Les auteurs tiennent à remercier le personnel PXRR au NSLS (Brookhaven National Laboratory) pour l&#39;assistance au cours de la collecte des données et Monica Pillon de l&#39;aide pour la purification d&#39;ADN. Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé (MOP 67189).

1. Purification des protéines La séquence de liaison flexible reliant l&#39;. N-(oligomérisation) et C-terminal (liaison à l&#39;ADN) domaines de SEQA aides à la reconnaissance des répétitions hémiméthylé GATC séparées par une à trois spires de l&#39;ADN Pour cette étude, nous avons utilisé une variante de dimère de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) avec une mutation ponctuelle dans le domaine N-terminal qui empêche davantage d&#39;oligomérisation et un lieur raccourci qui limite liaison à l&#39;ADN de tandem GATC répète séparés exclusivement par une tour sur l&#39;ADN (Figure 1) 2,8. <ol><li> Transformer BL21 (DE3) par le plasmide codant pour SEQA sous le contrôle du promoteur T7, </li><li> Plaque de la réaction de transformation de LB-agar, y compris 100 ug / ml d&#39;ampicilline, </li><li> Prélever des colonies mixtes pour inoculer une culture à petite échelle pendant la nuit (milieu LB avec 100 pg / ml d&#39;ampicilline), </li><li> Le lendemain matin, inoculer une L 1 du multimédia en utilisant une dilution 1:100 de la overnight la culture, </li><li> Cultiver les cellules à une densité optique de 600 ~ 0,7 et induire la production de protéines par addition d&#39;isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM, </li><li> Continuer l&#39;incubation pendant 3 heures à 37 ° C sous agitation orbitale, puis récolter les cellules par centrifugation (10 min à 3300 g), </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de lyse A et purification par sonication, </li><li> Effacer le lysat par centrifugation (40 min à 39000 g) et de charger le surnageant sur une colonne d&#39;héparine équilibrée avec le tampon de purification, </li><li> Éluer SEQA utilisant un gradient linéaire de NaCl 1 M (SEQA élue à ~ NaCl 0,7 M), </li><li> Mettre en commun les fractions contenant de l&#39;ensemble SEQA, diluer à réduire la force ionique de l&#39;échantillon et de la charge dans une colonne de chromatographie échangeuse de cations équilibrée avec un tampon de purification, </li><li> En utilisant un gradient linéaire de sel, pur élue à SEQA ~ NaCl 0,4 M, </li><li> Mettre en commun les fractions contenant SEQA ensemble, concene (3 mg / ml) dans un tampon et un magasin de stockage. </li></ol> 2. Purification d&#39;ADN <ol><li> Commande complémentaires oligonucléotides non méthylés et méthylés de votre société préférée, </li><li> Dissoudre 1 pmol de chaque ADN simple brin lyophilisée dans 800 ul de autoclavé ddH O 2, vortex et laisser reposer pendant 10-20 min, </li><li> Ajouter 800 ul de tampon de charge 2X préchauffé à chaque oligonucléotide, </li><li> Pour oligonucléotides longs nucléotides 20-30, préparer un grand gel dénaturant 10% (160 x 250 x 1 mm): * Bien mélanger 80 ml de mélange PAGE 10%, 80 TEMED ul et 800 ul par le persulfate d&#39;ammonium gel et verser, * Une fois polymérisé, enlever le peigne et rincer les puits avec fond ddH 2 O, * Monter les gels sur gel de fonte y compris la plaque de refroidissement et ensuite remplir les réservoirs supérieur et inférieur avec tampon de migration (1X TBE), * Pré-exécuter le gel à 700-750 V pour réchauffer le gel jusqu&#39;à 55 ° C, * Arrêter la course et rincer le puits thoroughly avec tampon. </li><li> Chauffer les oligonucléotides à 90 ° C pendant 2 min, </li><li> Vortex et faire tourner les échantillons et immédiatement avant le chargement du gel, </li><li> Exécutez le gel à ~ 700 V et l&#39;arrêter une fois que votre oligonucléotide a migré à mi-chemin. (Notez que sur un gel de polyacrylamide 10% de bleu de bromophénol co-migre avec des oligonucléotides ~ 20 bases de long et le xylène cyanol FF avec ~ 60 bases de long), </li><li> Arrêter le gel, démonter la boîte de gel et retirez les cales, </li><li> Sur une surface plane, retirer une plaque de verre et couvrir le gel avec une pellicule de plastique, </li><li> Tournez le gel autour, retirez la plaque de verre et couvrir d&#39;une pellicule plastique, </li><li> Marquez les bandes en utilisant la lumière UV et une plaque fluorescente derrière le gel de voir l&#39;ombre d&#39;ADN, </li><li> Couper la bande avec une lame de rasoir en petits morceaux et de les transférer dans un tube de 15 ml stérile, </li><li> Ajouter 9 ml de tampon d&#39;élution et éluer une nuit à 37 ° C sous agitation, </li><li> Transférer délicatement la solutionà un tube à centrifuger autoclave à l&#39;aide d&#39;une pipette de gel de chargement pour éviter le transfert de pièces d&#39;acrylamide et ajouter 1 ml d&#39;acétate de sodium 3 M à pH 7 (dilution 1:10) plus 25 ml d&#39;éthanol à 100% réfrigérés (2,5 volumes), </li><li> Incuber à -20 ° C pendant au moins 3 heures, </li><li> Isoler et transférer le surnageant dans un tube séparé, </li><li> Sécher le culot sur le speed-vac à feu moyen, </li><li> Reprendre le culot dans 400 ul de autoclavé ddH 2 O et transférer dans un nouveau tube, </li><li> Ajouter 40 ul d&#39;acétate de sodium 3 M à pH 7 et 1 ml d&#39;éthanol à 100% et bien mélanger (vortex) et incuber 30 min à température ambiante, puis 30 min à -20 ° C, </li><li> Faites tourner pendant 15 min à 18000 g et jeter le surnageant, </li><li> Rincer le culot avec 100 ul d&#39;éthanol froid à 70% pour éliminer le sel résiduel à partir du culot et de spin pendant 6 min à 18000 g. Jeter l&#39;éthanol et sécher le culot de speed-vac, </li><li> Reprendre le culot dans un total de 100 ul de autoclavé ddH <sub&gt; 2 O. Mesurer la concentration de l&#39;oligonucléotide, </li><li> Pour recuire les duplexes d&#39;ADN hémiméthylé, mélanger concentrations équimolaires des simples brins complémentaires et chauffer les mélanges à 95 ° C dans un bain-marie pendant 5 min, puis les laisser refroidir lentement à température ambiante à l&#39;intérieur du bain-marie. </li></ol> 3. Formation protéine-ADN et des analyses complexes <ol><li> Mélanger des volumes égaux d&#39;purifié SeqAΔ (41-59)-A25 (81 uM) et de l&#39;ADN hémiméthylé (81 uM), </li><li> Incuber à température ambiante pendant 15 min et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que vous soyez prêt à l&#39;utiliser, </li><li> Écran pour des conditions de cristallisation en utilisant commerciales clairsemée écrans à matrice, </li><li> Une fois fils de cristallisation initiales ont été identifiés, d&#39;optimiser les conditions de croissance des cristaux de qualité de diffraction, </li><li> Cryoprotect les SEQA à ADN résultant cristaux, soit en augmentant la quantité de PEG 400 présent dans la solution de cristallisation à une concentration finale de 25% (v / v) ou l&#39;ajout de glycérol 20% (v / v) de la solution de cristallisation, </li><li> Scoop cristaux individuels avec une boucle en nylon, et les flash-congeler dans l&#39;azote liquide, </li><li> Testez la limite de diffraction de chaque cristal à 100 K. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Pour obtenir la structure cristalline de SeqAΔ (41-59)-A25R lié à l&#39;ADN hémiméthylé, nous consécutivement trois paramètres optimisés sur l&#39;ADN: (i) la séparation entre les séquences GATC hémiméthylé, (ii) la longueur du duplex, et (iii) l&#39; absence / présence de 5 &#39;surplombs. Tests de modification de l&#39;électro-mobilité indiquent que SeqAΔ (41-59)-A25R se lie préférentiellement répète GATC séparés par 10.9 paires de bases (Figure 1). Par conséquent, nous avons d&#39;abord projeté duplex 23-24 paires de bases (pb) de long contenant deux séquences GATC hémiméthylé séparés par soit 9 ou 10 points de base. Trois duplex a donné des cristaux belle forme (figure 2). Alsi aucun des cristaux diffractés à haute résolution, le 23 bps en duplex de long avec les deux sites GATC séparés de 9 points de base diffractée des rayons X mieux que le reste, ce qui indique que la séparation GATC de 9 points de base a été préféré pour la cristallisation. Par conséquent, nous avons fixé la distance inter-GATC à 9 points de base pour tous les écrans suivants. Généralement, la cristallisation est favorisée ADN duplex pour des longueurs exactes correspondant aux spires hélicoïdales, car plusieurs molécules d&#39;ADN peut empiler tête-à-queue pour former un ADN-B continue dans le cristal 9. Par conséquent, nous avons réduit la longueur totale des duplex de 21 points de base (soit deux spires hélicoïdales). Alors un duplex avec 21 points de base des extrémités franches n&#39;ont pas donné des cristaux de qualité de diffraction (données non présentées), un duplex 21 points de base avec une seule extrémité protubérante 5 &#39;nucléotides à chaque extrémité ne donner des cristaux qui diffractée à 5 Å dans notre source d&#39;origine. L&#39;amélioration de la limite de diffraction suggéré que duplex de bout-en-bout association a été en effet favorisertion de cristaux d&#39;emballage. Depuis SEQA interagit avec des séquences GATC qui sont sur la même face de l&#39;ADN, la face opposée de la double hélice d&#39;ADN doit être exposés au solvant. Pour améliorer encore les cristaux du complexe, on a alors modifié la séquence du duplex d&#39;inclure un dinucléotide CG entre les deux sites GATC-gorge, de promouvoir squelette interactions avec les molécules d&#39;ADN adjacentes dans le cristal par la face opposée du duplex, un procédé qui a été utilisé pour améliorer la cristallisation de l&#39;ADN dans des 10 dernières années. Cependant, la limite de diffraction des cristaux cultivés avec le duplex contenant CG était identique à celles qui sont cultivées avec un duplex d&#39;ADN similaire qui ne contient pas le dinucléotide CG (figure 3). Ce résultat indique que la rainure cœur de réseau interactions ne sont pas importants dans ce cas. Nous avons ensuite optimisé la longueur des surplombs en comparant les cristaux obtenus avec un duplex d&#39;ADN qui ont deux nucléotides supplémentaires à chaqueL&#39;extrémité 5 &#39;. Ce changement a eu un effet drastique sur la morphologie des cristaux, ainsi que, la limite de diffraction, indiquant que le nucléotide supplémentaire a radicalement changé les contacts et l&#39;organisation moléculaire cristaux améliorée (figure 3). La structure cristalline de SeqAΔ (41-59)-A25R lié à cette dernière duplex d&#39;ADN a confirmé que la face libre de la double hélice d&#39;ADN ne peut avoir de contact cristal, comme prévu par l&#39;effet limité de l&#39;introduction d&#39;un dinucléotide CG-. En dépit de la taille relative des protéines et de l&#39;ADN, la plupart des interactions entre compagnons de symétrie sont médiés par des interactions protéine-protéine et protéine-ADN (figure 4). Il est intéressant, dans ce cas particulier, l&#39;effet bénéfique de faux dinucléotide 5 &#39;n&#39;est pas due à la formation d&#39;un ADN pseudo-continue. Au lieu de cela, l&#39;extrémité 5 &#39;du brin dénaturé les projets à l&#39;écart des axes d&#39;ADN et interagit avec la molécule SEQA proximale du complexe, ce qui explique pourquoi deux nucléotides w<html> ere strictement nécessaire pour changer le cristal d&#39;emballage 8,11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" /> Figure 1. La liaison de SeqAΔ (41-59)-A25R à l&#39;ADN hémiméthylé. (A) Représentation schématique des domaines de SEQA que oligomérisation des protéines médiate et liaison à l&#39;ADN. (B) analyse électrophorétique de décalage de mobilité des SeqAΔ (41-59)-A25R avec des ADN contenant deux séquences GATC hémiméthylé séparés par un nombre croissant de paires de bases ( X). La voie la plus à gauche (marqué Blank) contient un mélange équimolaire d&#39;ADN avec 5, 7, 12, 21, 25 et 34 paires de bases entre les deux séquences GATC en l&#39;absence de SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) Diagramme montrant les trois variables optimisées sur les duplexes d&#39;ADN pour obtenir des cristaux de qualité de diffraction. upload/4266/4266fig2.jpg &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Effet de la variation inter-GATC distance. Résumé des oligonucléotides utilisés et les cristaux obtenus avec duplex pb contenant deux longues 23-24 hémiméthylé sites GATC séparés par 9 ou 10 paires de bases. Toutes les photos de cristaux ont été prises au même grossissement et la barre d&#39;échelle indique 100 um. La limite de résolution de chaque SeqAΔ (41-59)-A25R-ADN cristal est basée sur des images de diffraction collectées sur une Rigaku RU-300 système générateur de rayons X. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" /> Figure 3. Effet de la variation de l&#39;ADN se termine. Résumé de til oligonucléotides utilisés et les cristaux obtenus avec 21 pb de long duplex contenant deux sites GATC hémiméthylé séparés par 9 paires de bases et comprenant 0, 1 ou 2 nucléotides surplombe extrémité 5 &#39;. Toutes les photos de cristaux ont été prises au même grossissement et la barre d&#39;échelle indique 100 um. La limite de résolution de chaque SeqAΔ (41-59)-A25R-ADN cristal est basée sur des images de diffraction recueillies à X12C lignes de lumière et X29 (NSLS, BNL). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" /> Figure 4. Emballage cristal de SeqAΔ (41-59)-A25R lié à l&#39;ADN avec le surplomb dinucléotide: Vue du haut (A) et le côté (B). L&#39;unité asymétrique contient deux SeqAΔ (41-59)-A25R-ADN où la protéine est représentée en gris tandis que l&#39;ADN est représenté en orange. Symmetry liée SeqAΔ (41-59)-A25R-molécules d&#39;ADN sont représentées en blanc pour la protéine et jaune pour l&#39;ADN. Ce chiffre a été préparé en utilisant PyMOL 12. Ce chiffre est lié à Film 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Film 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> .

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Un des plus grands défis dans macromoléculaire cristallographie aux rayons X est d&#39;obtenir des cristaux de qualité de diffraction. Dans le cas des complexes de protéines ou de protéines-ADN, ce défi est exacerbée en raison des variables supplémentaires qui doivent être optimisés. Il est largement admis que la longueur de l&#39;ADN et la présence de surplombs collantes pour renforcer l&#39;association de molécules d&#39;ADN voisines dans un pseudo-duplex plus sont les principaux paramètres à optimiser. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (TNT) </td><td> Bio Basic Inc </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Urée </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Bis 29:1 / acrylamide </td><td> Bio Basic Inc </td><td> A0007-500ml </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> L&#39;acide borique </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylène cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bleu de bromophénol </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Système double réglable Gel verticale </td><td> CBC Scientific Company Inc </td><td> SGAD-250 </td><td></td></tr><tr><td> Indice de cristallisation écran </td><td> Hampton Research </td><td> HR2-144 </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Écran de l&#39;assistant cristallisation je </td><td> Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Écran de l&#39;assistant cristallisation II </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Écran cristallisation Classics </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Plateaux Intelliplate </td><td> Art Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solutions Tampon de purification de protéines: 100 mM Tris pH 8, EDTA 2 mM, DTT 2 mM et glycérol 5%. Tampon de stockage Protéines: 20 mM Tris pH 8, NaCl 150 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,5 mM et glycérol à 5%. Mélange chargement de gel: Ajouter 20 g de saccharose, 25 mg de bleu de bromophénol, 25 mg de xylène cyanol FF, 1 ml de 10% p / v de SDS et 10 ml de TBE 10X à 70 ml d&#39;autoclave ddH O. 2 Remuer avec un chauffage doux jusqu&#39;à ce que le saccharose est dissous et ajuster la finalevolume à 100 ml avec de l&#39;autoclave ddH O. 2 Stocker à 4 ° C. Tampon de charge 2X: Ajouter 11 g d&#39;urée à 10 ml de mélange de chargement de gel. Incorporer sur une plaque chauffante jusqu&#39;à ce que l&#39;urée se dissout. Aliquoter en tubes de 2 ml et conserver à 4 ° C. PAGE 10X mélange: Mélanger 420,4 g d&#39;urée, 100 ml de TBE 10X (autoclave), 250 ml de 40% 29:1 Bis / acrylamide dans les ddH 2 O. Remuer jusqu&#39;à ce que complètement dissous et ajuster le volume à 1 litre. Stocker dans des bouteilles foncées à 4 ° C. TBE 10X: Dissoudre 108 g de TRIS, 55 g d&#39;acide borique et 9,3 g d&#39;EDTA à 1 litre de ddH 2 O. Autoclave et conserver à température ambiante. Tampon d&#39;élution: Diluer 8 ml de NaCl 5 M, 2 ml de 1 M pH TRIS 7,5, 0,4 ml d&#39;EDTA 0,5 M pH 8 sur 200 ml de ddH 2 O. Autoclave et conserver à température ambiante. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SEQA est un régulateur négatif de la réplication de l&#39;ADN qui empêche prématurés événements réinitiation par séquestrants hémiméthylé grappes GATC au sein de l&#39;origine de réplication 1. Au-delà de l&#39;origine, SEQA se trouve à la fourche de réplication, où il organise l&#39;ADN nouvellement répliqué par une augmentation des structures ordonnées 2. SEQA que faiblement associés avec des séquences GATC simples, mais il forme des complexes de haute affinité avec les duplexes d&#39;ADN contenant plusieurs sites GATC. L&#39;unité minimale fonctionnelle et structurelle de SEQA est un dimère, ce qui explique l&#39;exigence d&#39;au moins deux séquences GATC pour former un complexe de haute affinité avec l&#39;ADN hémiméthylé 3. En outre, l&#39;architecture SEQA, avec l&#39;oligomérisation et de liaison d&#39;ADN domaines séparés par un lieur flexible, permet la liaison de répétitions GATC séparés par jusqu&#39;à trois spires hélicoïdales. Par conséquent, la compréhension de la fonction de SEQA au niveau moléculaire nécessite la structure analyse des SEQA lié à de multiples séquences GATC. En protéine-ADN cristallisation, l&#39;ADN peut n&#39;en ai pas à un effet exceptionnel sur les interactions d&#39;emballage en fonction de la taille relative et l&#39;architecture de la protéine et l&#39;ADN. Si la protéine est plus grande que la plupart des empreintes d&#39;ADN ou de l&#39;ADN, l&#39;empilement cristallin est principalement médié par interactions protéine-protéine. A l&#39;inverse, lorsque la protéine est de la même taille ou plus petite que l&#39;ADN ou ne couvre qu&#39;une fraction de l&#39;interaction ADN, ADN-ADN et l&#39;ADN-protéine dominer empilement cristallin. Par conséquent, la cristallisation de complexes protéine-ADN nécessite le dépistage systématique de longueur 4 de l&#39;ADN et l&#39;ADN (extrémités émoussées ou faux) 5-7. Dans ce rapport, nous décrivons comment concevoir, optimiser, de purifier et cristalliser duplex d&#39;ADN contenant des répétitions en tandem hémiméthylé GATC dans un complexe avec une variante dimère de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) pour obtenir des cristaux appropriés pour déterminer la structure.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Structure cristalline des complexes protéine-ADN peuvent donner une idée fonction de la protéine, mécanisme, ainsi que la nature de l&#39;interaction spécifique. Nous rapportons ici comment optimiser la durée, la séquence et extrémités de l&#39;ADN double brin pour la co-cristallisation avec<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SEQA, un régulateur négatif de l&#39;initiation de la réplication.

Itératif d&#39;optimisation des duplex d&#39;ADN pour la cristallisation des complexes ADN-SEQA

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

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Biology

9.9K vues.  McMaster University. Structure cristalline des complexes protéine-ADN peuvent donner une idée fonction de la protéine, mécanisme, ainsi que la nature de l'interaction spécifique. Nous rapportons ici comment optimiser la durée, la séquence et extrémités de l'ADN double brin pour la co-cristallisation avec Escherichia coli SEQA, un régulateur négatif de l'initiation de la réplication.

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Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Recherche

Biologie

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Production et purification des droits de INO80 remodelage de la chromatine Complexes et Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...