;intérêt joue un rôle important dans les cellules immunitaires au cours du développement de la colite, les souris recevant la moelle osseuse de génotype différent par greffe de moelle osseuse (WT KO ou KO à WT) devrait avoir une altération de la réponse à la colite DSS. L&#39;un des paramètres les plus importants pour déterminer la gravité de la colite est la coloration H &amp; E des tissus coliques. Changements dans la structure des tissus du côlon et des signes d&#39;inflammation peut ê...

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Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

La greffe de moelle osseuse fournit un moyen de changer le génotype des cellules de moelle osseuse dérivées. Si le gène d&#39;intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et les cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés, la greffe de moelle osseuse peut modifier les cellules de moelle osseuse provenant d&#39;un génotype différent sans modifier le génotype non-cellulaire de la moelle osseuse extraite.

Différencier les rôles fonctionnels de l&#39;expression des gènes de cellules immunitaires et non immunitaires dans l&#39;intestin de souris par greffe de moelle osseuse

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

differentiating-functional-roles-gene-expression-from-immune-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K vues.  The University of California Los Angeles, Los Angeles. La greffe de moelle osseuse fournit un moyen de changer le génotype des cellules de moelle osseuse dérivées. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et les cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés, la greffe de moelle osseuse peut modifier les cellules de moelle osseuse provenant d'un génotype différent sans modifier le génotype non-cellulaire de la moelle osseuse extraite.

Vidéo: Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolement, la purification et l&#39;étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Suivi moelle osseuse de souris monocytes<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

Plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie de greffe-contre-hôte

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Procédures de transplantation de moelle osseuse chez la souris pour étudier l’hématopoïèse clonale

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

Knock-in de gènes par CRISPR/Cas9 et tri cellulaire dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...