MAL, JCG, et MRS sont pris en charge par la NIA (R00AG033176 et R01AG040081) et par le Laboratoire Directed Research and Development, US Department of Energy contrat # DE-AC02-05CH11231.

1. Traitement des tissus et la digestion <ol><li> Obtenir le tissu mammaire humain en tant que matériau de défausse de procédures chirurgicales. Mammoplasties de réduction peuvent fournir des cellules normales ou bénignes; fibroadénomes et gynecomastias fournir des cellules bénignes; tissus non tumoraux mastectomie (périphérique ou controlatéral à la tumeur, ou sous-cutanée) fournir des cellules qui peuvent aller de bénigne à la normale à microtumeurs contenant. Assurez-vous approbation de l&#39;IRB bon existe avant l&#39;obtention du matériel de défausse. Tout le matériel doit être traité selon la réglementation des agents pathogènes transmissibles par le sang. </li><li> Placer le produit dans des récipients stériles contenant un tampon ou un support (par exemple 1:1 Medium Eagle modifié par Dulbecco et de Ham F-12), supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 5 pg / ml Fungizone, 50U/ml polymyxine B, et 10% de sérum foetal bovin, et le transport de laboratoire à 4 ° C. La mammoplastie de réduction des tissus peuvent être conservés ou expédiés à 4 ° C pendant 72 heures sans affecter significativement sula viabilité des cellules bsequent. De petits morceaux de tissu mammaire non-réduction peut nécessiter un traitement plus rapide. </li><li> Séparer les zones épithéliales de la matrice stromale du tissu adipeux, le tissu conjonctif et les vaisseaux sanguins en utilisant une combinaison de scalpel stérile, pinces et de ciseaux. Couper des morceaux de tissu avec des ciseaux et les placer dans un grand plat en verre stérile (par exemple, 150 mm). Disséquer délicatement sur les zones épithéliales, qui apparaissent comme des fils blancs noyées dans la matrice stromale plus jaune, à l&#39;aide des pinces pour maintenir le matériau et le scalpel pour gratter le matériau grossièrement gras. Pour faciliter la digestion, couper le tissu épithélial en petits morceaux de ~ 3-4 mm en utilisant des scalpels opposés et les placer dans un tube à essai de 50 ml. Si de grandes quantités de tissu sont en cours de traitement, frais lames de scalpel peut être nécessaire. Enlever la matière grasse du plat pour l&#39;élimination conformément aux réglementations institutionnelles. <ol class="lalpha"><li> Dans les tissus fortement fibreux (par exemple, sous-cutanée mastectomies atteints de la maladie fibrokystique grave), il y aura plus solide blanc, non épithéliaux matériel. Il peut être difficile de disséquer les cellules épithéliales de matrices fibreuses telles. De gros morceaux de matériau fibreux peut être coupé en petits morceaux qui sont carrés ~ 1-3 mm dans la zone et digéré séparément. </li></ol></li><li> Placer le tissu épithélial disséqué dans un tube à centrifuger conique (50 ml ou 15 ml) avec le tissu comprenant pas supérieure à un tiers du volume du tube. Mettre en place le tube à son volume maximum, laissant seulement un espace d&#39;air faible pour permettre le mélange, pendant la rotation, en utilisant un mélange de digestion de tissu (ou l&#39;équivalent DME/F-12, 10 ug / ml d&#39;insuline, antibiotiques comme ci-dessus, et la concentration finale de 10 % de FCS, 200 collagénase brute U / ml et 100 U / ml de hyaluronidase. </li><li> Placer les tubes sur un rotateur de tubes HulaMixer et tourner sur 360 ° à 8 tours par minute pendant la nuit à 37 ° C. </li><li> Tubes à centrifuger à 600 xg pendant 5 min. Jeter le gras surnageant et moyen terme pour l&#39;élimination accordtion de règles institutionnelles. </li><li> Vérifiez l&#39;achèvement de la digestion par dilution d&#39;une petite aliquote de la pastille dans le milieu. La digestion est terminée lorsque l&#39;examen microscopique montre des amas de cellules (organites) avec des structures canalaires lisse d&#39;apparence, alvéolaire, ou canalaire-alvéolaire libres de joint stroma (figure 1A). Tissus réduction mammaire est généralement montrent encore stroma joint après une digestion du jour au lendemain et il faudra du temps digestion supplémentaire. <ol class="lalpha"><li> Remettre en suspension le culot partiellement digéré en mélange tissu digestion fraîche et ré-incuber avec la rotation à 37 ° C pendant une autre heure 4-12. Répéter les étapes 1,6 et 1,7. Si la digestion est encore incomplète, encore une fois ajouter le mélange de digestion au culot et ré-incuber avec une rotation à 37 ° C pendant la nuit. La concentration d&#39;enzymes peut être réduite pour éviter une sur-digestion pendant une nuit. </li></ol></li><li> Lorsque la digestion est terminée, centrifuger les tubes à 600 xg pendant 5 min, aspirer le résuméion mélange, resuspendre le culot dans le milieu avec antibiotiques à environ 15 ml/50 ml tube, 5 ml/15 ml tube. </li></ol> 2. Filtration et congélation des matières digérées <ol><li> Transfert des aliquotes de l&#39;extrait concentré sur un tamis de 100 um stérile sur un tube stérile de 50 ml. Laissez le drain milieu dans le tube, puis relaver les organites sur le dessus 1-2x fois avec 2-3 ml de milieu. Répétez jusqu&#39;à ce que le culot remis en suspension a été transférée. S&#39;il existe des organites trop sur le filtre et le milieu n&#39;a plus facilement les drains, utiliser un nouveau filtre (s) de la matière restante. Soigneusement retournez le filtre (s) sur le dessus d&#39;un autre tube stérile et laver les organites dans le tube avec plus de support. Il s&#39;agit de la piscine de 100 um organoïde. </li><li> Prenez le matériau qui s&#39;écoule dans l&#39;original tube de 50 ml et répéter le processus de 2,1 en utilisant un tamis 40 um, pour obtenir la piscine de 40 um organoïde, qui contient la plupart des structures alvéolaires. Le matériau qui a drainé dans eTube électronique constitue la piscine filtrat, qui contient des touffes individuelles / petits groupes de cellules mésenchymateuses et épithéliales et des petits morceaux de la vascularisation. </li><li> Pellets de 100 um, 40 um, et les piscines filtrat à 600 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant, reconstituer chaque tube en CPM II (DME/F-12 ou équivalent avec 44% de FCS et 6% de DMSO) en utilisant environ 1 ml de CPMII par 0,1 ml de granulés emballés. Conserver à 4 ° C. </li><li> Un plat de graines de test pour les 2 piscines organoïdes en plaçant 0,1 ml de matériel remis en suspension dans une goutte de culture de tissu plat 35 mm en plastique à goutte comme dans 3.2 ci-dessous. La piscine filtrat peut être directement ensemencées sur des cultures de tissus en plastique avec support des fibroblastes (DME/F-12 ou équivalent avec 10 ug / ml d&#39;insuline et 10% de FBS). </li><li> Aliquoter le reste du matériel remis en suspension dans Nunc ampoules de type gel (1 ml / 2 ml en ampoule). Geler pendant une nuit à -80 ° C, puis transférer rapidement vers le stockage dans l&#39;azote liquide. Nous n&#39;avons pas observé de perte significative de viabilitédans nos ampoules d&#39;origine conservé congelé depuis la fin des années 1970. </li></ol> 3. L&#39;ensemencement organites congelés et Subculture des cultures primaires <ol><li> Décongeler rapidement l&#39;ampoule congelée contenant les organites dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Les semences organoïdes en 2 à 10 (habituellement ~ 6) 60 mm, des plats ou des boîtes de 100 mm 3.1, en fonction de l&#39;estimation visuelle du nombre de organoïdes dans l&#39;ampoule. Organites environ 20-40 ensemencées par antenne parabolique de 60 mm est optimal. </li><li> Organites décongelés sont placés avec soin, goutte à goutte, sur la surface de plat avec une pipette de 1 ml ou une pipette Pasteur pour une répartition uniforme de la organites. Organoïdes placés ensemble aura pour conséquence un espace limité, ce qui donne lieu à moins de cellules de la sous-culture ou de congélation. Évitez de vous gratter la surface plat (cellules ont tendance à ne pas se développer dernières surfaces rayées). Attendre 1-2 minutes pour permettre aux organites joindre, puis ajouter lentement milieu de croissance pour ne pas déloger les organites (par exemple 2-3 ml/60 plat mm). Jencubate à 37 ° C dans le CO 2 incubateur humidifié. Ce sont les cultures primaires. Nous utilisons actuellement M87A + ocytocine (X) moyen pour la croissance la plus vigoureuse HMEC (Figure 2). </li><li> Après 1 jour, vérifiez que les organites sont attachés. Ajouter à moyen supplémentaire (par exemple 2-3 ml/60 plat mm). La migration cellulaire des organites doit être visible par les 24-48 heures, et l&#39;excroissance mitotique par 48-72 h après le semis (figure 1B, C). Parfois, l&#39;attachement est pauvre bout de 24 heures, surtout si le placage organites overdigested ou organites de femmes plus âgées, mais la plupart des préparations joindre dans les 72 h. De petits morceaux de la vascularisation peut fixer et donner lieu à excroissance de cellules de fibroblastes (figure 1D). </li><li> Nourrir les cultures au moins 3 fois par semaine. Les cellules cultivées dans M87A-type de support croître jusqu&#39;à confluence près dans les 5-8 jours, en fonction de la densité de semis. </li><li> S&#39;il existe de croissance des fibroblastes important, la trypsine différentielle (DT), sur la base de l&#39;détachement rapide des fibroblastes provenant de la surface en plastique, est nécessaire pour éliminer les fibroblastes. Lorsque les plaques épithéliales deviennent grands médias aspirés, plat de lavage (par exemple, 1-2 ml/60 plat mm) avec STE (solution saline, la trypsine 0,05%, 0,02% d&#39;EDTA), aspiration, ajouter de l&#39;0,5 ml STE et laisser à température ambiante pendant environ 1 min avec l&#39;observation microscopique continue. Lorsque les fibroblastes se détacher, mais les cellules épithéliales sont encore adhérent, doucement mais fortement frapper le côté du plat contre une surface dure pour déloger les fibroblastes, puis rapidement aspirer. Laver une fois avec du PBS, et aspirer à nouveau. Cultures fortement contaminés par des fibroblastes peut-être besoin d&#39;une DT supplémentaire. </li><li> Repiquer des cultures primaires lors de grandes plaques épithéliales sont présentes, mais avant la confluence. La densité de semis organoïde et l&#39;attachement va influencer le temps nécessaire. Pour conserver la culture primaire et de générer de multiples cultures secondaires, réparties dans le temps, nous effectuons Trypsinizations partielles (PT). </li><li> Aspirer les médias, laver un plat de 60 mm avec 1-2 STE ml, ajouter 0,5 ml STE frais à plat. Observez le détachement des cellules sous le microscope à température ambiante pendant 1-5 min, avec coups doux du plat de promouvoir le détachement des cellules. Trypsinisation doit être arrêtée lorsque ~ 50% des cellules sont détachées. Au début des TP ont généralement détachement cellulaire rapide. Pour plus tard, physiothérapeutes, les cellules peuvent être placés à 37 ° C pour accélérer le détachement, avec une surveillance attentive, comme toutes les cellules peuvent se détacher rapidement. </li><li> Ajouter 2 ml de sérum contenant des médias pour le plat, repipette pour se laver, et transférer dans un tube de 15 ml stérile. Répéter 2 fois avec un autre support de ~ 1-2 ml, en ajoutant le lavage dans le tube. Réalimenter le plat principal et le retour de l&#39;incubateur. Compter le nombre de cellules dans le tube avec l&#39;hémocytomètre. TP peut être répété environ 4 à 8 fois avec la repousse des cellules bien dans les plats principaux et les équivalents croissance à long terme des repiquées secondaires ou congelés (cellules second passage sont appelés secondaires, une fois repiquées, les cellules ne sont longer primaires). Une fois le matériau organoïde n&#39;est plus présente dans les cultures primaires, secondaires repiquées montrent un déclin à long terme du potentiel de doublement de population. </li><li><ol class="lalpha"><li> Pour repiquer secondaires, les cellules de semence directement du tube dans des boîtes. Les semis de 1-2 x 10 5 mm cellules/100 plat dans un milieu solide tel que M87A + X conduira à la confluence dans les 4-7 jours. Nous ajoutons la toxine du choléra dans le milieu au second passage d&#39;accroître le potentiel prolifératif; la toxine du choléra est omis dans la culture primaire car elle conduit à excroissance cellulaire multicouche des organites. </li><li> Pour la congélation comme secondaires, tube de granulés à 600 xg pendant 5 min, et remettre en suspension dans CPMII avec une densité finale de 10 6 cellules / ml. Aliquoter remis en suspension les cellules dans Nunc ampoules de type gel, geler toute la nuit à -80 ° C, puis transférer sans tarder au stockage dans l&#39;azote liquide. </li></ol></li><li> Il est recommandé de congeler les cellules de la PT première garde, etutiliser des cellules de la PT deuxième sous-culture. TP supplémentaires peuvent être conservés congelés pour une utilisation future. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode humaine de traitement des tissus mammaires présentée ici permet d&#39;obtenir pures cellules épithéliales mammaires à partir du mélange hétérogène de types de cellules dans le sein humain. Filtration au travers des pores de taille fixe permet la séparation des différentes fractions de la glande mammaire (par exemple, des canaux et canalaire contre-alvéolaire alvéolaire) de la matrice digéré stroma. Isogéniques fibroblastes mammaires peuvent être obtenues pour correspondre aux cellules épithéliales. Frozen matière digérée a conservé une bonne viabilité pendant plus de 30 ans. Cette méthode a fonctionné avec succès sur tous, mais très fibreuses tissus mammaires, et est simple à réaliser. D&#39;autres variantes de traitement des tissus mammaires existent qui ne fournissent pas de fractions épithéliales qui sont aussi viables, propres ou séparés. Placement des organites transformés en culture avec de faibles inducteurs de stress médias tels que M87A permet croissance à long terme du HMEC avec des marqueurs de la lignée multiples. HMEC qui ont été cultivées sur plastique tout en conservant la capacité de générationte des structures 3D avec la normale dans les relations lignagères vivo similaires. Ces cultures HMEC conviennent pour une étude expérimentale approfondie, y compris à haut débit, d&#39;un comportement normal et HMEC facteurs qui peuvent propulser ou inhiber la sénescence et de la transformation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Une boîte de Pétri en verre 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Ciseaux 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Pince à 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Scalpels jetables </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagénase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / streptomycine </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Sulfate de polymyxine B </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> Trypsine 0,05% 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Tamis cellulaire 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Tamis cellulaire 40 pm </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Tubes 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Tubes de 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> Plats TC 10 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> Plats TC 6 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Flacons cryogéniques </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser scientifique </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf modèle </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Examen expérimental des cellules mammaires humaines normales (HMEC) épithélial comportement, et comment les cellules normales acquérir des propriétés anormales, peut être facilitée par des systèmes de culture in vitro de façon plus précise le modèle en biologie in vivo. L&#39;utilisation de matières provenant de l&#39;homme pour l&#39;étude de la différenciation cellulaire, le vieillissement, la sénescence et l&#39;immortalisation est particulièrement avantageux étant donné les nombreuses et importantes différences moléculaires dans ces propriétés entre les cellules de rongeurs et de l&#39;homme couramment utilisé 1-2. Les cellules mammaires présentent un système modèle très pratique car de grandes quantités de tissus normaux et anormaux sont disponibles en raison de la fréquence de réduction mammaire et la chirurgie mastectomie. La glande mammaire est constituée d&#39;un mélange complexe de nombreux types cellulaires distincts, par exemple, l&#39;épithélium, tissu adipeux, mésenchymateuses, endothéliales. Les cellules épithéliales sont responsables de la fonction différenciée mammaire de la lactation,et sont aussi à l&#39;origine de la grande majorité des cancers du sein. Nous avons développé des méthodes pour traiter les tissus mammaires glande rejets chirurgicales en pures composants épithéliaux ainsi que des cellules mésenchymateuses 3. La matière traitée peuvent être conservés congelés indéfiniment, ou initié à la culture primaire. Matière de défausse chirurgicale est transporté au laboratoire et manuellement disséqué pour enrichir le tissu épithélial contenant. Digestion ultérieure du tissu découpé à l&#39;aide de la collagénase et la hyaluronidase matériau des bandes de stroma de l&#39;épithélium à la membrane basale. Les pièces résultant de petits épithélial de l&#39;arbre (organites) peut être séparé du stroma digéré par filtration séquentielle sur des membranes de porosité fixe. Selon la taille des pores, les fractions peuvent être obtenues composé de grandes canalaires / alvéolaire pièces, des grappes plus petites alvéoles ou cellules stromales. Nous avons observé une croissance supérieure lorsque les cultures sont initiées comme organites plutôt que comme dissociated cellules individuelles. Placement des organites dans la culture en utilisant les médias induisant peu de stress en charge à long terme la croissance des HMEC normale avec des marqueurs de la lignée types multiples (myoépithéliales, luminal, l&#39;ancêtre) 4-5. Un nombre suffisant de cellules peuvent être obtenues à partir de tissus d&#39;un individu pour permettre vaste examen expérimental utilisant des lots de cellules standardisées, ainsi que d&#39;interrogatoire selon des modalités à haut débit. HMEC culture ont été utilisés dans une grande variété d&#39;études sur les processus normaux qui régissent la croissance, la différenciation, le vieillissement et la sénescence, et comment ces processus normaux sont modifiés au cours de la transformation maligne immortelle et 4-15,16. Les effets de la croissance en présence d&#39;un matériau de matrice extracellulaire, d&#39;autres types cellulaires et / ou la culture 3D peuvent être comparées avec la croissance sur 5,15 plastique. HMEC culture, à commencer par les cellules normales, apporter à un système expérimental maniable pour examiner les facteurs quipeut propulser ou prévenir le vieillissement humain et la cancérogenèse.

Des chiffres représentatifs pour les tissus digérés correctement à organites et mis en culture sont présentés dans la figure 1. Tissus incomplètement digérés montrera matériau encore attaché à l&#39;extérieur de ces structures, et aura probablement une certaine croissance des cellules fibroblastiques en culture primaire, nécessitant DT pour le retirer. Tissus Overdigested montrera moins lisses frontières extérieures, et peut prendre plus de temps pour fixer en culture primaire. Excroissance épithéliale doit débuter dans les 48-72 heures (1B, C). De petits morceaux de vascularisation (1D) peut être une source d&#39;excroissance des cellules mésenchymateuses. Excroissances épithéliales montrent que les populations morphologiquement hétérogènes, avec des populations proliférantes qui contiennent des mélanges de cellules avec des marqueurs associés à myoépithéliales, l&#39;ancêtre, et les lignées luminales (1E, 3C-E). Croissance dans des milieux de faible contrainte comme M87A complétés avec la toxine cholérique et l&#39;ocytocine soutiendra à long terme supérieurela croissance de la normale pré-stase HMEC par rapport aux précédentes formulations de milieux (figure 2). M87A-type de support soutiendra également la croissance des cellules luminales et progénitrices à travers des passages 4-8 (figures 3C-E, 4); par la suite, la plupart des cellules montrer les marqueurs de lignage ne ​​myoépithéliales. HMEC cultivés sur plastique peuvent conserver leur capacité à former 3D correcte auto-organisation à micro micropuits 3D, avec des cellules luminales intérieur des cellules myoépithéliales (figure 4A, B), et pour former des structures organisées moment de l&#39;étalement dans le Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. HMEC organites et de la culture primaire. (A) organoïde montrant la structure canalaire-alvéolaire après digestion et la filtration. (B, C) montrant la structure organites canalaire et alvéolaire 2 jours après le placement en culture primaire; noter la cellule de début outgroissance (flèches blanches). (D) des vaisseaux sanguins Petit attachée et avec des fibroblastes de départ excroissance de mêmes cultures que B, C. (E) excroissance des cellules épithéliales de la culture organoïde primaire au bout de 4 jours. Lignées sont identifiées par coloration avec des anticorps contre K14 (rouge) et K19 (vert); noyaux ont été colorées avec du DAPI (bleu). Luminal (K14-/K19 +, vert), myoépithéliales (K14 + /-K19, rouge), et les cellules progénitrices (K14 + / K19 +, cellules jaunes) sont visibles. Cellules non colorées sont observées dans le noyau organoïde due à la pénétration d&#39;anticorps incomplet. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Organites de croissance des cultures HMEC dans les formulations de différents médias. Obtenus à partir d&#39;un individu, un spécimen 184, ont été lancés dans la culture primaire en utilisant différentes formulations de milieux. Meilleure croissance à long terme est obtenue en utilisant notre formulation la plus récente, M87A + ocytocine (X) 4. Ce milieu prend également en chargecroissance de plusieurs lignées HMEC (voir Fig. 1E). Une formulation antérieure médias, MM 3 procuré une croissance moins robuste, tandis qu&#39;un milieu sans sérum, MCDB170 (commercial MEGM) 17 conduit à une induction rapide de l&#39;inhibiteur de la kinase cycline p16 INK4a et de sélection des cellules aberrantes 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figure 3. Comparaison de la diversité dans la lignée organites incultes et HMEC culture à 4 analyse FACS ème passage. (A, B) d&#39;un inculte, organoïde enzymatique dissocié de (A) l&#39;expression de EpCAM et CD49f/alpha 6 intégrine, et (B) CD227/Muc1 et CD10/CALLA. (C, D) analyse FACS des 4 ème passage pré-stase HMEC pour l&#39;expression de (C) et de l&#39;intégrine EpCAM CD49f/alpha 6, et (D) et CD227/Muc1 CD10/CALLA. P identifiablesopulations sont étiquetés comme LEP (exprimant EpCAM luminale des marqueurs ou CD227), député européen (exprimant myoépithéliales marqueurs CD49f ou CD10), ou PROG (enrichi en CD49f + / + EpCAM population). Notez que lors de l&#39;adaptation à la réglementation culture de modifications EpCAM et CD49f par rapport aux organites incultes. (E) Unsorted HMEC et FACS enrichi LEP et député à 4 ème passage colorées pour une analyse par immunofluorescence de la kératine K14 (MEP marqueur) et K19 (LEP marqueur) pour vérifier l&#39;identité lignée. Noyaux colorés au DAPI apparaissent en bleu. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figure 4. HMEC culture sont capables de former des structures organisées en relation avec la lignée de type in vivo quand ils sont placés dans des micro-environnements appropriés. (A) pré-stase 4 ième passage HMEC étaient FACS enrichi into luminale LEP et les lignages MEP myoépithéliales l&#39;aide de marqueurs pour CD227 et CD10, avec ces lignées vérifiées par l&#39;expression de K14 et K19 (non représentée). (B) Une fois mélangés dans des micropuits à micro, les cellules cultivées étaient capables d&#39;auto-organisation dans des bicouches avec des MEP à l&#39;extérieur et le LEP interne [adapté de Chanson et al. 5]. Marqué par fluorescence LEP (vert) et député européen (rouge) ont été imagées avec un microscope confocal à 0 h, 24 h et 48 h après l&#39;addition de la micropuits (supérieure). Contrôle HMEC ont été arbitrairement étiqueté avec le rouge ou le vert des marqueurs fluorescents (inférieur). (C) image Fond clair FACS des cellules souches enrichies (CKIT +) plaqué en 3D (Matrigel) la culture et cultivées pendant 18 jours. Structures qui en résultent peuvent présenter morphogenèse alvéolaire. (D) Les structures ont été extraites de Matrigel et colorées pour détecter K14 et K19; noyaux ont été DAPI. L&#39;analyse par immunofluorescence montre des structures organisées avec pola luminal et basal correcterité.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Une méthode pour traiter humaine matériau mammaire chirurgicale est décrite de défausse. Tissu traité, sous la forme d&#39;organites, peuvent être conservés congelés indéfiniment ou mis en culture pour la croissance à long terme. Cette méthode permet d&#39;examiner expérimentale de biologie cellulaire normale épithéliale humaine, et les effets des perturbations exogènes.

Traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour Culture Cellulaire

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K vues.  Lawrence Berkeley National Laboratory. Une méthode pour traiter humaine matériau mammaire chirurgicale est décrite de défausse. Tissu traité, sous la forme d'organites, peuvent être conservés congelés indéfiniment ou mis en culture pour la croissance à long terme. Cette méthode permet d'examiner expérimentale de biologie cellulaire normale épithéliale humaine, et les effets des perturbations exogènes.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Recherche

Médecine

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Culture primaire de l&#39;homme vestibulaire schwannomes

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Human Dupuytren de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture pour l&#39;étude de myofibroblastes et de matrice extracellulaire Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Travailler avec les tissus humains pour la recherche translationnelle sur le cancer

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Un modèle de culture de coupe organotypique du glioblastome humain pour l&#39;étude de la migration des cellules tumorales et des effets spécifiques des patients contre les médicaments anti-invasifs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Méthodologie pour l’Induction de l’expectoration et traitement en laboratoire

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...