Ce travail a été soutenu en partie par (1) le ministère de la Défense Programme Cancer Research (Recherche Acquisition Activité US Army Medical) de prix # W81XVVH-10-1-0781 à LAL et VE, et (2) la subvention de la Fondation Susan G. Komen Breast IR122224446 Lal et VE. des services de pathologie et extrapolation de tissu a été gracieusement fournie par Inova Fairfax département de pathologie, le Dr Hassan Nayer, le Dr Geetha A. Menezes, et le Dr Charles Bechert. Le consentement du patient et la collecte des échantillons a été savamment guidés par l&#39;hôpital Inova Fairfax coordonnateurs de recherche clinique de Holly Gallimore, Heather Huryk, et Emil Kamar.

Tissu mammaire humain ont été recueillies auprès des patients participant à une étude de recherche, avec le consentement éclairé écrit, suivant ministère de la Défense, de l&#39;Université George Mason, et les protocoles approuvés par le Conseil d&#39;examen institutionnel du système de santé d&#39;Inova. 1. Préparer riche en nutriments moyen de facteurs de croissance et des antibiotiques <ol><li> Préparation des solutions mères de l&#39;insuline, le facteur de croissance épidermique (EGF), le sulfate de streptomycine et de sulfate de gentamicine. <ol><li> Reconstituer l&#39;insuline dans l&#39;eau filtrée stérile à une concentration finale de 10 mg / ml. Aspirer 10 ml de type 1 eau de qualité réactif dans une seringue de 10 ml stérile à usage unique. Fixer un filtre de 0,22 um de polyéthersulfone à la seringue. Verser l&#39;eau filtrée stérile dans un tube de 15 ml conique stérile. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;eau filtrée stérile à un flacon de 100 mg d&#39;insuline. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Conserver le flacon d&#39;insuline sur la glace. Distribuer 450 ul de l&#39;insuline actions solution dans étiquetés, des microtubes stériles et conserver à -20 ° C. Solution de réserve d&#39;insuline est stable jusqu&#39;à la date de péremption indiquée sur le flacon. </li><li> Préparer une solution stock de facteur de croissance épidermique (EGF): Ajouter 500 pi d&#39;eau stérile à 500 ug EGF (stock 1 pg / pl). Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Conserver le flacon FEM sur la glace. <ol><li> Préparer une solution de travail de l&#39;action de l&#39;EGF: Ajouter 100 ul de la solution mère de l&#39;EGF à 900 milieu nutritif pi (stock de travail sera de 0,1 pg / pl). Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Distribuer 50 pl de la solution de travail des stocks EGF dans étiquetés, des microtubes stériles et conserver à -80 ° C. REMARQUE: EGF solution stock (1 pg / pl) est stable pendant 1 an à -80 ° C; Solution de travail de stock (0,1 ug / ul) est stable pendant 2 mois à -80 ° C. </li></ol></li><li> Peser 40 mg de sulfate de streptomycine sur une balance analytique. Placer le int de sulfate de streptomycineo stériles tube de 15 ml conique. Ajouter 4 ml de milieu nutritif. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. La solution doit être légèrement rosée. Conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. Une solution de sulfate de streptomycine est stable pendant 7 jours. </li><li> Peser 20 mg de sulfate de gentamicine sur une balance analytique. Placer le sulfate de gentamicine dans un tube conique de 15 ml stérile. Ajouter 2 ml de milieu nutritif. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. La solution doit être jaune. Conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. Une solution de sulfate de gentamicine est stable pendant 7 jours. </li></ol></li><li> Préparer deux 200 ml lots de milieu nutritif additionné d&#39;EGF humain recombinant (10 ng / concentration finale ml.), De l&#39;insuline (10 ug / ml de concentration finale.), Du sulfate de streptomycine (100 ug / ml de concentration finale.) Et de sulfate de gentamicine (20 ug / ml de concentration finale.). <ol><li> Ajouter 200 ml de milieu nutritif à un ballon filtrant à vide équipé d&#39;un filtre de 0,2 um ballon de polyéthersulfone et une bouteille de 250 ml de réception. Ajouter 20 &amp;# 181; l stock de travail du FEM, 200 pi actions insuline, 2 ml de sulfate de streptomycine stock, et 400 pi actions sulfate de gentamicine à 200 ml de milieu nutritif. Fixez le flacon de filtre à vide. Filtrer le milieu. Jeter le filtre et l&#39;étiquette du flacon comme «un milieu riche en nutriments&quot;. Conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 14 jours. </li></ol></li></ol> 2. Acquisition de tissus et extrapolation <ol><li> Dans la salle d&#39;opération, maintenir technique stérile après procurer le tissu mammaire. Placez le tissu mammaire dans un plateau stérile et recouvrir le plateau d&#39;une pellicule de plastique stérile. <ol><li> Transporter le tissu dans le bac couvert de radiologie / Pathologie tel que requis par votre institution. Ne pas ouvrir le tiroir. Les temps de transport varient au sein des institutions. Les tissus peuvent rester viables dans ce bac couvert à température ambiante pendant jusqu&#39;à 45 minutes après l&#39;excision. Cependant, le traitement rapide des tissus dans un milieu riche en nutriments offre des conditions optimales pour la culture organoïde ultérieure. </li></ol></li><li> Dissection du tissu brut d&#39;identifier les zones de CCIS dans le tissu du sein: Utiliser des gants stériles, des lames, des scalpels, tissus colorants de marquage et de vinaigre lors de la dissection de tissu pour maintenir la stérilité de tissu. <ol><li> Nettoyer la zone de travail avec 70% d&#39;éthanol ou 1% eau de Javel. Ouvrez les gants stériles et placer l&#39;enveloppe de gant sur la surface de travail. Placez l&#39;intérieur du gant stérile emballage vers le haut. Mettre les gants stériles. <ol><li> Nettoyer la surface du récipient d&#39;échantillon avec 70% d&#39;éthanol. Retirer la pellicule de plastique du contenant d&#39;échantillon de tissu et placer l&#39;échantillon sur l&#39;emballage de gants. </li></ol></li><li> Trempez deux cotons-tiges basculé dans la teinture de marquage de tissu. Appliquer le colorant à la surface du tissu en faisant rouler les tampons à travers la surface du tissu. REMARQUE: Chaque département de pathologie a un protocole standardisé d&#39;orientation couleur de teinture / tissu. Le tissu est marqué avec un colorant pour orienter le tissu par rapport à sa position dans le patient. Le colorant est effacé oupeint sur le tissu. Ne pas verser le colorant sur le tissu. Verser le colorant peut provoquer le colorant pour exécuter / goutte à goutte dans les crevasses de tissus nuisant ainsi à l&#39;orientation des marges chirurgicales. orientation tissulaire fournit le chirurgien et avec des repères anatomiques pathologiste à a) décrire le spécimen de tissu, et b) déterminer l&#39;emplacement des marges chirurgicales par rapport à la tumeur. </li><li> Verser le vinaigre blanc distillé (acide acétique à 5%) sur des tampons de gaze stériles. Tamponnez le tissu teint avec la gaze imbibée de vinaigre. Jeter la gaze. Le vinaigre est utilisé pour fixer les colorants marquage de tissu. </li><li> Couper le tissu mammaire en tranches verticales d&#39;environ 5 mm d&#39;épaisseur. Ne pas couper tout le chemin à travers le tissu (Figure 2). Observer / palper le tissu pour les zones de calcification. Identifier les lésions de CCIS par leur entreprise caractéristique, pâle apparition entouré de rouge, les frontières caoutchouteux qui se sentent graveleux (en raison de spicules de calcium). REMARQUE: Dans certains cas, les zones comédon (bouton-like) peuvent êtrevu comme des points blancs, représentant matériau nécrotique de grand diamètre lésions CCIS. </li><li> Découpez les zones de CCIS tissu mammaire / entartrée, y compris une petite quantité de tissu mammaire environnant. Placer le tissu mammaire dans un tube stérile de 50 ml contenant de 20 à 30 ml de milieu riche en nutriments préparé à l&#39;étape 1. <ol><li> Mélanger le tissu et moyen en retournant doucement le tube plusieurs fois. Jeter le moyen et ajouter du milieu frais. Placer le tube contenant le tissu et le milieu dans un récipient isolé et transporter le tissu au laboratoire de culture de tissus. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Culture de tissu <ol><li> Travailler dans une enceinte de sécurité biologique, verser le tissu et une petite quantité de milieu nutritif dans une boîte de Pétri stérile. Avec un scalpel stérile coupé et jeter le tissu fibreux. Couper le tissu mammaire en morceaux (organites) d&#39;environ 3 mm 2 (figure 1C-D). Essayez de couper le tissu de sorte que chaque organeOID contient au moins un segment de canal discernable avec stroma environnant. </li><li> Ouvrir le couvercle de la fiole de culture de tissu. Avec des ciseaux ou des pinces stériles, placer les organites dans le ballon. Fermez le couvercle. Jeter la boîte de Pétri. </li><li> Ajouter 11 ml de milieu riche en nutriments sans sérum (préparé à l&#39;étape 1) dans le ballon de culture tissulaire. Fermer le flacon et agiter la fiole de sorte que les organites et le milieu sont distribués uniformément sur ​​toute la surface du ballon (figure 1E-F). </li><li> Incuber le ballon à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5,0% pendant 2 jours. Ne déplacez pas le ballon pendant cette période. </li><li> 2 jours après l&#39;incubation, enlever le ballon de l&#39;incubateur pour vérifier la contamination fongique / bactérienne potentiel. Évitez coup, les mouvements brusques, ou tourbillonnant du ballon. Placer le ballon sur une platine du microscope inversé. <ol><li> Observer le support de bactéries, de levures et / ou moisissures. Si aucune contamination est à noter, retourner le ballon à l&#39;incubateur pour un complémentjour tradition-. Si la contamination est à noter, jeter le ballon et son contenu dans un récipient approprié. </li></ol></li><li> Le jour 3 après incubation, remplacer le milieu conditionné par un milieu frais. <ol><li> Placer 11 ml de milieu dans un tube stérile à 37 ° C pendant 20 à 30 min. Retirer le flacon de culture de tissu à partir de l&#39;incubateur. Sans déranger les organites, retirez et jetez le milieu dans la fiole à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique stérile. </li><li> En utilisant une nouvelle pipette sérologique stérile, ajouter 11 ml de milieu frais préchauffé. Très tourner doucement le flacon pour distribuer le fluide sur la surface du ballon. </li><li> Incuber le ballon à 37 ° C dans 5,0% de CO 2, atmosphère humidifiée. </li></ol></li></ol> 4. Maintien d&#39;établi des colonies cellulaires Organoid / épithéliales <ol><li> Préparer milieu frais toutes les 2 semaines et remplacer les médias dans le flacon de culture de tissu 3 fois par semaine. <ol><li> Placer 11 ml de milieu dans un récipient stérile à 37° C pendant 20 à 30 min. Enlever le ballon de l&#39;incubateur. L&#39;utilisation d&#39;un sérologique pipette stérile, retirez et jetez le milieu conditionné du ballon, en faisant attention de ne pas déranger les organites. </li><li> En utilisant une nouvelle pipette sérologique stérile, ajouter 11 ml de milieu frais préchauffé. Très tourner doucement le flacon pour distribuer le fluide sur la surface du ballon. Incuber le ballon à 37 ° C dans 5,0% de CO 2, atmosphère humidifiée. </li></ol></li><li> Après 10 - 14 jours de culture, de supprimer tous les morceaux de tissus dans le flacon de culture qui ne sont pas adhérentes. <ol><li> Des cellules et / ou les organites de la fiole de propagation dans de nouvelles fioles de culture, la récolte périodique de transplantation de xénogreffe, ou pour phénotypique et / ou d&#39;une analyse moléculaire. </li><li> Retirer le flacon de culture de tissu à partir de l&#39;incubateur. Vaporiser le ballon avec 70% d&#39;éthanol. Essuyez l&#39;excès de l&#39;éthanol sur le ballon avec une serviette en papier propre qui a été pulvérisé avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Propagation Organoid: &lt;ol&gt; <li> Ouvrez le couvercle du flacon et placez le couvercle face vers le haut dans l&#39;enceinte de sécurité biologique. Sous visualisation microscopique, localiser la organoïde (s) à être récoltés. Utilisez des pinces ou des pinces stériles pour ramasser un organoïde. </li><li> Pour propager la organoïde dans un nouveau flacon de culture, placez le organoïde dans le nouveau flacon. Ajouter 11 ml fraîche, milieu chaud. Incuber à 37 ° C, dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée, comme décrit dans les étapes 3.3 - 3.6.3. Remplacer le milieu de culture cellulaire dans la culture de tissus ballon à trois fois par semaine. </li></ol></li><li> La récolte des cellules: <ol><li> Sous vixualization microscopique direct, gratter délicatement et cellules aspirer et mammospheres aide d&#39;une pipette de 1000 pi avec des embouts de pipette jetables stériles. Aspirer les cellules et le milieu environnant. Distribuer les cellules / milieu dans un tube à centrifuger stérile. </li></ol></li><li> Faites tourner les cellules brièvement dans un mini-centrifugeuse à 12 100 g pendant 5 sec. Retirez et jetez le milieu. &lt;ol&gt; <li> Pour l&#39;analyse de l&#39;ADN, geler immédiatement le culot de cellules sur de la glace sèche, dans un petit volume de milieu (10 pi), avec un stockage à long terme à -80 ° C. </li><li> Pour l&#39;analyse protéomique, la lyse des cellules dans 10 ul de 8 M urée pour la spectrométrie de masse ou 2x SDS tampon tris-glycine pour blot / arrière des puces à protéines de la phase de l&#39;Ouest. Sinon, tourner cellules dans un cytocentrifugeuse à faire des frottis cellulaires pour l&#39;analyse immunohistochimique. </li></ol></li><li> Après la récolte des cellules d&#39;un flacon, retirez et jetez le milieu restant. Ajouter 11 ml de milieu de culture riche en nutriments frais chaud. Incuber le ballon à 37 ° C, dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shaughnessy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+intraepithelial+neoplasia:+an+important+target+for+accelerated+new+agent+development.">Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+precursor+cells+pre-exist+in+human+breast+DCIS+and+require+autophagy+for+survival.">Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival.</a> PLoS One. 5 (4), (2010).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Farnie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+technique+for+primary+ductal+carcinoma+in+situ:+role+of+Notch+and+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+pathways.">Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways.</a> J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).</li><li>Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+collagen+requirements+for+attachment+and+growth+of+mammary+epithelium.">Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium.</a> Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).</li><li>Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+malignant+nature+of+human+ductal+carcinoma+in+situ.">What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ.</a> Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin+1+and+autophagy+are+required+for+the+tumorigenicity+of+breast+cancer+stem-like/progenitor+cells.">Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells.</a> Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).</li><li>Simon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+glycoprotein+is+a+member+of+a+family+of+epithelial+cell+surface+antigens+homologous+to+nidogen,+a+matrix+adhesion+protein.">Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein.</a> PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).</li><li>Ma, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+breast+cancer+progression.">Gene expression profiles of human breast cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).</li><li>Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+prognostic+index+for+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.+Are+we+there+yet.">Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet.</a> Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).</li><li>Sgroi, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+breast+cancer.">Preinvasive breast cancer.</a> Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).</li><li>Asch, H. L., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+keratin+expression+in+mouse+mammary+hyperplastic+alveolar+nodules+and+adenocarcinomas.">Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas.</a> Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).</li><li>LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+microenvironments+and+mammary+stem+cells.">Of microenvironments and mammary stem cells.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+picture+of+the+mouse+mammary+stem+cell.">The emerging picture of the mouse mammary stem cell.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cap+associated+focal+adhesions+and+their+distinct+role+in+cellular+mechanosensing.">Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing.</a> Sci Rep. 2, 555 (2012).</li><li>Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attacking+breast+cancer+at+the+preinvasion+stage+by+targeting+autophagy.">Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy.</a> Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).</li><li>D'amonte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+behavior+is+programmed+in+the+precancer+stem+cell.">Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).</li></ol>

Les auteurs ont rien à divulguer.

Le système de culture décrit ici constitue un nouveau modèle pour générer des cellules vivantes mammaires néoplasiques pré-invasives pour les études de base et de recherche translationnelle. Dans le passé, la progression du cancer du sein pré-malin a généralement été étudié en utilisant trois procédés différents. La première méthode est histopathologique et l&#39;analyse génétique des échantillons humains congelés ou fixes microdisséquées 12-14. La deuxième méthode utilise des mod...

La prolifération des cellules épithéliales dans les limites de canaux du sein et les alvéoles (carcinome canalaire in situ) est reconnu comme un précurseur obligatoire à canalaire infiltrant et le carcinome lobulaire. Néanmoins, les mécanismes moléculaires et la dynamique des populations de cellules qui permettent la progression vers un cancer invasif sont mal comprises. Élucider les mécanismes de survie utilisées par les cellules de carcinome du sein pré-invasives, ou toute tumeur pré-invasive, peut révéler des stratégies thérapeutiques pour le meurtre, voire d&#39;empêcher, les tumeurs pré-invasives 1. Cependant, les méthodes simples et peu coûteuses pour l&#39;étude fonctionnelle des lésions pré-invasives humaines ont fait défaut. Bien que la monocouche de culture in vitro de lignées de cellules transformées est une méthode de laboratoire établi, le phénotype et le génotype de ces lignées cellulaires immortalisées ne parvient pas à récapituler l&#39;état moléculaire des cellules tumorales humaines primaires 2. En outre, même la lignée de cellules MCF-10A non-tumorigène, qui RecApitulates 3-D architecture de la glande mammaire, ne représente pas de manière adéquate le phénotype fonctionnel et caractéristiques moléculaires de la lésion du sein pré-invasive d&#39;un patient individuel 3,4. Pour déterminer si les cellules souches néoplasiques comme capables d&#39;invasion existaient dans le carcinome canalaire in situ (CCIS) population de cellules, nous avons développé une méthodologie de collecte et de culture de tissu stérile maternel au moment de la chirurgie (Figure 1) 5. Notre ex vivo sein du système de culture organoïde ne dépend pas de perturbation enzymatique de tissu, matrice de membrane basale de l&#39;extrait, ou l&#39;appauvrissement des fibroblastes, pour l&#39;isolement et la propagation de cellules formant mammosphere de frais canalaire du sein carcinome humain tissu 8.6. Notre nouveau système est basé sur le principe de la cellule de streaming / 5 migration. Les canaux du sein perceptibles, et le stroma environnant sont immergés dans un volume minimal de milieu nutritif sans sérum (juste enough à recouvrir les fragments de conduits) afin de maximiser l&#39;échange de gaz, avec la surface de la gaine exposée au milieu de culture de coupure, mais pas dans une orientation spécifique dans le ballon (figure 1E-F). Ce système de culture de cellules permet de migrer hors de la gaine et dans / sur le stroma et ballon de culture autologue. Le milieu nutritif, complétée seulement par facteur de croissance épidermique (EGF), l&#39;insuline et des antibiotiques, favorise la croissance de populations cellulaires mixtes issues de la organoïde. Le flacon de culture de tissu a une refermable couvercle amovible, qui permet aux organites et / ou des cellules qui doivent être récoltées, sans perturber le ballon ou voisins organites entiers, tout en maintenant un environnement stérile humidifié.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

Sein carcinome canalaire in situ (CCIS), par définition, est la prolifération des cellules épithéliales néoplasiques dans les limites de la conduite du sein, sans porter atteinte à la membrane basale de collagène. Bien CCIS est un précurseur non obligatoire pour les cancers du sein invasifs, les mécanismes moléculaires et les populations de cellules qui permettent la progression vers un cancer invasif ne sont pas complètement connus. Pour déterminer si les cellules souches capables d&#39;invasion existaient au sein de la population de cellules CCIS, nous avons développé une méthodologie de collecte et de culture de tissu stérile maternel au moment de la chirurgie, sans perturbation enzymatique de tissu. Tissu mammaire stérile contenant des segments canalaires est récolté à partir de tissu mammaire excisé chirurgicalement après examen pathologique de routine. Tissu contenant DCIS est placé en milieu riche en nutriments, contenant l&#39;antibiotique, sans sérum, et transporté au laboratoire de culture de tissus. Le tissu mammaire est également dissected pour isoler les zones calcifiées. Morceaux de tissu du sein multiples (organites) sont placés dans un volume minimal de milieu sans sérum dans un flacon muni d&#39;un couvercle amovible et cultivées dans un incubateur à CO2 humidifié. Populations de cellules épithéliales et fibroblastes émergent de la organoïde après 10 - 14 jours. Mammospheres former spontanément sur et autour de la monocouche de cellules épithéliales. Populations spécifiques de cellules peuvent être récoltées directement du ballon sans perturber les cellules voisines. Notre système de culture de tissu non-enzymatique révèle fiable cytogénétique anormaux, des cellules progénitrices invasives de lésions humaines fraîches de DCIS.

Workflow pour l&#39;acquisition et la culture de carcinome canalaire du sein stérile dans les tissus in situ stérilité du tissu mammaire est maintenue de la salle d&#39;opération au laboratoire de culture cellulaire par des changements mineurs dans typique flux hôpital de pathologie (figure 1). Le tissu est transportée dans un récipient stérile avec une couverture en film plastique qui permet une évaluation radiologique, tout en maintenant la stérili...

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Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d&#39;épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant&gt; 6 mois.

Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vues.  George Mason University.  Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant> 6 mois. 

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Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Recherche

Biologie

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

Génération d&#39;une seule cellule suspensions de tissus de souris de neurones

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

Préparation du Pooled lysat plaquettaire humain (pHPL) comme un supplément efficace pour animaux sans sérum humain cultures de cellules souches

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Électrofilage treillis polymères fibreux pour l&#39;ingénierie tissulaire et de la culture cellulaire

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

Culture à long terme des spécimens humains de cancer du sein et leur analyse en utilisant la tomographie optique de projection

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca and, in particular, of the granulosa cell layer profoundly change their morphological, physiological, and molecular characteristics and form the progesterone-producing corpus luteum that is responsible for maintaining pregnancy. Cell culture models are essential tools to study the underlying regulatory mechanisms involved in the folliculo-luteal transformation. The presented protocol focuses on the isolation procedure and cryopreservation of bovine GC from small- to medium-sized follicles (&#60; 6 mm). With this technique, a nearly pure population of GC can be obtained. The cryopreservation procedure greatly facilitates time management of the cell culture work independent of a direct primary tissue (ovaries) supply. This protocol describes a serum-free cell culture model that mimics the estradiol-active status of bovine GC. Important conditions that are essential for a successful steroid-active cell culture are discussed throughout the protocol. It is demonstrated that increasing the plating density of the cells induces a specific response as indicated by an altered gene expression profile and hormone production. Furthermore, this model provides a basis for further studies on GC differentiation and other applications.

A long-term culture model of bovine granulosa cells under serum-free conditions is described. This model allows researchers to study the effects of diverse factors and conditions as different plating densities on the characteristics of estrogen-producing bovine granulosa cells.

Un modèle de Culture tissulaire d’oestrogène-production primaire Bovine Granulosa cellules

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Collection de tissus de chauves-souris pour -Analyses d'omics et culture cellulaire primaire

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated clearance. Many clinically relevant defects in the mucociliary epithelium are inferred as they occur deep within the body. Here, we introduce a tractable 3D model for mucociliary epithelium generated from multipotent progenitors that were microsurgically isolated from Xenopus laevis embryos. The mucociliary epithelial organoids are covered with newly generated epithelium from deep ectoderm cells and later decorated with distinct patterned multiciliated cells, secretory cells, and mucus-producing goblet cells that are indistinguishable from the native epidermis within 24 h. The full sequences of dynamic cell transitions from mesenchymal to epithelial that emerge on the apical surface of organoids can be tracked by high-resolution live imaging. These in vitro cultured, self-organizing mucociliary epithelial organoids offer distinct advantages in studying the biology of mucociliary epithelium with high-efficiency in generation, defined culture conditions, control over number and size, and direct access for live imaging during the regeneration of the differentiated epithelium.

We describe a simple protocol to develop mucociliary epithelial organoids from deep ectoderm cells isolated from Xenopus laevis embryos. The multipotent progenitors regenerate epithelial goblet cell precursors and allow live tracking of the initiation and progression of the cell transitions on the surface of organoids.

Organoïdes épithéliales mucociliaires des cellules embryonnaires de Xenopus : génération, culture et imagerie vivante haute résolution

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Culture de tissu du cortex ovarien bovin

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...