Nous remercions Lee Tuddenham (IBMC, Strasbourg) pour amplifier et titrant MCMV-Luc et Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) la permission d&#39;utiliser l&#39;animalerie de l&#39;Institut de virologie. Le soutien financier de l&#39;INSERM, Université de Strasbourg et l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) est reconnu. La participation initiale de Sonia Beroud et Laetitia Lelieur au cours de leur projet de master est également reconnu.

1. Préparation de la suspension virale <ol><li> Obtenir la souche Smith de MCMV exprimant la luciférase (MCMV-Luc 15) du laboratoire de Ulrich Koszninowski. Dans ce recombinant, le gène de la luciférase est insérée dans le locus du génome IE2 MCMV. </li><li> Pour amplifier MCMV-Luc, infecter une lignée murine de la moelle osseuse des cellules stromales (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) avec MCMV à différents multiplicité d&#39;infection (MOI, 0,001 à 1) 16. Pour ce faire, ajoutez le virus à des cellules cultivées dans un milieu sans sérum à 37 ° C. Après une heure, retirer le surnageant et le remplacer par du DMEM complété avec du sérum de veau foetal à 10% (FCS). Cinq jours plus tard, récolter le milieu de culture et des aliquotes de conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Titration de la suspension virale par dosage de plaque. <ol><li> Fractionner les cellules 3T3 (ATCC # CRL-1658) dans une plaque à 24 puits à 40.000 cellules / puits dans 1 ml de DMEM complété avec 10% de SVF contenant de la pénicilline (200 UI / ml) et steptomycin (200 mg / ml) Et incuber 24 heures à 37 ° C. </li><li> Préparer des dilutions en série (10 -1 à 10 -8) d&#39;une partie aliquote de MCMV suspension dans du DMEM et d&#39;infecter les cellules cibles (cellules 3T3) par 200 pl de la dilution après avoir enlevé le milieu de culture cellulaire. Incuber 1 heure à 37 ° C. Ajouter 1 ml de Haut Moyen (DMEM FCS à 3%, 2% (v / v) la gentamicine, 200 UI / ml de pénicilline, 200 mg / ml de streptomycine, 8 g / L carboxyméthylcellulose) et incuber 5 jours à 37 ° C. </li><li> Fixer les cellules en ajoutant 200 ul 10% de formaldéhyde (dilution de formaldéhyde avec de l&#39;eau doit être effectuée sous une hotte chimique pour éviter les inhalations toxiques) dans chaque puits et incuber 6 heures à température ambiante. Supprimer milieu de culture + fixateur par pipetage rupture et ajouter 200 de solution de coloration de cellules pi (1% de cristal violet (p / v) dans l&#39;éthanol à 20%). Avant utilisation, diluer 1 partie avec 9 parties d&#39;eau milli-Q. Incuber 2 min à température ambiante, laver la plaque 3-4x en le trempant dans l&#39;eau, laisser sécher et comptez le nombre de plaques avec une paire de jumelles. </li></ol></li> &lt;li&gt; Diluer MCMV-Luc dans DMEM à obtenir 50 PFU dans 50 pi et laisser sur la glace jusqu&#39;à utilisation ultérieure. Utiliser inoculum viral induit une létalité plus élevé avant que les nouveau-nés atteignent 2-3 semaines d&#39;âge. Dans notre expérience, 500 UFP induit de mortalité dans tous les nouveau-nés de 5 à 7 jours après l&#39;injection. </li></ol> 2. Injection des nouveau-nés <ol><li> Quand les nouveau-nés (de 4 à 20 heures des souris âgées) sont disponibles, de manipuler la litière et les excréments de la cage avec des gants avant de manipuler avec soin les chiots pour éviter toute contamination par des odeurs &quot;étrangers&quot; qui mettrait l&#39;accent sur la mère et induire le rejet des chiots . </li><li> Effectuer une injection intrapéritonéale en utilisant une seringue à insuline (29 G) comme indiqué sur la figure 1A. Tenez le nouveau-né avec la peau du dos. Avec face ventrale, introduire l&#39;aiguille sous la patte avant et poussez-le doucement sous la peau pour atteindre la cavité péritonéale (un peu moins de l&#39;ombilic). Nous injectons actuellement 1% de bleu de méthylène dilué dans du DPBS et surveillons la survie de pratique la technique avant d&#39;effectuer les infections virales. Comme le bleu de méthylène est clairement visible pendant le processus d&#39;injection, nous vous recommandons d&#39;effectuer cette injection de «formation» d&#39;abord pour assurer la livraison adéquate de la suspension virale dans la cavité intrapéritonéale. </li><li> Éliminer les minuscules gouttes de sang qui peuvent surgir et placer le nouveau-né de retour dans la cage. </li></ol> 3. L&#39;imagerie in vivo <ol><li> Au jour 7, traiter les nouveau-nés avec la même prudence que mentionné précédemment. Injecter par voie intrapéritonéale d&#39;un mélange d&#39;anesthésiques (4 mg / ml de kétamine, 0,8 mg / ml de xylazine) et la luciférine (0,15 mg / g de poids corporel) dans 50 pi de chaque animal. Poids moyen des animaux est de 1-2 g et la dose d&#39;anesthésiques par animal: la kétamine 40 mg, xylazine 8 pg Attendez 12-15 min jusqu&#39;à ce que la luciférine atteint son maximum d&#39;émission. Cela doit être déterminé à l&#39;avance et dépend du fournisseur luciférine et le système d&#39;imagerie utilisée. </li><li> Alors que les chiots sont anesthetiZed, les marquer pour identification future et récolter un petit morceau de tissu qui peut ensuite être utilisé pour le génotypage avenir si les animaux mutants sont utilisés. </li><li> Placer les chiots dans le système de formation d&#39;image et d&#39;effectuer l&#39;acquisition de la lumière émise par l&#39;ensemble du corps. Sept jours après l&#39;infection, le virus s&#39;est reproduit en de nombreux exemplaires dans les organes cibles tels que le foie, les reins, les poumons et les glandes salivaires, par conséquent, la durée d&#39;exposition doit être court. Dans notre cas, nous procédons à l&#39;acquisition de 10 à 20 sec (figure 1B). La plate-forme dans la chambre de l&#39;acquisition de l&#39;appareil de formation d&#39;image doit être chauffé pour éviter un refroidissement excessif de la température corporelle de l&#39;animal anesthésié. En outre, il est utile d&#39;obtenir des images à faible résolution de plusieurs animaux dans une tour d&#39;acquisition et ensuite, passer à la plate-forme près de la lentille de la caméra afin de se concentrer sur une partie d&#39;un animal ou d&#39;un organe isolé après dissection. Le logiciel doit permettre des changements rapidesdes paramètres (temps d&#39;exposition, la distance échantillon / objectif, sensibilité), la quantification des régions définies d&#39;intérêt et l&#39;avenir exportation des images instantanées. </li><li> Pour acquérir signal lumineux de la tête seulement, couvrir le corps du nouveau-né couché latéralement avec un papier noir épais qui va masquer les photons émis au niveau des organes où la réplication virale élevée se produit (foie, poumons, glandes salivaires) et effectuer acquisition pendant 5 à 10 mn (figure 1C). Effectuer l&#39;acquisition de la face opposée de l&#39;animal dans les mêmes conditions. </li><li> Réintroduire les chiots dans la cage et placer une lampe chauffante sur le dessus pour éviter un refroidissement excessif des nouveau-nés anesthésiés. Surveiller régulièrement la récupération post-anesthésique. Avec la dose indiquée, l&#39;anesthésie dure actuellement 30 min. </li><li> Répétez la même procédure les jours de 9, 11 et 14. Les jours 11 et 14, de modifier la dose d&#39;anesthésiques (6 mg / ml de kétamine, 1,2 mg / ml de xylazine). </li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals.">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li><li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research.">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li><li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo.">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li><li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+(M2-10B4).">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier compétition. Déclaration éthique Les animaux ont été maintenus dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes dans l&#39;établissement de soins des animaux de l&#39;Institut d&#39;Immunologie et d&#39;Hématologie. Manipulation des souris et des procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la loi française sur la protection des animaux de laboratoire. La procédure a été approuvée par le service vétérinaire de la Préfecture du Bas-Rhin (France) sous le numéro d&#39;autorisation A-67-345.

En utilisant la technologie d&#39;imagerie in vivo pour surveiller MCMV-Luc diffusion chez la souris nouveau-nés, nous avons pu observer la propagation du virus dans le cerveau des animaux mutants, par opposition au type sauvage. En outre dissection de l&#39;animal et de l&#39;imagerie ex vivo du cerveau a confirmé la présence du virus de luminescence dans le système nerveux central. En outre, nous avons également procédé à l&#39;immunohistochimie (non représenté) sur coupes fines ce...

Cytomégalovirus humain (HCMV/HHV-5) est un membre de la famille β-herpesvirus. HCMV est très répandue, pathogène opportuniste qui est généralement acquise en début de vie comme une infection asymptomatique 1. Comme tous les virus de l&#39;herpès, HCMV persiste pendant toute la vie de l&#39;hôte dont le système immunitaire contrôle étroitement la réplication virale. Les épisodes de réactivation virale surviennent surtout chez les personnes immunodéprimées comme les patients transplantés recevant des médicaments pour prévenir le rejet du greffon 2. Chez les adultes, HCMV a également été liée à glioblastomes 3. En outre, HCMV est un agent pathogène important pour les nouveau-nés avec une immunité immature 4-6. La primo-infection dans le développement du fœtus ou nouveau-né peut avoir de graves conséquences. HCMV infection est la cause infectieuse la plus fréquente des malformations congénitales et des troubles de l&#39;enfance dans les pays développés. On estime que l&#39;incidence de l&#39;infection néonatale HCMV affecte 0,5-1% of toutes les naissances vivantes dont 5-10% vont souffrir de symptômes sévères tels que la microcéphalie ou hypoplasie cérébelleuse. En outre, 10% des nourrissons infectés par une infection virale subclinique se développer plus tard des séquelles entraînant un retard mental, perte, défauts visuels ou de la saisie et de l&#39;épilepsie 7,8 auditive. Contrairement aux autres herpèsvirus humains tels que l&#39;herpès simplex 1 (HSV-1/HHV-1) qui peut être inoculé à des souris par différentes voies d&#39;injection 9, la réplication du cytomégalovirus est spécifique à l&#39;espèce. Cette fonctionnalité a gravement entravé les enquêtes de HCMV pathogenèse qui sont effectuées dans différents modèles animaux (souris, rat, cochon Guinée, le singe rhésus) et leurs CMV spécifiques de l&#39;hôte d&#39;origine respectifs. Tous les VMC présentent des similitudes importantes dans la taille du génome et de l&#39;organisation, le tropisme tissulaire et la régulation de l&#39;expression des gènes. Ils induisent également des pathologies similaires dans leur hôte respectif. Malgré la diversité génomique êtreentre HCMV et souris cytomégalovirus (MCMV) (50% des ORF présents dans le virus humain sont identifiés dans le CMV murin), le modèle de la souris s&#39;est récemment révélé être avantageux, surtout parce que les souches mutantes peuvent être testés pour leur capacité à contrôler virale la réplication in vivo. Cela a conduit à un crible génétique qui a permis d&#39;estimer le nombre de gènes de souris exprimés au stade adulte qui composent le &quot;résistome&quot; à ce virus 10. Au total, cela indique que les souris infectées par MCMV représentent un modèle intéressant pour l&#39;étude des interactions hôte-virus chez les adultes. L&#39;exploration de l&#39;infection congénitale à CMV est plus complexe parce que les différences dans l&#39;organisation de la couche placentaire entre l&#39;homme et la souris nuisent à la transmission mère-fœtus de l&#39;infection virale chez la souris. Récemment, l&#39;injection directe de MCMV dans le placenta à jour 12.5 de gestation a permis infection du cerveau de souris nouveau-nés qui ont conduit à la dépréciation audience 11. Cependant, la plupart investigations utilisent désormais injection intrapéritonéale de 4-20 hr-nés âgés de fournir dissémination virale systémique pouvant conduire à une infection hématogène du cerveau, un modèle qui est plus pertinent que celui d&#39;une injection intracrânienne. Ce protocole a fourni d&#39;importantes informations sur la pathogenèse CMV et plus particulièrement, il a été démontré que l&#39;infection par MCMV de nouveau-nés résultats de la réplication virale dans les cellules neuronales et gliales situées dans les foyers inflammatoires qui sont infiltrés par des cellules mononucléaires comme les macrophages 12. Ce rapport décrit également la morphogénèse altérée du cervelet accompagné d&#39;une diminution granulaire prolifération des neurones et de la migration et de l&#39;induction de plusieurs gènes d&#39;interféron-stimulés. Le rôle essentiel des cellules T CD8 + pour le contrôle de MCMV dans le système nerveux central a également été rapporté par le même groupe 13. Un aspect important à considérer lors de l&#39;analyse de l&#39;effet pathologique d&#39;un microbe est la dynamique de l&#39;infecterd&#39;ions. Dans le cas de MCMV, il est particulièrement important d&#39;explorer et de quantifier la progression de la diffusion du virus dans le cerveau en développement afin de comprendre et d&#39;anticiper l&#39;ampleur des futurs blessures neurobiologiques. Traditionnellement, la quantification de la progression d&#39;une infection nécessite le sacrifice régulier des animaux infectés de titrer l&#39;agent pathogène dans les tissus, tels que le cerveau, qui sont autrement inaccessibles. Ce type de protocole est maintenant contestée par l&#39;amélioration nécessaire du bien-être animal et les 3R (Réduire, Refine, Replace) principes 14. L&#39;utilisation des technologies d&#39;imagerie in vivo peut permettre une réduction drastique du nombre d&#39;animaux qui sont nécessaires dans des expériences d&#39;infection in vivo. Ici, nous présentons et décrivons une analyse temps-courant de la diffusion du virus dans le cerveau lors de intrapéritonéale MCMV-Luc injection pour les nouveau-nés de souris. En utilisant les mêmes animaux, nous avons suivi et surveillé in vivo les sites d&#39;intense viréplication ral au cours d&#39;une période de 2 semaines.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3523A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319112</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4897</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CentraVet</td>
			<td>Ket 201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine/Vetranal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>P0436500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>gentamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>carboxymethylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4888</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3886</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IVIS 50</td>
			<td>Caliper/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates

Cytomégalovirus humain (HCMV ou HHV-5) est un agent pathogène mortelle, chez les personnes immunodéprimées. Lors de l&#39;infection congénitale ou néonatale, le virus peut infecter et de se répliquer dans le développement du cerveau, ce qui peut induire des lésions neurologiques graves, y compris la surdité et le retard mental. En dépit de la gravité potentielle des symptômes, les options thérapeutiques sont limitées par l&#39;absence d&#39;un vaccin et l&#39;absence d&#39;un traitement antiviral spécifique. En outre, une description précise des événements moléculaires qui se produisent au cours de l&#39;infection du système nerveux central (SNC) fait encore défaut depuis observations proviennent principalement de l&#39;autopsie des enfants infectés. Plusieurs modèles animaux, comme les macaques rhésus CMV, ont été mis au point et fourni des indications importantes sur la pathogenèse CMV dans le SNC. Cependant, en dépit de sa proximité avec l&#39;évolution des humains, ce modèle a été limitée par la procédure d&#39;inoculation intracrânienne utilisé pour infecter les animaux et les inconvénientsistently induire une infection du système nerveux central. En outre, les considérations éthiques ont favorisé le développement de modèles alternatifs, parmi lesquels l&#39;infection néonatale de souriceaux nouveau-nés par le cytomégalovirus de la souris (MCMV) a récemment permis des avancées significatives. Par exemple, il a été signalé que l&#39;injection intrapéritonéale de MCMV à Balb / c nouveau-nés conduit à l&#39;infection de neurones et les cellules gliales dans des zones spécifiques du cerveau. Ces résultats suggèrent que l&#39;inoculation expérimentale de souris pourrait récapituler les déficits induits par l&#39;infection à CMV chez les enfants. Néanmoins, une analyse dynamique de l&#39;infection par MCMV des nouveau-nés est difficile à réaliser parce que la méthode classique nécessite le sacrifice d&#39;un nombre important d&#39;animaux à différents points dans le temps d&#39;analyser la charge virale et / ou les paramètres liés au système immunitaire. Pour contourner cet obstacle et permettre futures enquêtes sur les animaux mutants rares, nous avons appliqué la technologie d&#39;imagerie in vivo pour effectuer une analyse temps-courant de l&#39;viraL diffusion dans le cerveau lors de l&#39;injection périphérique d&#39;une MCMV recombinant exprimant la luciférase de C57BL / 6 nouveau-nés.

Une expérience représentative est illustrée à la figure 1. Lors de l&#39;injection intrapéritonéale de 50 PFU de MCMV-Luc (groupe A montre une injection similaire menée au bleu de méthylène pour visualiser la voie sous-cutanée de l&#39;aiguille), les nouveau-nés ont été anesthésiés et reçues simultanément 0,3 mg du substrat luciférase (Luciferin, Caliper). Quinze minutes plus tard, les animaux ont été placés face ventrale dans la chambre de l&#39;acquisition de la SIIV 50 (système ...

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Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Le cytomégalovirus (HCMV) infection humaine des nouveau-nés représentent une cause importante de déficience mentale, mais les événements moléculaires conduisant à la pathogenèse induite par le virus sont encore mal compris. Pour étudier la dynamique de l&#39;infection du cerveau, nous avons adapté animal entier<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie d&#39;effectuer une analyse temps-cours des nouveau-nés infectés par un virus recombinant luciférase.

Utilisation d&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

14.8K vues.  Université de Strasbourg. Le cytomégalovirus (HCMV) infection humaine des nouveau-nés représentent une cause importante de déficience mentale, mais les événements moléculaires conduisant à la pathogenèse induite par le virus sont encore mal compris. Pour étudier la dynamique de l'infection du cerveau, nous avons adapté animal entier In vivo Imagerie d'effectuer une analyse temps-cours des nouveau-nés infectés par un virus recombinant luciférase.

Vidéo: Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

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Immunologie et infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

L&#39;utilisation de carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) pour surveiller la prolifération des lymphocytes

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

L&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d&#39;un neuro-invasive virus encéphalitique

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

In vivo méthode d&#39;imagerie à distinguer inflammation aiguë et chronique

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

L&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imagerie de la production gamma d'interféron in situ dans la rate de souris suite à l'infection à Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Un essai ex vivo pour étudier Candida albicans Hyphal Morphogenesis dans le tractus gastro-intestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...