Cette méthodologie de dosage constitue une avancée majeure dans la connaissance de l’immunité cellulaire contre le paludisme au stade sanguin, aidant à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques et à accélérer les progrès du vaccin antipaludique. La mise en place d’un test in vitro sur plasmodium pouvant être utilisé pour des échantillons humains ou animaux est précieuse pour mieux comprendre la pathogenèse du paludisme. L’immunité protectrice contre le paludisme n’est pas complètement comprise.
Pour le développement de nouvelles thérapies, il est essentiel d’explorer les mécanismes de l’immunité cellulaire au stade parasitaire du paludisme. Moi, Luna de Lacerda et Christopher Gomes, un étudiant de premier cycle du laboratoire de Caroline, présenterons la procédure. Pour commencer, aspirez 100 microlitres de solution d’héparine dans une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 26.
Placez la souris sur le côté et insérez perpendiculairement l’aiguille juste en dessous du coude, à travers les côtes et dans le cœur. Retirez lentement le piston de la seringue et faites pivoter l’aiguille jusqu’à ce que 0,5 à un millilitre de sang soit obtenu. Nettoyez de manière aseptique le côté gauche de la souris avec de l’éthanol à 70%.
Avec des ciseaux chirurgicaux, faites une coupe sur le côté gauche de la souris, en passant par la peau et le péritoine. Localisez la rate et retirez-la. Placez la rate de souris dans une boîte de Petri avec cinq millilitres de milieu complet pour purifier la population de cellules effectrices souhaitée.
Placez une crépine à cellules micromolaires de 100 micromolaires sur un tube conique de 50 millilitres et transférez la rate excisée dans la crépine cellulaire à l’aide d’une pince anatomique. Écraser la rate à travers la passoire avec un piston de seringue. Lavez les cellules à travers la passoire avec 10 millilitres de média complet.
Centrifuger les cellules à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés centigrades. Ensuite, jetez le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de tampon de lyse de globule rouge froide et incuber la suspension pendant cinq minutes sur de la glace.
Lavez la suspension cellulaire avec 10 millilitres de milieu complet à quatre degrés centigrades et retirez tous les caillots cellulaires entre les lavages pour la rate des souris infectées par le plasmodium. Centrifuger les cellules à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés centigrades. Ensuite, jetez le surnageant.
Placez maintenant une colonne LS ou LD dans le champ magnétique et préparez la colonne en la rinçant avec trois millilitres de tampon MACS. Ensuite, appliquez la suspension cellulaire sur la colonne. Après avoir lavé la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon MACS, recueillir le flux continu contenant les cellules spléniques.
Récoltez 10 microlitres de cellules spléniques et ajoutez 10 microlitres de bleu trypan pour vérifier la viabilité cellulaire. Ajouter les cellules à l’hémocytomètre. Compter les splénocytes dans une solution de bleu trypan et vérifier la viabilité cellulaire.
Centrifuger tous les splénocytes et jeter le surnageant. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 40 microlitres de tampon MACS. Ajouter 10 microlitres d’un cocktail d’anticorps à base de biotine aux cellules, bien mélanger et incuber pendant cinq minutes sur de la glace.
Après avoir incubé les microbilles anti-biotine sur de la glace pendant 10 minutes, placez la colonne MACS LS dans le support du champ magnétique et préparez la colonne en la rinçant avec trois millilitres de tampon MACS. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon MACS et recueillez le flux continu contenant toutes les cellules cytotoxiques non marquées.
Après avoir centrifugé le sang prélevé à 350 fois G pendant cinq minutes, jetez le sérum et remettez le sang en suspension dans un millilitre de RPMI sans FBS. Après avoir placé la colonne LS dans le support du champ magnétique, rincer avec RPMI et passer la suspension RBC à travers la colonne. Une fois que les cellules traversent la colonne, centrifugez l’écoulement, jetez le surnageant et réappliquez un millilitre de l’écoulement continu dans la colonne pour isoler plus d’iRBC.
Lavez la colonne deux fois avec cinq millilitres de RPMI. Effectuez les étapes de lavage en ajoutant des aliquotes tampons dès que le réservoir de la colonne est vide. Ajoutez cinq millilitres de RPMI, retirez la colonne et purgez les iRBC dans un nouveau tube de 15 millilitres.
Diluer un microlitre d’une solution CFSE de 10 millimolaires dans un millilitre RPMI sans FBS. Après avoir remis en suspension les globules rouges dans 500 millilitres de RPMI sans FBS, ajoutez 500 millilitres de CFSE dilué et incuber pendant huit minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Lavez les cellules trois fois avec 14 millilitres de milieu complet et centrifugez les cellules deux fois.
Pour la co-culture de lymphocytes cytotoxiques, plaquer les cellules dans une plaque à fond rond de 96 puits. Ajouter les lymphocytes purifiés et les iRBC marqués CFSE dans le rapport effecteur/cellule cible souhaité jusqu’à un volume final de 200 millilitres et homogénéiser. Préparez chaque condition en trois exemplaires et incuber les cellules à 37 degrés centigrades.
Les iRBC ont été purifiés à partir de souris infectées par P. yoelii à l’aide de colonnes LS. La purification est mise en évidence par des frottis sanguins de sang prélevé avant et après l’enrichissement de la colonne. La stratégie d’établissement de points de contrôle nécessaire pour évaluer le pourcentage de lyse des globules rouges est présentée ici.
La porte d’arrêt est placée dans la population de perles de comptage. La stratégie de contrôle commence par la sélection des cellules individuelles, à l’exclusion des débris, en fonction du rapport hauteur/surface du pic de diffusion vers l’avant, suivi de la sélection de la population de globules rouges dans Ter119+et CD8-Ensuite, sélectionnez les GRV vivants comme CFSE positifs élevés. Voici l’analyse appliquée à un exemple expérimental utilisant différents ratios effecteurs à cibles, affichant des globules rouges vivants après la co-culture.
Une représentation graphique du pourcentage de lyse des globules rouges est présentée, calculée à partir de cette formule. La signification entre les groupes utilisant CD8 cytotoxique ou CD8 naïf a été évaluée par ANOVA bidirectionnelle avec des comparaisons multiples. La méthode actuelle explore la lyse des globules rouges par contact cellulaire direct avec des cellules tueuses, et il peut être planifié de découvrir les mécanismes impliqués en utilisant des anticorps bloquants dirigés contre des récepteurs ou des molécules spécifiques.
Ce test de destruction in vitro présente une nouvelle stratégie pour clarifier les mécanismes de l’immunité à médiation cellulaire contre le paludisme au stade sanguin, ce qui contribuera à la progression de nouveaux traitements et vaccins contre le paludisme.
