이 작품은 크리스티나 VOELKEL 존슨에 NIH R21 CA143505에 의해 지원되었다.

동물과 관련된 모든 절차는 검토 된 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 프로토콜은 통증에 대한 USDA 카테고리 D에서 승인되었다. 1. 세포 이식 <ol><li> 이틀 절차를 수행하기 전에, T-25 플라스크에 1 × 10 6 MB49 세포를 접시. (원하는 경우, 항생제) 10 % FBS와 보충 높은 혈당 DMEM을 사용합니다. 한 플라스크 마취 병렬로 주입 될 것이다 최대 5 개의 마우스의 각 그룹에 대해 충분하다. </li><li> 프로 시저의 날, 멸균 DMEM의 기본 매체 (1시 2분 희석)와 0.125 %로 멸균 0.25 % 조직 배양 등급 트립신을 희석하여 점안을위한 트립신을 준비합니다. 1.2 ㎖를 10 생쥐에 충분하다. 평형을 37 ° C의 수조에 넣습니다. </li><li> 가열 패드를 Prewarm 그리고 난을 전달하는 데 사용되는 마취 시스템의 nosecones 아래에 위치soflurane. 가열 패드에 깨끗한 흡수 패드를 놓습니다. </li><li> 마취 시스템의 유도 챔버에 마우스를 놓고 3 % 이소 플루 란으로 마취를 유도한다. 쥐가 발가락 핀치 반사의 손실에 의해 확인 된 의식을 잃은 경우, nosecones로 전송. 각 동물은 앙와위에 적절히 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 배치 확인. </li><li> 마취를 유지하기 위해 2 %에 이소 플루 란의 농도를 줄일 수 있습니다. </li><li> 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 선택 단계 : 복부 머리를 제거합니다. 생체 발광 생물 이미징을 수행 할 경우 낮은 복부에 머리를 제거해야합니다. <ol><li> 외부 성기를 접촉하지 않도록주의하면서 복부에 모피의 광장에서 가장 낮은 1 등 Veet 등의 제모 크림의 관대 한 층을 적용. 3 분을 기다립니다. </li><li> 마른 스펀지로 영역을 문질러 머리를 제거하고 피부를 정화 젖은 스폰지를 사용하여. 필요한 경우, 한 번 반복합니다. </li></ol></li><li> 방광에 카테 테르를 꽂다 <ol><li> 이러한 KY 같은 자극적 윤활 젤 새로운 멸균 24 G 소아 정맥 카테터에 기름칠을. 제거하고 바늘을 폐기​​합니다. 카테터 주위 유체의 누수는 일반적인 문제, 즉됩니다. 그것은 큰 내경 카테터 (20 G)를 사용할 수 있으며, 더 자주 열 쥐에서보다 발​​생한다. 이 8 주 이전의 마우스에 중요한 고려 사항이 될 수있다. </li><li> 카테터의 중심을 잡고, 마우스의 뒷다리를 확산하고 요도를 노출하기 위해 반대쪽 손의 엄지 손가락과 집게 손가락을 사용합니다. 조심스럽게 완전히 삽입하는 벤치 하나의 병렬로 각도를 변경, 45 ° 각도로 요도에 카테터를 삽입합니다. </li><li> 전체 삽입 후에는 벤치에 평행 유지, 부드럽게 카테터를 들어 올려 시각적으로는 그 아래에있는 요도가 아닌 질에 배치되어 있는지 확인합니다. 올바르게 놓은 경우, 카테터가 될 수있을 것입니다질은 요도보다 짧은 때문에 완전히 삽입 된. </li><li> 1 % 이소 플루 란의 농도를 줄일 수 있습니다. </li></ol></li><li> P200의 피펫에 팁을 부착하고 카테터의 외부 끝으로 흡입을 적용하여 방광에서 소변을 제거합니다. 카테터의 중심에 남아있는 소변을 제거합니다. 소변을 취소하고 대신에 카테터를 둡니다. </li><li> 조심스럽게 기포를 피하고, 카테터 허브에 80 μL보기 0.125 % 트립신 용액을 피펫. 카테터 허브에 1 ㎖의 공기 채워진 주사기를 연결하고 천천히 방광에 트립신을 제공하기 위해 플런저 0.1 ~ 0.2 ㎖의 우울. </li><li> 15 분 동안 자리에 주사기와 카테터 어셈블리를 둡니다. 반복 나머지 마취 쥐의 (최대 4)에 대한 1.8-1.11 단계를 반복합니다. 대기 기간 동안 다음 단계로 진행합니다. 힌트 : 처음에는 다른 사람이 셀 (단계 1.12)를 준비해야하는 것이 도움이 될 수있다. </li><li> 주입을위한 MB49 세포를 준비합니다. 세포는 T-2 당 1 × 10 6시에 도금했다5 플라스크 48 시간 주입하기 전에 (1.1 단계). <ol><li> 용지를 제거하고 플라스크에 0.25 % 트립신의 500 μl를 추가합니다. 세포는 세포를 재현 탁하는 완전한 DMEM 5 ㎖를 추가 분리합니다. 카운트 50 μL 나누어지는을 제거하고 5 분 동안 1,000 rpm에서 나머지 부분을 원심 분리기. 원심 분리 단계에서 단계 1.12.2 및 1.12.3를 계속합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 세포 / ml을 계산합니다. 그런 다음 4 × 106 세포 / ml (50 μL 당 2 × 105 세포)에 세포 펠렛을 가지고 필요한 부피를 계산한다. </li><li> 원심 분리하여 세포로부터 상등액을 따르고 (단계 1.12.2에서 계산 된) 4 × 106 세포 / ml의 세포를 중단하는 데 필요한 양을 사용 DMEM 기초 배지에서 펠렛을 재현 탁. 상온에서 전지를 보관하십시오. </li></ol></li><li> 방광의 트립신 처리를위한 15 분의 시점에 도달하면, 위치에 카테터를두기 카테터로부터 공기가 채워진 주사기를 분리. 소비 트립신은 정상적인 것LY는 카테터를 통해 역류. 위의 단계 1.9에서와 같이 P200의 피펫과 흡입에 의해 방광에 남아있는 트립신을 제거하고 폐기. </li><li> 즉시 카테터의 허브로 MB49 세포 현탁액의 50 μl를 피펫. 카테터의 허브에 1 ㎖의 공기 채워진 주사기를 연결하고 천천히 플런저 0.1 ~ 0.2 ML을 눌러서 방광 세포를 제공합니다. 다섯 쥐를 이식하는 네 개의 추가 시간에이 단계까지를 반복합니다. 사용하지 않는 세포를 폐기하십시오. </li><li> 장소에 카테터 주사기 어셈블리를 떠나, 세포가 50 분 동안 방광에 거주 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 요도에서 카테터 주사기 어셈블리를 철회. 제로 이소 플루 란의 농도를 설정하고 각 마우스에게 인치 떨어져 가열 패드에 복구하는 노즈콘에서 두 이동합니다. </li><li> 마우스는 복원력 반사을 회복했을 때, 케이지로 돌아갑니다. </li></ol> 2. (8 일 세포의 주입 후) 아데노 바이러스의 방광 배달 </p&gt; 주의 : 프로토콜의이 부분은 감염원이다 아데노 바이러스를 사용하고 엄격한 BSL2의 지침에 따라 처리해야합니다 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/). 감염원으로 수행되는 모든 절차는 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 기관 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었다. <ol><li> 여덟 일 MB49 세포와 생쥐를 주입 한 후, 혈뇨를 확인합니다. 흡수 흰색 종이 조각에 개별 동물을 들고 부드럽게 용지에 소변 방울을 지워 버리 복부에 키를 누릅니다. 빨간색 분홍색 소변 혈뇨를 나타내고 종양​​이 설정 한 기호입니다. 종양 포획 율은 80 % 이상이고 우수한 기술로 100 %만큼 높을 수있다. </li><li> 얼음에 아데노 바이러스 주식을 해동 및 살균, 실내 온도 PBS에서 10 9 PFU/50 μL (2 × 10 10 PFU / ㎖)로 희석. </li><li> 위의 단계의 1.3-1.6에서 설명한대로 마우스를 마취. </li><li> 단계 1.8에서 설명한대로 마우스를 카테 테르를 꽂다 단계 1.9에서와 같이 소변을 제거 </li><li> 소변이 제거되면, 즉시 카테터 허브에 바이러스 현탁액 50 μL 피펫. 카테터의 허브에 1 ㎖의 공기 채워진 주사기를 연결하고 천천히 플런저 0.1 ~ 0.2 ML을 눌러서 방광에 바이러스를 전달합니다. </li><li> 장소에 카테터 주사기 어셈블리를 떠나, 바이러스가 40 분 동안 방광에 거주 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 요도에서 카테터 주사기 어셈블리를 철회하고, 남아있는 바이러스를 불 활성화하기 위해 10 % 표백제 용액에 버린다. </li><li> 제로 이소 플루 란의 농도를 설정하고 각 마우스에게 인치 떨어져 가열 패드에 복구하는 노즈콘에서 두 이동합니다. </li><li> 마우스는 복원력 반사을 회복했을 때, 케이지로 돌아갑니다. </li><li> 생쥐를 나타내는 마크 케이지는 아데노 바이러스에 주입되었다. 바이러스는 몇 일 동안 케이지 침구에 비춰되고 모든 케이지와 침구해야처리하고 적절하게 소독. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 프로토콜에 설명 된 기본 방법은 세포의 점안 또는 방광 상피 세포에 로컬 배달을위한 모든 에이전트에 대한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 마우스 방광의 도관이다. 위에 설명 된 특정 프로토콜 단기 연구 (일 ~ 10 일)에 최적화되어 있습니다. 높은 휴대폰 번호로 인해 큰 종양 부담이 더 빠른 종양의 성장 가능성이 동물의 손실을 초래할 것이기 때문에 세포의 정확한 수를 주입하는 것은 매...

방광암 2012 년 1 예상 거의 75,000의 새로운 사례 및 15,000의 죽음과 비뇨 생식기 계통의 두 번째 가장 흔한 암입니다. 재발의 높은 비율은 방광암 치료하는 비싼 암 중 하나를 만드는 평생 추적 관찰이 필요합니다. 근육 층을 침범 방광 암은 림프 시스템을 통해 간, 폐 또는 뼈에 전이 할 수 있습니다. 오년 후 만 20-40% 생존 고급 종양 결과의 복합 치료. 따라서, 표면 방광암의 재발과 진행을 감소뿐만 아니라 고급 질환 환자의 치료 결과를 개선하기위한 효과적인 치료 전략이 절실히 필요합니다. 새로운 치료제의 개발은 초기 체외 평가를 다음과 같은 효능을 평가하는 전임상 모델을 필요로한다. 종양 미세 환경은 크게 preclinic 대한 필요성을 강조하는, 암 발생과 응답에 영향을 미칠 수있다종양이 발생하거나하는 알 모델 출신의 기관에 설립 할 수있다. 한 가지 방법은 종양이 자연적으로 발생하거나 장기 고유하게 유도 될 수있는 트랜스 제닉 모델의 개발이다. 형질 전환 방광암 모델의 우수한 프로토콜은 최근 2를 발표하고있다. 형질 전환 모델의 단점은 종양이 천천히 원하는 것보다 적은 균일 개발하는 경향이있다. 또, 번식지를 유지하는 비용을 고려하여야한다. 트랜스 제닉 모델 대안 시판 마우스에서 종양 확립 짧은 타임 프레임의 이점이 종양 세포의 동 소성 이식이다. 일부 인간 방광암 세포주 orthotopically 성장 될 수 있지만 (우리가 성공적 UM-UC-3 사용한)는 면역 적격 마우스에서 종양을 확립하는 것이 바람직 할 수있다. orthotopically 성장 두 뮤린 방광암 세포주, MBT-2 및 MB49 3이다. MBT-2 세포 복제로 오염되어 있기 때문에C 레트로 바이러스 4를 입력, 우리는 우리의 연구에 MB49 세포를 선택했습니다. 그것은 MB49 세포가 수컷 마우스에서 분리하여 소성을 착상은 암컷 생쥐에서 수행 해부학 이유입니다 된 것을주의하는 것이 중요합니다. 이것은 Y 염색체의 마커에 의해 이식 된 세포를 쉽게 식별의 장점을 가지고 있지만, 성별이 일치 면역 학적 연구를위한 단점이 될 수 있습니다. 방광 상피 세포는 미생물에 의해 감염에 대한 장벽으로 기능하는 글리코 사 미노 글리 칸 (GAG) 층으로 늘어서있다. 이 장벽은이 어려움 (표 1)을 극복하기 위해 개발 된 종양 세포와 여러 가지 방법의 주입을 방해 할 수있다. 전기 소는 GAG 층 5-13 및 프로토콜을 설명하는 전기 소는 최근 조브 (14)에 게시 된을 방해하는 물리적 수단으로 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 전기 소 장치를 사용할 수 없게한다, 화학 G를 파괴하는 것을 의미한다질산은 또는 폴리-L-라이신 등 AG 층은 15-24 사용될 수있다. 종양은 질산은의 작은 양으로 방광의 짧은 노출에 의해 효과적으로 성립 (5-10 μL, 0.15-1.0 M ~ 10 초) 또는 폴리-L-라이신으로 긴 콘택트 (0.1 ㎎ / ㎖의 100 μL 20 분 동안) (표 1). 여기에서 우리는 MB49 세포의 주입을 용이하게하기 위해 트립신을 사용하는 방법을 설명합니다. 방광암 치료 방법을 개선하기위한 시도에서, 유전자 치료는 상당한 관심을 얻고있다. 보기의 임상 적 관점에서 방광 암으로 인해 쉽게 기관의 접근성 및 로컬 페이로드를 전달하는 기능을 유전자 치료를위한 이상적인 대상입니다. 방광 암 유전자 치료되었습니다 탐험 바이러스 벡터는 콜리 틱 단순 헤르페스 바이러스 25, 레트로 바이러스 26, 카나리 발진 바이러스 27, 우두 바이러스, AAV, 및 adenoviru 마련되어28의. 우리 프로토콜의 두번째 부분에서, 우리는 종양 세포의 점적 거의 동일하다 바이러스 전달하기위한 방법을 설명한다. 우리의 실험실에서 관심을 우리는 루시퍼 라제 유전자를 표현하는 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 생물 발광을 통해 평가 유전자 전달에 대한 새로운 접근 방식의 개발이다. 그러나, 방광 카테터 삽입의 방법은 여러 에이전트의 전달에 사용하기 때문에 광범위한 응용이 될 수있다.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			Name of reagent
			</td>
			<td style="height:25px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			Catalog number
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:40px;">
			6-8 week old female mice
			</td>
			<td style="height:40px;">
			Jackson Laboratories
			</td>
			<td style="width:188px;height:40px;">
			Strain Name: C57BL/6J
			Stock Number: 000664
			</td>
			<td style="width:193px;height:40px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			Trypsin*
			</td>
			<td style="height:25px;">
			MediaTech
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			MT25-053-CI
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			DMEM*
			</td>
			<td style="height:25px;">
			MediaTech
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			MT10-017-CV
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			FBS
			</td>
			<td style="height:25px;">
			Hyclone
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			SH30071.03
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Heat-inactivated
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			T25 flasks*
			</td>
			<td style="height:25px;">
			Corning Costar
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			Corning No.:3056
			Fisher: 07-200-63
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:42px;">
			MB49 cells
			</td>
			<td style="height:42px;">
			N/A
			</td>
			<td style="width:188px;height:42px;">
			N/A
			</td>
			<td style="width:193px;height:42px;">
			Obtained from Dr. Boehle (see reference11)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:46px;">
			Puralube Vet Ointment*
			</td>
			<td style="height:46px;">
			Pharmaderm
			</td>
			<td style="width:188px;height:46px;">
			Henry Schein Company
			No.:036090-6050059
			Fisher: NC9676869
			</td>
			<td style="width:193px;height:46px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:53px;">
			Depilatory cream: Veet
			</td>
			<td style="height:53px;">
			local pharmacy
			</td>
			<td style="width:188px;height:53px;">
			
			</td>
			<td style="width:193px;height:53px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:53px;">
			Lubricant:
			K-Y Jelly
			</td>
			<td style="height:53px;">
			local pharmacy
			</td>
			<td style="width:188px;height:53px;">
			
			</td>
			<td style="width:193px;height:53px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:72px;">
			Catheters*
			</td>
			<td style="height:72px;">
			Exel International
			</td>
			<td style="width:188px;height:72px;">
			Exel International
			No.:26751;
			Fisher: 14-841-21
			</td>
			<td style="width:193px;height:72px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:45px;">
			Isoflurane
			</td>
			<td style="height:45px;">
			Terrell
			</td>
			<td style="width:188px;height:45px;">
			NDC 66794-011-25
			</td>
			<td style="width:193px;height:45px;">
			Obtained though hospital pharmacy
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:52px;">
			1 ml slip tip TB syringes
			</td>
			<td style="height:52px;">
			Becton Dickinson
			</td>
			<td style="width:188px;height:52px;">
			BD309659
			Fisher:14-823-434
			</td>
			<td style="width:193px;height:52px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">
			D-Luciferin
			</td>
			<td style="height:27px;">
			Gold Biotechnologies
			</td>
			<td style="width:188px;height:27px;">
			L-123-1
			</td>
			<td style="width:193px;height:27px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:76px;">
			Ad-CMV-Luc
			</td>
			<td style="height:76px;">
			VectorBiolabs
			</td>
			<td style="width:188px;height:76px;">
			1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use
			</td>
			<td style="width:193px;height:76px;">
			Infectious agent that requires BSL2 containment
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:76px;">
			Steady-Glo&#160;Luciferase Assay System
			</td>
			<td style="height:76px;">
			Promega
			</td>
			<td style="width:188px;height:76px;">
			E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)
			</td>
			<td style="width:193px;height:76px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*available through multiple vendors



EQUIPMENT
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:97px;">
			Material name
			</td>
			<td style="width:114px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:330px;">
			Catalog number
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:97px;">
			Anesthesia system
			</td>
			<td style="width:114px;">
			E-Z Systems, Euthanex Corporation
			</td>
			<td style="width:330px;">
			Anesthesia system: EZ7000
			5-port mouse rebreathing device: EZ109
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:97px;">
			Xenogen IVIS 200
			</td>
			<td style="width:114px;">
			Caliper Life Sciences
			</td>
			<td style="width:330px;">
			http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:97px;">
			FLUOstar Optima
			</td>
			<td style="width:114px;">
			BMG Labtech
			</td>
			<td style="width:330px;">
			http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies

방광암은 비뇨 생식 기관 및 재발과 진행이 필요 줄일 수있는 새로운 치료 방법의 두 번째로 가장 흔한 암입니다. 종양 미세 환경은 크게 종양 발달과 치료 반응에 영향을 미칠 수있다. 그것은 그들이 시작된 장기에 종양 세포를 성장하는 것이 종종 바람직하다. 이 프로토콜은 MB49 쥐의 방광 암 세포를 카테터를 통해 방광에 주입되는 방광암의 소성을 모델에 대해 설명합니다. 이 모델이 성공적으로 종양 세포 주입이 물리적 또는 화학적 수단에 의해 달성 될 수있는 글리코 사 미노 글리 칸의 보호 층의 중단을 요구한다. 우리의 프로토콜에서 방광 전에 세포 점안에 트립신 처리됩니다. 방광의 카테터는 또한 종양이 확립되고 나면 치료제를 전달하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 루시 페라 제 리포터 유전자를 표현하는 아데노 바이러스 구조의 전달을 설명합니다. O 동안UR 프로토콜 단기 연구에 최적화 및 유전자 전달에 초점을 맞추고있다, 마우스 방광 카테터 삽입의 방법은 광범위한 응용 프로그램을하고 있습니다.

혈뇨는 200,000 MB49 세포의 주입 후 팔일 이내에 거의 모든 마우스에서 관찰된다. 그림 1에서와 같이 34.7 ± 3.3 밀리그램에서 두 배 이상, 방광의 무게 이상 (범위 31-37 ㎎, N = 4) nontumor 87.5 ± 19.2 mg의 마우스 베어링 (범위 77-120 ㎎, N = 10)에서 마우스의 그 MB49 세포로 이식되었다. 유전자 전달의 측면에서, 우리는 쥐에게 24 시간 결상 바이러스 점안 48 시간 (그림 2) 후보다 더 강한 ...

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An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

기원의 장기에 암 세포의 주입은 새로운 치료법을 평가하는 유용한 전임상 모델이 될 수 있습니다. MB49 방광 암 세포가 방광 내 점적 다음 방광 내에서 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 종양 이식 및 아데노 바이러스 전달의 목적을 위해 마우스 방광 카테터를 보여준다.

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K 조회수.  Medical University of South Carolina.  기원의 장기에 암 세포의 주입은 새로운 치료법을 평가하는 유용한 전임상 모델이 될 수 있습니다. MB49 방광 암 세포가 방광 내 점적 다음 방광 내에서 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 종양 이식 및 아데노 바이러스 전달의 목적을 위해 마우스 방광 카테터를 보여준다. 

비디오: An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

환자 조직 및 유전자 전달의 시험 전의 VIVO 문화

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

연구

의학

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Murine 방광 암의 Orthotopic 모델

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Orthotopic 마우스 뇌종양 모델의 조합 방사선 치료

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Orthotopic 방광 종양 모델 및 Intravesical saRNA 트리 트먼트의 평가

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

역 형성 갑상선 암의 동소 마우스 모델

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

췌장암의 진행 발광 동소 모델

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.