Nous tenons à remercier Donald Prêt et Kevin Moïse pour l&#39;enseignement de JPK la procédure imaginal d&#39;origine disque de dissection. Nous remercions également Bonnie Weasner pour le disque génitales dans la figure 1B et le disque de l&#39;œil à la figure 2A, Brandon Weasner de la figure 3, le Stock Center Bloomington drosophile pour les taches de mouches et le Developmental Studies Hybridoma Banque des anticorps. CMS a été soutenue par une bourse de la National Institutes of Health (NIH) GCMS subvention de formation (T32-GM007757), Frank W. Putnam bourses de recherche et bourses de recherche Robert Briggs. JPK est soutenu par une subvention de la National Eye Institute (R01 EY014863)

1 Préparation de larves <ol><li> Remplissez une boîte de 35 mm de Pétri avec un tampon de dissection. </li><li> Placez les larves en boîte de Petri et leur permettre de nager pendant quelques minutes (étape d&#39;auto-nettoyage). </li><li> Transférer les larves à un pool de mémoire tampon de dissection sur une plaque de dissection à base de silicone. Cette piscine doit être à un bord de la plaque. La plaque de dissection se compose d&#39;une solution de silicone qui a été coulé et durci dans une boîte de Pétri en verre. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un pasteur-pipette, placer un plus grand bassin de tampon de dissection au milieu de la plaque de dissection. </li><li> Utilisation # 5 pinces, transférer une seule larve nettoyé depuis la petite piscine de la plus grande piscine de tampon de dissection. </li></ol> 2 gros Dissection de larves <ol><li> Alors que la larve est toujours dans la grande piscine de tampon de dissection serrer la larve avec la pince. Une paire de pinces doit être utilisé pour saisir les crochets de la bouche tandis que l&#39;autre paire de pinces est utilisé pour maintenir la animal encore (saisir la larve doucement à un tiers la longueur du corps). </li><li> Hold Steady la paire de pinces contenant la cuticule près de la bouche des crochets tout en tirant rapidement le reste du corps à l&#39;écart avec la deuxième paire de pinces. </li><li> Lorsque la larve commence à se déchirer, vous vous sentirez un léger dégagement de la tension. Relâchez la larve de la pince et de permettre les &quot;entrailles&quot; de la larve à déborder. Cela permet aux disques imaginaux de rester dans leur conformation normale et les empêche de se déformer. </li><li> Avec une paire de pinces saisir les crochets buccaux à nouveau pour tenir l&#39;extrémité avant de la larve en place. Utilisation de l&#39;autre paire de pinces enlever la partie inférieure de 3.2 larves dont le cran interne. Remarque: un complexe contenant les crochets de la bouche, les disques de l&#39;oeil-antennaire, hémisphères du cerveau, ganglion ventral, les glandes salivaires, des disques de la jambe, et la cuticule recouvrant resteront. </li><li> Avec une paire de pinces retirez délicatement la cuticule recouvrant, les glandes salivaires, les disques de la jambe etd&#39;autres tissus. Remarque: seul tissu qui devraient rester sont les crochets de la bouche, des disques d&#39;oeil-antennaire, hémisphères du cerveau, et ganglion ventral (Figure 3). </li><li> Répétez les étapes 2.1-2.5 avec des larves supplémentaire pour 15-20 min. Remarque: les disques imaginaux qui restent dans le tampon de dissection pour des périodes plus longues ont tendance à se dégrader et, finalement, apparaissent comme moins de spécimens parfaits pour être photographiés. Ainsi, après un maximum de 20 minutes tous les tissus disséqués devraient être transférés au fixateur de PLP (voir ci-dessous). </li></ol> 3. fixation et coloration des tissus avec des anticorps <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un Pipetman P-200, transférer les tissus disséqués à un verre de montre contenant froid Paraformaldéhyde-lysine-Periodate (PLP) fixateur. volume de limite de tampon de dissection transféré à 50 pi de minimiser la dilution de PLP. Veillez à couper la pointe d&#39;une lame de rasoir de sorte que l&#39;ouverture de la pointe est assez grand pour accueillir les tissus disséqués. En utilisant une paire de pinces ouune aiguille de tungstène veiller à ce que les tissus disséqués sont complètement immergés dans l&#39;ordre pour la fixation correcte de se produire. Incuber les tissus disséqués dans fixateur de PLP froid pendant 45 min. Cette incubation peut avoir lieu à température ambiante sans agitation. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un Pipetman P-200, transférer les tissus disséqués pour le tampon de lavage (RT) en utilisant une autre astuce jaune coupé pendant 45 min. Limiter le volume de transfert de PLP à 50 ul de réduire au minimum la dilution de la solution de lavage. Remarque: tous les tissus disséqués doivent être complètement immergés. </li><li> Transfert 20-30 ensembles de tissus disséqués à 1,5 ml tube de centrifugeuse. Remarque: si un plus grand nombre de complexes de disque eye-antennaire sont combinés à l&#39;intérieur du tube, il est possible que le tissu au niveau du fond du tube n&#39;est pas correctement exposée aux anticorps. Pour des résultats optimaux pas plus de 20-30 complexes de disque eye-antennaire doivent être présents dans un seul tube. Le tissu disséqué se déposent au fond du tube de centrifugeuse. Étapes conséquent, dans la suite uSE Pipetman pour retirer et remplacer le tampon de lavage, la solution de blocage, et des anticorps. </li><li> Retirer le tampon de lavage et le remplacer par 100 ul de solution de blocage: 10% de sérum de chèvre normal dans du tampon de lavage. Incuber à température ambiante avec une légère rotation sur une partie supérieure de la coiffe de table pendant 10 minutes. </li><li> Retirer la solution de blocage et le remplacer avec 100 ul d&#39;anticorps primaires qui ont été dilués de manière appropriée dans 10% de sérum de chèvre normal. Incuber à température ambiante avec une légère rotation pendant 16 heures. </li><li> Retirer les anticorps primaires et les remplacer par 750 ul de tampon de lavage. Placer les tubes dans un nutator et permettre à nutation à température ambiante pendant 10 min. Remarque: L&#39;anticorps primaire peut être sauvé (conserver à 4 ° C) et réutilisé plus tard. Réutilisation des anticorps à plusieurs reprises peut aider à réduire la liaison non spécifique. </li><li> Permettre aux têtes de se déposer au fond du tube, puis retirer le tampon de lavage et ajoute 100 ul d&#39;anticorps secondaire qui ont été dilués de manière appropriée dans 10% de sérum normal. Incuber à température ambiante avec une légère rotation pour 2̵1; 4 h. </li><li> Retirer solutions d&#39;anticorps secondaires à partir de tissu et le remplacer par 500 ul de tampon de lavage. Laisser tissu à reposer au fond du tube. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un P-200 et une pointe jaune de coupe, de transférer tous les tissus disséqués à un pool de tampon de lavage qui a été placé sur le plat de dissection. Tout en procédant à la prochaine étape de dissection fine, le tissu sera incuber dans le tampon de lavage. Cela aide à éliminer les anticorps secondaires excédentaires. </li></ol> 4. dissection fine de Eye-antennaire disque Complexes et montage sur Diapositives <ol><li> Utilisez une paire de pinces pour serrer la cuticule par les crochets buccaux avec la face ventrale du complexe vers le bas. Avec une deuxième paire de pinces enlever les deux lobes du cerveau par la fermeture des pinces dans le deuxième espace entre les disques de l&#39;oeil et le cerveau (figure 3, la flèche rouge) et en tirant rapidement le cerveau à l&#39;écart des crochets de la bouche. </li><li> Tout en continuant à garder les crochets buccaux, pincezle tissu le plus proche possible de la connexion entre la section du disque antennaire eye-antennaire et les crochets de la bouche (figure 3, flèche bleue). Note: les complexes de disque eye-antennaire devraient être libres de tous les tissus (figure 1A). Continuez jusqu&#39;à ce que tous les tissus désiré désiré qui peut être placé sur des lames a été disséqué. Ce protocole peut être adapté pour isoler aile, haltère, la jambe et les disques imaginaux génitales (figure 1B-E). </li><li> Ajouter deux petits morceaux de papier de soie (taille des lamelles) environ 3. Part sur le plat de dissection. Placez une lame de verre sur le plat - les deux morceaux de papier de soie doivent être sous les extrémités de la lame. Cela permettra d&#39;éviter le tiroir de coller à la base de silicone de la coupelle de dissection. </li><li> Utilisation d&#39;un P-20 avec une extrémité non coupée, 9 ul d&#39;ajouter un agent anti-blanchiment au milieu de la lame de microscope en verre. Cela empêche le blanchiment des tissus lorsqu&#39;on la visionne à fluorescentlumière. </li><li> En utilisant la même pointe uncut, rassembler tous les disques de l&#39;oeil-antennaire et les ajouter à la goutte de réactif anti-blanchiment. Minimiser la quantité de tampon de lavage qui est reporté. Essayer de limiter la quantité de tampon de lavage à 10 ul ou moins. </li><li> Utilisez une paire de pinces pour séparer et étaler les disques de l&#39;oeil-antennaire dans la goutte de réactif anti-blanchiment. Laisser les disques à incuber dans un réactif anti-blanchiment pendant plusieurs minutes. Remarque: les disques se tournent clairement que le tissu absorbe le réactif anti-blanchiment. </li><li> L&#39;aide d&#39;un pinceau fin abaissez doucement une lamelle sur l&#39;échantillon. Ceci permet d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air. </li><li> Magasin glisse à -20 ° C jusqu&#39;au moment de voir les disques imaginaux yeux des antennes ou autres en utilisant la lumière ou la microscopie à fluorescence. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Bien que cette procédure ait surtout porté sur l&#39;isolement et le traitement ultérieur des disques eye-antennaire, il est susceptible d&#39;être utilisé pour isoler et analyser l&#39;aile, haltère, la jambe et les disques génitales (figure 4). La seule modification nécessaire du protocole pour isoler ces disques (par opposition au disque eye-antennaire) est la méthode de dissection grossière (de l&#39;article 2 du protocole). La première branche (T1) thoracique paire se trouve à la partie...

Depuis plus d&#39;un siècle, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été un principal système pour étudier le développement, le comportement et la physiologie. Développement de la mouche peut être divisé en deux grandes étapes: embryonnaires et post-embryonnaires avec beaucoup de celle-ci ayant lieu au sein de l&#39;épithélium monocouche appelés disques imaginaux 1-3. Dessins de disques imaginaux ont d&#39;abord été publiés en 1864 par Août Weismann dans le cadre de son vaste monographie sur le développement des insectes 1. Ces disques commencent leur développement au cours de l&#39;embryogenèse, sont motifs pendant les stades larvaires, survivre à la histolyse massive des pupes début, et finalement donner lieu à un pourcentage élevé de structures adultes que l&#39;on trouve au sein de la mouche adulte 1-14. Au cours du développement larvaire chaque disque fait plusieurs décisions importantes concernant le destin, la forme et la taille. Dans les premier et deuxième stades larvaires, les disques sont chargés de l&#39;adoption d&#39;un sort primaire, establishing limites du compartiment, l&#39;adoption de la forme correcte et générer le nombre requis de cellules 15-16. Au cours du troisième stade larvaire et au début du stade pré-pupe, les disques imaginaux continuent à se diviser et sont modelées comme des cellules adoptent leurs destins terminaux 16. Au cours de l&#39;histoire des débuts de la biologie du développement chez la drosophile, les disques imaginaux ont été étudiés presque exclusivement dans le contexte du développement normal et dans les cas limités où une perte ou un mutant gain de fonction était viable. L&#39;utilisation des rayons X pour induire une recombinaison mitotique permis de mutations létales à analyser dans des clones de cellules dans les tissus de larves et d&#39;adultes. Cette méthode a été améliorée par l&#39;introduction de méthodes transgéniques pour analyser la perte et gain de fonction des mutations dans deux tissus larvaires et adultes. Le nombre d&#39;anticorps, les journalistes de la transcription et les pièges de protéines pour décrire le paysage moléculaire de type sauvage et mutantes tissus est également constde plus en plus antly. L&#39;utilisation de ces marqueurs moléculaires pour analyser la perte et gain de fonction des clones de cellules mutantes a fait de plus en plus possible d&#39;acquérir une compréhension en temps réel de la façon dont les cellules mutantes s&#39;écartent de leurs cousins ​​de type sauvage au cours du développement. Pour bien prendre avantage de ces outils et des réactifs, il est essentiel d&#39;avoir des préparations de disques imaginaux qui peut être consulté, photographiés et analysés haute qualité. Le but de ce manuscrit est de fournir un protocole optimisé pour l&#39;isolement et la préparation du complexe de disque eye-antennaire (Figure 1A). Il peut également être utilisé avec succès pour isoler une grande variété de disques supplémentaires, y compris celles qui donnent lieu à des ailes, des haltères, des jambes T1-T3 et les organes génitaux (figure 1B-E). Ce procédé, avec des modifications mineures, a été utilisée pour isoler les disques imaginaux de la drosophile pendant près de 80 années. Comme décrit ci-dessus, étant donné que la plupart des gènes sont exprimés au cours de multiple stades de développement et dans une multitude de tissus, il est souvent impossible d&#39;étudier les effets que les mutants nuls ont sur l&#39;ensemble de l&#39;œil que l&#39;animal meurt bien avant le stade larvaire troisième stade larvaire. Quatre méthodes ont fait l&#39;étude des tissus plus avancés tels que la rétine beaucoup plus docile. Le premier est le procédé flippase (FLP) / flippase recombinaison cible (FRT) de générer des clones de cellules mutantes dans un tissu de type sauvage 17-19 autrement. Dans ce cas, le tissu mutant est identifié par l&#39;absence d&#39;un repère visuel tel que la protéine fluorescente verte (GFP) et peut être comparé au tissu environnant de type sauvage dans lequel la GFP est présente (figure 2D). La seconde est la méthode &quot;flp-out&quot; dans laquelle un transgène est exprimé dans une population de cellules 20. Dans ce cas, les clones de cellules sont identifiés par la présence de GFP et par rapport au tissu environnant de type sauvage qui n&#39;a pas le rapporteur GFP (Figure2E). Le troisième est l&#39;analyse Mosaïque avec une technique répressible marqueur cellulaire (marcm), qui combine des éléments du clone mutant FLP / FRT et systèmes d&#39;expression flp-out 21. Avec cette méthode, un transgène peut être exprimé dans une population de cellules qui sont à la fois pour un mutant locus génétique particulier. Comme les clones de flp-out, marcm clones sont identifiés par la présence de GFP et comparés au tissu de type sauvage environnante qui n&#39;a pas le marqueur GFP (Figure 2F). Et enfin, les gènes et les constructions ARNi peuvent être exprimés dans les tissus imaginaux sous le contrôle des constructions spécifiques promoteur GAL4. Ces quatre méthodes ont accru l&#39;intérêt dans l&#39;étude des disques imaginaux depuis clones mutants ou des motifs ou sur-expression peuvent être directement comparés aux tissus adjacents de type sauvage. La méthode décrite dans cette procédure a été mise au point afin que les chercheurs qui étudient le développement post-embryonnaire des tissus adultes chez la drosophile,notamment ceux issus de disque eye-antennaire, pourront obtenir des tissus de haute qualité pour l&#39;analyse. Bien que les chercheurs individuels ont apporté de légères modifications, le noyau de cette procédure (que nous décrivons ici) est resté largement inchangé. Depuis l&#39;obtention de tissus de haute qualité est essentiel à l&#39;étude des disques imaginaux nous espérons que ce protocole écrit et la vidéo qui accompagne va servir de ressource pédagogique précieuse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:360px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Used to create base for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pryex Glass Petri Dish 150x20mm</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3160-152CO</td>
			<td>Use the cover for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5 Dissecting Forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>525</td>
			<td>Forceps must be kept very sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">9 well watch glass</td>
			<td>Vairous Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Stir Bar</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Conical Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5ml Microfuge Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clear or Dark depending upon application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge Rack</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop Rotator</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>100ul volume should not splatter at low setting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Macron Chemicals</td>
			<td>2-26555-1</td>
			<td>Serves as fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-3139</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>71636</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125221000</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-1878</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MTX1568-1</td>
			<td>Used to perforate imaginal discs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>SX0593-3</td>
			<td>Used to dissolve paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Normal Goat Serum`</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Serves as a blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seondary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Prevents bleaching of samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>48312-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Cover Slips 18x18mm</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe Tissue</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Panit Brush 000</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use to gently lower coverslip on to samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

Une partie importante du développement post-embryonnaire chez la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a lieu au sein d&#39;un ensemble de structures de sac-comme les appelés disques imaginaux. Ces disques donnent lieu à un pourcentage élevé de structures adultes qui se trouvent à l&#39;intérieur de la mouche adulte. Nous décrivons ici un protocole qui a été optimisé pour récupérer ces disques et de les préparer pour l&#39;analyse avec des anticorps, des journalistes de la transcription et les pièges de protéines. Cette procédure est plus adapté pour les tissus légers tels que les disques imaginaux, mais peut être facilement modifié pour une utilisation avec des tissus plus épais tels que le cerveau adulte et larvaire ovaire. Le protocole écrit et la vidéo qui accompagne va guider le lecteur / spectateur à travers la dissection de troisième stade larvaire, fixation de tissu, et le traitement des disques imaginaux avec des anticorps. Le protocole peut être utilisé pour disséquer les disques imaginaux de jeunes larves de premier et deuxième stade aussi. L&#39;avantage de ce protocole est qu&#39;il est relativement court et il a êtrefr optimisé pour la préservation de haute qualité du tissu disséqué. Un autre avantage est que la procédure de fixation qui est utilisé fonctionne bien avec la très grande majorité des anticorps qui reconnaissent des protéines de Drosophila. Dans notre expérience, il ya un très petit nombre d&#39;anticorps sensibles qui ne fonctionnent pas bien avec cette procédure. Dans ces situations, le remède semble être d&#39;utiliser une fixation cocktail autre tout en continuant à suivre les lignes directrices que nous avons définies pour les étapes de dissection et les incubations d&#39;anticorps.

La méthode décrite ci-dessus de manière fiable produit du matériel de haute qualité pour l&#39;analyse des sondes in situ, les journalistes de la transcription, les pièges de protéines et d&#39;anticorps. Dans la figure 1, nous affichons œil-antenne, génitales, ailes, haltère et jambes disques qui sont systématiquement récupérés avec cette méthode. Ces disques ont été traités avec un fluorophore de la phalloïdine-conjugué, qui se lie à l&#39;actine F et décrit par conséqu...

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Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.3K vues.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Vidéo: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Recherche

Biologie

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection de disques imaginaux de la 3ème Instar larves de drosophile

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophile larvaire JNM Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagerie de la migration en direct des cellules gliales dans le disque Eye drosophile Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissection de Oenocytes d&#39;adultes Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Mesure de la durée de vie en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Dissection et de montage de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupes disques yeux

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...