C’est le premier protocole qui permet au tissu mammaire humain d’être maintenu en vie ex vivo pendant des périodes prolongées, permettant directement l’étude des interactions entre le tissu mammaire humain et le cancer du sein humain. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de maintenir en vie ex vivo des morceaux macroscopiques de tissu mammaire humain, y compris les adipocytes du sein, les cellules immunitaires, les structures vasculaires, les structures canalaires et la matrice extracellulaire. Cette technique a des implications majeures pour plusieurs domaines de la recherche sur le cancer du sein, y compris la médecine personnalisée, le développement pharmaceutique et la physiopathologie de l’initiation tumorale et des processus plus lents du cancer du sein tels que la fibrose et le remodelage de la matrice extracellulaire.
Katherine Hebert, une étudiante diplômée de Tulane et Rakesh Gurrala, un étudiant en médecine de Tulane de mon laboratoire, démontrent cette procédure. Pour commencer, faites fondre la solution de gélatine préparée dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Utilisez une pipette sérologique de cinq ou 10 millilitres pour distribuer 2,5 millilitres de cette solution sur chaque piston pour les puits d’une plaque de six puits.
Une fois que la gélatine s’est solidifiée, déplacez les plaques ASC codées pNIPAAm vers l’armoire de biosécurité. Placez délicatement les pistons dans les puits de ces plaques afin que la gélatine entre en contact avec les ASC. Placez une rondelle métallique sur le piston pour l’alourdir afin que la gélatine soit en contact direct avec la feuille ASC pendant 30 minutes à température ambiante.
Déplacez doucement la plaque avec les pistons dans la boîte stérile de l’armoire de biosécurité et placez le couvercle dessus. Déplacez la boîte dans un réfrigérateur à quatre degrés ou placez l’assiette sur de la glace et un seau à glace dans l’armoire de biosécurité pendant 30 minutes. Dans une armoire de biosécurité, lavez le tissu mammaire humain trois fois avec 10 millilitres de PBS stérile.
Utilisez une pince stérile et une lame de rasoir pour hacher grossièrement le BC-MPS et essayez d’enlever autant de fascia et de tissu conjonctif que possible. Une fois que le tissu conjonctif a été enlevé, utilisez une lame de rasoir stérile pour finalement hacher le tissu jusqu’à ce qu’il ait une consistance liquide homogène. Couper la pointe d’une pointe de pipette P1000 pour aider à pipetter le tissu haché.
Dans un tube de 1,5 millilitre, combiner le tissu haché, les lignées cellulaires cancéreuses et les milieux BC-MPS comme décrit dans le manuscrit de texte. Déplacez la plaque ACS qui sera utilisée pour la feuille de cellule inférieure de l’incubateur vers l’armoire de biosécurité et aspirez le support de la plaque. Pipettez le mélange de tissu mammaire préparé sur le centre du puits de la plaque ACS inférieure à l’aide de la pointe de la pipette coupée, déplacez la boîte contenant la plaque ACS supérieure avec des pistons vers l’armoire de biosécurité.
Retirez délicatement les pistons de gélatine de la plaque enduite de pNIPAAm et placez-les sur le dessus du mélange de tissus. Ajoutez le support BC-MPS au puits et déplacez soigneusement les plaques ACS inférieures avec le mélange BC-MPS et les pistons vers la boîte en plastique stérile. Placez le couvercle de la boîte pour le transport, en prenant soin d’éviter la contamination de la culture.
Incuber la plaque inférieure dans la boîte et l’incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la gélatine soit fondue et que la couche ACS supérieure ait commencé à adhérer à la couche inférieure. Déplacez ensuite la boîte avec les plaques vers l’armoire de biosécurité, retirez doucement les pistons des plaques inférieures pour observer le tissu avec les cellules cancéreuses ancrées au fond du puits. Replacez le couvercle de la plaque de six puits sur la plaque inférieure et incuber à 37 degrés pour faire fondre complètement la gélatine et permettre à la couche supérieure de s’ancrer à la couche inférieure.
Déplacez délicatement les plaques vers une armoire de biosécurité et aspirez le support du bord du puits avec une pipette sérologique de 10 millilitres. Ajouter deux millilitres de milieux frais sur le bord de chaque puits pour éviter de délaler le tissu. Maintenir le BC-MPS à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant la durée souhaitée.
Changer les médias tous les deux ou trois jours. Déplacez la plaque vers l’armoire de biosécurité lorsque le BC-MPS est prêt à être analysé. Retirez les supports à l’munis d’une pipette sérologique pour éviter le délogement accidentel de tout tissu.
Ajoutez un volume de PBS à chaque puits. Retirez ensuite le PBS avec une pipette sérologique. Ajoutez un millilitre de solution de dissociation cellulaire à chaque puits et déplacez la plaque vers l’incubateur pendant cinq minutes pour permettre à ces cellules de se détacher.
Après l’incubation, utilisez un grattoir à cellules pour détacher complètement les cellules et le tissu de la plaque de culture dans une armoire de biosécurité. Transférer la solution avec le tissu dans un tube conique de 15 millilitres et recueillir toutes les cellules restantes en ajoutant deux millilitres de PBS. Enveloppez le tube avec du papier d’aluminium si les cellules sont fluorescentes.
Incuber le tube à 37 degrés sous agitation constante dans un agitateur orbital à une fois G pendant 10 à 20 minutes pour dissocier complètement les cellules du tissu. Dans une armoire de biosécurité, utilisez une pipette sérologique pour perturber les touffes de cellules restantes dans le tube. Et filtrer l’échantillon à travers une passoire tissulaire de 250 micromètres dans un nouveau tube de 15 millilitres.
Rincez la crépine avec un millilitre de PBS pour recueillir les cellules restantes. Centrifuger les échantillons à 500 fois g à température ambiante pendant cinq minutes pour séparer les adipocytes qui flotteront dans la couche supérieure des cellules cancéreuses et des ASC mélangés ensemble dans une pastille. Transférer la couche d’adipocyte dans un nouveau tube à l’aide d’une pointe de pipette coupée émoussée.
Centrifuger à nouveau l’échantillon et utiliser une seringue et une aiguille pour enlever la solution restante sous les adipocytes. Aspirer la solution restante du tube contenant les ASC et les cellules cancéreuses sans perturber la pastille cellulaire. Re-suspendre la pastille dans les milieux PBS ou BC-MPS et utiliser la cytométrie de flux pour trier les cellules en fonction de la fluorescence.
Le motif stri-aidé de la feuille ASC confluente est montré ici. Le tissu humain flottant de sein était encore stable ancré par les feuilles de cellules d’ASC au fond du puits après 14 jours de culture. Les images fluorescentes de microscopie démontrent la stabilité du BC-MPS avec MDA-MB-231 exprimant des variétés de cellule de RFP après 14 jours et avec pdx explant triple négatif de tumeur pendant au moins six jours.
BC-MPS contenant le tissu de sein a été cultivé in vitro pendant 14 jours, souillé et image pour démontrer les éléments indigènes du tissu au grossissement 100X et 20X. La souillure des marqueurs de macrophage a été employée pour montrer la conservation des macrophages primaires après trois et sept jours dans la culture. L’analyse cytometry d’écoulement des cellules MDA-MB-231 souillées par Bodipy après 14 jours indique l’accumulation minimale de lipide dans la culture 2D et l’accumulation étendue de lipide et bc-MPS.
La proportion de cellules MDA-MB-231 positives de lipide était 26,2 fois plus grande dans BC-MPS que la culture 2D. Les cellules cultivées dans BC-MPS ont montré des gouttelettes lipidiques d’augmentation comparées aux cellules cultivées dans la culture 2D standard. Les images de time-lapse de RFP ont marqué BC-MPS avec les cellules MDA-MB-231 ont montré le mouvement amoeboid de 231 cellules avec des pseudo gousses et la motilité élevée.
Le tissu mammaire doit être haché assez petit et séparé suffisamment pour être distribué au fond du puits. Le tissu mammaire est très flottant et si les morceaux sont trop gros ou regroupés trop étroitement, les feuilles cellulaires ASC ne pourront pas ancrer le tissu mammaire au fond du puits. Les constructions de cancer du tissu mammaire qui en résultent peuvent subir une digestion enzymatique pour isoler des types particuliers de cellules d’intérêt.
Cela permettra de répondre à des questions clés telles que la façon dont les cellules cancéreuses dans le tissu mammaire réagissent différemment à la chimiothérapie par rapport à la culture 2D traditionnelle ou aux organoïdes.
