Nous remercions Fumi Kubo, Tod Thiele et HerwigBaier (UCSF / Institut Max Planck) pour obtenir des conseils sur des expériences de comportement et DPSS laser mis en place; Heesoo Kim et Chiara Cerri du parcours de MBL Neurobiologie pour aider à Chef-tdTomato expériences; PetronellaKettunen (Université de Göteborg ) pour la collaboration initiale sur les expériences optogenetic; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike et John Milligan Baca (UCLA) pour obtenir des conseils techniques, et Roger Tsien (UCSD) pour le chef-tdTomato construire. Ce travail a été soutenu par un NRSA (5F31NS064817) prix à AMSP et une subvention de la NSF (RIG: 0819010) à l&#39;AS.

Préparez les éléments suivants à l&#39;avance. 1. Préparer câble optique <ol><li> Créer une unité de stockage pour le câble optique en faisant fondre le col effilé d&#39;une pipette Pasteur en verre sur un bec Bunsen à créer un angle de 150 °. </li><li> En utilisant une pince coupante ou une lame de rasoir, coupez soigneusement le câble optique en deux morceaux. Chaque pièce doit avoir une extrémité avec un FC / PC adaptateur et une extrémité exposée. Stocker une seule pièce comme un câble de réserve. </li><li> Dénuder le câble optique vers le revêtement en enlevant la gaine de fibre et de fibres de renforcement (figure 1A) à partir de 5,0 cm de coupe d&#39;extrémité du câble. </li><li> Insérez le câble optique dans préparées pipette Pasteur. Assurez-vous que le câble peut facilement se déplacer dans et hors de la pointe de pipette. </li><li> Avec le câble optique en saillie de l&#39;extrémité de la pipette Pasteur, découpez soigneusement et retirez gaine de la fibre de partout fibre de verre, ~ 2 mm du bout coupé. </li><li> L&#39;utilisation de diamants stylo / tailleur de verre, la fibre de verre pseudo et briser off l&#39;extrémité de créer une coupe nette / surface à l&#39;extrémité de la fibre (figure 1B). </li><li> Rentrer câble optique dans une pipette Pasteur pour le stockage. Répétez l&#39;étape (1,6) si l&#39;extrémité de la fibre optique se ébréchée ou les pauses de façon inégale. </li><li> Position du câble optique dans une pipette Pasteur en utilisant un micromanipulateur (figure 1C). </li></ol> Procédures 2-8 décrivent un procédé d&#39;injection de transgènes dans des embryons généralement applicables aux expériences de poisson zèbre nombreux. Des variantes de cette méthode, comme celles décrites dans d&#39;autres vidéos Jove 6, 7, 8, 9, 22 sont tout aussi efficaces. 2. Tirer aiguilles d&#39;injection <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un tire-aiguille, tirez un tube de verre borosilicate en deux aiguilles d&#39;injection avec une pointe de diminuer progressivement. Extracteur paramètres varient. (Sur un extracteur d&#39;aiguilles Sutter Instruments, nous utilisons les paramètres: P = 500, chaleur = 720, Pull = 50, vitesse = 70 et de l&#39;heure = 150). Chaque extracteur d&#39;aiguilles est différent, donc d&#39;optimiser les paramètres de traction emempiriquement. Pour plus d&#39;aiguilles effilées, augmenter la chaleur et / ou tirer. Pour aiguilles coniques moins, augmenter le temps et / ou Pull baisse. </li><li> Aiguilles Stocker dans un conteneur sécurisé (soit une boîte de Pétri avec du ruban laminé, sur le côté adhésif). </li></ol> 3. Verser moules d&#39;injection <ol><li> Faire fondre 0,5 g d&#39;agarose dans 30 ml d&#39;embryon / eau bleue, jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose soit complètement dissous. </li><li> Verser dans la moitié inférieure de la boîte de Pétri. </li><li> Placez moule rectangulaire avec fixation puits (figure 2) en agarose, en prenant soin de limiter la formation de bulles autour des puits. </li><li> Permettre d&#39;agarose à se solidifier. </li><li> Retirer du moule et remplir boîte de Pétri avec du bleu / eau embryon. </li><li> Conservez-les debout, rempli avec de l&#39;eau propre, à la température ambiante pour le jour même ou à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 4. Assurez-Mix ADN plasmidique pour préparations injectables <ol><li> Diluer l&#39;ADN plasmidique à une concentration de 50 ng / ul avec rouge de phénol à 1:10 dans ddH 2 O. Pourexemple: <table border="1"><tbody><tr><td> 1,0 ml </td><td> ADN plasmidique (250 ng / ml) </td></tr><tr><td> 0,5 ml </td><td> rouge phénol </td></tr><tr><td> 3,5 ml </td><td> ddH 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> Mélange d&#39;ADN peuvent être conservés à température ambiante si vous utilisez immédiatement ou conservés à 4 ° C pendant plusieurs jours. </li></ol> 5. Mettre en place paires d&#39;accouplement Cela devrait être fait le soir avant de vous envisagez de faire des injections. <ol><li> Remplir les réservoirs d&#39;élevage avec de l&#39;eau du système et le lieu poissons mâles et femelles ensemble. Si les injections ne peut être effectuée dès que s&#39;allument dans l&#39;établissement, distinct poissons mâles et femelles avec un diviseur. </li></ol> 6. Préparer pour préparations injectables (Peut être fait dans l&#39;attente d&#39;embryons) <ol><li> Mettez la pression d&#39;injection plate-forme. Assurez-vous que le système est mis à pulser. Commencez par le jeu durée d&#39;impulsion à 1. </li><li> Ouvrir le robinet et AIRRégler la pression d&#39;injection à environ 20 psi. </li><li> En utilisant un microscope à dissection au plus fort grossissement, briser pointe de l&#39;aiguille avec une pince ou un tisonnier pour créer une ouverture ~ um 2 (figure 3, Film 1). </li><li> Remplir avec le mélange de l&#39;ADN aiguilles par: 1. Placer le côté de la pointe d&#39;aiguille, le haut, dans le mélange d&#39;ADN et de laisser l&#39;aiguille remplir par capillarité ou 2. En utilisant une pointe longue portée à pipeter 1-2 pl de l&#39;ADN mélanger directement dans l&#39;aiguille. </li><li> Endroit rempli aiguille dans un endroit sûr avant d&#39;être prêt à injecter. </li></ol> 7. Recueillir des embryons <ol><li> Après l&#39;installation lumières ont allumé, retirez diviseurs (le cas échéant). Recueillir des embryons avec une passoire / tamis petites et les transférer sur une boîte de Pétri avec du bleu frais / eau embryon. </li></ol> 8. Injecter embryons au stade 1-2 cellules <ol><li> Transfert d&#39;embryons récoltés pour moules d&#39;injection en utilisant une pipette en plastique. </li><li> En utilisant un microscope à dissection, poussez doucement embryons danspuits avec une pince ou un tisonnier contondant (figure 4, Film 2). </li><li> Placez aiguille chargée dans un micromanipulateur et la position sur les embryons. </li><li> Calibrer le volume d&#39;injection en ajustant la durée d&#39;impulsion de 1 par incréments jusqu&#39;à obtenir le volume souhaité (~ 1 nl). Cela pourrait être étalonné avec un micromètre, tel que décrit dans une des vidéos précédentes Jove 8, 22, mais pour cette précision expérience n&#39;est pas nécessaire, car un grand nombre de volumes d&#39;injection se traduira par une expression adéquate. </li><li> Injecter environ 1 nl ADN mélanger directement dans la cellule et répétez l&#39;opération pour tous les embryons. L&#39;ADN peut également être injecté dans le jaune, mais cela tend à être moins efficace (Figure 5, Film 3). </li><li> Retirer embryons injectés de moule à l&#39;aide d&#39;un léger courant d&#39;un bleu / eau embryon. </li><li> Magasin injecté embryons à 28,5 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirez non fécondés, les embryons endommagés ou morts périodiquement. </li><li> Traiter embryons wie PTU entre 18-24 hpf pour prévenir la pigmentation. </li></ol> 9. Ecran pour l&#39;expression du transgène <ol><li> Manuellement dechorionate 24-48 embryons HPF aide d&#39;une pince. </li><li> Anesthésier les larves en utilisant 0,02% tricaïne. </li><li> En utilisant un microscope à fluorescence de dissection, identifier les larves avec RB ou l&#39;expression faciale des neurones et les transférer vers un nouveau plat avec des produits frais PTU bleu / embryons eau. Embryons avec une expression rare dans les cellules facilement identifiables sont optimales, mais les neurones individuels seront ciblés pour l&#39;activation d&#39;un câble à fibre optique ainsi un large éventail de la densité d&#39;expression est acceptable. </li><li> Embryons Boutique à 28,5 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce stade de l&#39;expérimentation souhaitée. </li></ol> 10. Montez les larves pour les expériences de comportement <ol><li> Assurez 1,5% d&#39;agarose bas point de fusion dans le trou DDH 2 O et le ranger dans un bloc de 42 ° C de chaleur pour l&#39;empêcher de se solidifier. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un pipette Pasteur en verre, le transfert de l&#39;un des larves pré-sélectionnés dans une baignoiree de 1,5% d&#39;agarose à bas fondue avec aussi peu bleu / embryon d&#39;eau que possible. </li><li> Transfert des larves dans une goutte d&#39;agarose sur une petite boîte de Petri. </li><li> Sous une loupe binoculaire, jusqu&#39;à la position dorsale larve. </li><li> Lorsque agarose est solidifié, couper le agarose avec une lame de rasoir mince (# 11 scalpel), en laissant un coin de la gélose autour de la larve entière. </li><li> Effectuer deux coupes en diagonale de chaque côté du jaune, prenez soin de ne pas entailler la larve. </li><li> Remplir la zone entourant l&#39;embryon d&#39;agarose / eau bleue. </li><li> Tirez agarose loin du tronc et de la queue de la larve (figure 6). </li></ol> 11. Préparer Caméras grande vitesse et du logiciel d&#39;imagerie <ol><li> Montez à haute vitesse caméra sur la dissection étendue. </li><li> Connectez l&#39;appareil photo à l&#39;ordinateur. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur. </li><li> Allumez caméra haute vitesse. </li><li> Ouvert vidéo / logiciels d&#39;imagerie (Nous utilisons un logiciel d&#39;imagerie AOS et décriront les procédures pour l&#39;utiliser ici, mais d&#39;imagerielogiciel est également acceptable). </li><li> Réglez les paramètres de la caméra en conséquence (soit 1.000 images par seconde (fps), le tampon de déclenchement de 50% ou d&#39;autres paramètres de préférence). </li><li> Démarrez l&#39;enregistrement. </li></ol> 12. Activer neurones unique à l&#39;aide d&#39;un laser nm 473 <ol><li> Fixez stimulateur, laser et optiques. </li><li> Mettez le stimulateur. </li><li> Stimulateur fixé à un maximum de 5 volts et une durée d&#39;impulsion de 5 ms. </li><li> Allumez le laser selon les instructions du fabricant. </li><li> Utiliser un microscope à dissection de positionner la pointe du câble optique près du corps cellulaire d&#39;un neurone avec le chef-tdTomato expression (Figure 6). </li><li> Livrer impulsion de lumière bleue pour activer des neurones sensoriels. </li><li> Comportement d&#39;enregistrement à l&#39;aide d&#39;une caméra à grande vitesse fixée à 500 ou 1000 images par seconde. </li><li> Répétez l&#39;expérience en tant souhaitée, attendre 1 min entre chaque activation afin d&#39;éviter l&#39;accoutumance. (On enregistrer au moins trois réponses pour chaque neurone). </li><li> Àlarves libération, essayer de séparer les agarose avec une pince, en prenant soin de ne pas blesser l&#39;animal. Cet animal peut être autorisé à développer davantage et la procédure peut être répétée à une ancienne étape pour caractériser le développement du comportement. L&#39;embryon peut également être remonté à haute résolution imagerie confocale de la cellule activée pour corréler le comportement de la structure cellulaire, comme décrit ci-dessous. </li><li> Transfert larve de plaque de culture avec du bleu frais / eau embryon. Nous utilisons une plaque de 24 puits de garder une trace des larves individu. </li></ol> 13. Image Neuron (s) avec un microscope confocal <ol><li> Anesthésier les larves avec 0,02% tricaïne. </li><li> Larves de montage, la face dorsale en place, en 1,2% d&#39;agarose à bas ou à l&#39;état fondu dans un moule dorsale. </li><li> Image Chef-tdTomato neurones avec un laser 543 nm et d&#39;un filtre appropriée et objective. Nous utilisons un objectif 20x. </li><li> Retirer les larves d&#39;agarose et revenir à l&#39;individu bien avec le bleu / eau embryon. </li><li> Entreposer à 28,5 ° C dans l&#39;obscurité pendant fuanalyse rther. </li></ol>

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Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun intérêt financier concurrent.

Nous avons décrit une approche pour l&#39;activation des neurones optogenetic RB simples chez le poisson zèbre en direct. Notre méthode utilise la transgenèse transitoire pour exprimer une variante marquées par fluorescence channelrhodopsin, chef-tdTomato 13, dans certains neurones somatosensoriels. Cette approche pourrait être facilement adapté pour une utilisation dans d&#39;autres larves de poisson zèbre populations cellulaires. En utilisant cette approche nous avons to...

Le développement de méthodes optogenetic pour favoriser ou inhiber l&#39;excitabilité neuronale des longueurs d&#39;onde de la lumière défini a permis d&#39;étudier la fonction des populations distinctes de neurones dans les circuits neuronaux contrôlant le comportement 1, 19, 21. Cette technique est souvent utilisée pour activer des groupes de neurones, mais il peut aussi être utilisé pour activer des neurones individuels. Embryons de poisson zèbre sont particulièrement favorables à ces méthodes car elles sont translucides, leur système nerveux se développe rapidement, et la création d&#39;animaux transgéniques est rapide et la routine. Toutefois, d&#39;importants obstacles techniques doivent être surmontés pour atteindre de manière fiable activation seul neurone. Pour optimiser une procédure pour l&#39;activation des neurones optogenetic poisson zèbre simples, nous nous sommes concentrés sur les neurones somatosensoriels. Embryons de poisson zèbre détecter une variété de stimuli somatosensoriels l&#39;aide de deux populations de neurones: les neurones du trijumeau, qui innervent la tête, et Rohon-Barbe (RB), les neurones qui innervent le reste du corps. Chaque neurone du trijumeau et RB projette un axone périphérique qui se ramifie abondamment dans la peau pour détecter des stimuli et un axone central qui se connecte à circuits neuronaux en aval. Animaux réagissent au toucher dès 21 heures après la fécondation (HPF), indiquant que les circuits cohérents somatosensoriels ont formé 5, 18. Au cours du développement larvaire au moins une synapse du trijumeau et RB neurones sur la cellule de Mauthner pour activer réactions de fuite classiques, mais l&#39;accumulation de preuves suggère qu&#39;il existe plusieurs classes de neurones somatosensoriels avec différents modèles de connectivité qui peuvent susciter des variations sur le comportement Escape 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Notre motivation pour développer cette méthode était de caractériser la fonction du comportement des différentes classes de neurones somatosensoriels, mais cette approche pourrait en principe être utilisée pour étudier la fonction des neurones presque toute ou d&#39;une population de neurones dans larval poisson zèbre. Douglass et al. Précédemment décrit un procédé d&#39;activation channelrhodopsin-2-exprimer neurones somatosensoriels avec la lumière bleue, provoquant 3 Comportement fuite. Leur approche utilisée un élément activateur du gène Isl1 pour diriger l&#39;expression de ChR2-EYFP dans les neurones somatosensoriels. Ce transgène, cependant, a été signalé pour afficher une fluorescence relativement faible, ce qui nécessite la co-injection d&#39;un deuxième rapporteur, SAMU :: GFP, pour permettre la visualisation des cellules exprimant ChR2-EYFP. Cette approche a été utilisée pour obtenir des réponses de comportement entre 24-48 hpf, mais n&#39;a jamais pu obtenir une réponse cours des dernières 72 hpf. Ainsi, bien que cette méthode fonctionne pour l&#39;étude de circuits neuronaux à très premiers stades larvaires (24-48 hpf), elle est insuffisante pour caractériser les circuits neuronaux et des réponses comportementales dans les larves plus âgées, quand plus diverses réactions comportementales sont apparentes et les circuits neuronaux sont plus matures. Nous avons cherché àaméliorer la sensibilité de cette technique dans le but de caractériser la fonction de sous-populations de neurones RB larvaires. Pour améliorer l&#39;expression on utilise un activateur spécifique somesthésiques (CREST3) 20 pour diriger l&#39;expression de LexA-VP16 et un tronçon de séquences d&#39;opérateurs LexA (4xLexAop) 11 pour amplifier l&#39;expression d&#39;un marquées par fluorescence canal activé par la lumière. Cette configuration amplifié expression du canal, ce qui élimine la nécessité d&#39;une co-expression d&#39;un journaliste de seconde et qui nous permet de déterminer directement l&#39;abondance relative de la voie dans chaque neurone. En utilisant la séquence LexA / LexAop a l&#39;avantage supplémentaire de permettre d&#39;introduire le transgène dans des lignes de reporter poisson zèbre qui utilisent le système Gal4/UAS. L&#39;expression transitoire de ce transgène donné lieu à différents niveaux d&#39;expression, mais était généralement assez robuste pour visualiser à la fois le corps cellulaire et les projections axonales des neurones individuels sur plusieurs jours. Pour optimiser la sensibilitélité à la lumière, nous avons utilisé la lumière activée canal chef, une variante channelrhodopsin constitué d&#39;une chimère de channelopsin-1 (Chop1) et channelopsin-2 (Chop2) avec un site de liaison à une hélice boucle EF 13. Ce canal est activé à la même longueur d&#39;onde que ChR2, mais nécessite plus faible intensité lumineuse pour l&#39;activation, la rendant plus sensible que les autres canaux couramment utilisés, y compris ChR2. La protéine chef était fusionnée à la protéine fluorescente rouge, tdTomato, ce qui nous permet de cribler l&#39;expression de protéines sans activer le canal. Comme une source de lumière, nous avons utilisé un pompé par diode à semi-conducteurs (DPSS) laser couplé à un câble à fibre optique pour offrir une précision, une grande puissance d&#39;impulsion de lumière bleue à une région spécifique des larves. Cela nous a permis de focaliser la lumière laser sur les neurones individuels, éliminant ainsi la nécessité de trouver de rares animaux transgéniques exprimant le canal en un seul neurone. En utilisant cette approche, nous avons réussi à activer les neurones RB simples, enregistrer la réponse comportementales avec une caméra vidéo à grande vitesse, et les neurones d&#39;image à haute résolution activés par microscopie confocale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Matériels </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur en verre </td><td> Pêcheur </td><td> 1367820B </td><td> ou équivalent (10-15 mm de diamètre) </td></tr><tr><td> 200 fibres optiques pm </td><td> THORLABS </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Cordon de brassage, Longueur: 3 m, Fin A: FC / PC, Fin B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> Fibre de 50 um optique </td><td> THORLABS </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Cordon de brassage, Longueur: 3 m, Fin A: FC / PC, Fin B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> Outil à dénuder réglable </td><td> THORLABS </td><td> AFS900 </td><td> ou trois trous Outil à dénuder (FTS4) </td></tr><tr><td> Scribe Wedge diamant </td><td> THORLABS </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipette Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Tubes en verre borosilicate avec filament </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moule d&#39;injection </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Figure 5 </td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 ml à centrifuger </td><td> Tout </td><td> Tout </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de Petri (100x15 mm) </td><td> Tout </td><td> Tout </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de Petri (60x15 mm) </td><td> Tout </td><td> Tout </td><td></td></tr><tr><td> Pression d&#39;injection </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Micromanipulateur et le métal support </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Pipettes en plastique </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Poker (support de broches et la broche d&#39;insectes) </td><td> Fin Sciences Tools, Inc </td><td> 26018-17 26000-70 et </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Fin Sciences Tools, Inc </td><td> 11255-20 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Microloader pointes de pipette </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28,5 ° C incubateur </td><td> tout </td><td> tout </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C bloc chauffant </td><td> Tout </td><td> Tout </td><td></td></tr><tr><td> Non stériles lames de scalpel n ° 11 </td><td> Beaux-outils scientifiques, Inc </td><td> 10011-00 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Dissection sfaire face </td><td> Zeiss </td><td> Stemi </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Fluorescent microscope à dissection avec filtre standard </td><td> Tout </td><td> tout </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 ou 710 </td><td> ou des objectifs équivalents avec des lasers pour la GFP et RFP, et 10x, 20x et 40x </td></tr><tr><td> Caméra à haute vitesse </td><td> AOS Technologies, Inc </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> 473 nm laser portable </td><td> Lasers à cristaux </td><td> CL-473-050 </td><td> ou plus de puissance, avec l&#39;option TTL </td></tr><tr><td> S48 Stimulator </td><td> Astro-Med, Inc division Grass Instrument </td><td> S48K </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> FC / PC pour manchon d&#39;accouplement FC / PC </td><td> THORLABS </td><td> ADAFC1 </td><td> Mai need pour le raccordement du câble optique </td></tr><tr><td> Lunettes de sécurité laser </td><td> THORLABS </td><td> LG10 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> 24 plaques de culture </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Diapositives dépression simples </td><td> Pêcheur </td><td> S175201 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Les écosystèmes aquatiques </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Le bleu de méthylène </td><td> Pêcheur </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> ou l&#39;équivalent </td></tr><tr><td> Low Melt agarose </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; ou équivalent </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaïne </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> eau bleu / embryon </td><td></td><td></td><td> 10 L ddH 2 O 0,6 g Instant Ocean 6 gouttes de méthylène bleu </td></tr><tr><td> rouge phénol </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml dans 0,2 M KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml ddH 2 O dissoudre à 70 ° C, agiter souvent aliquote et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml bleu / poissons d&#39;eau </td></tr><tr><td> Tricaïne solution mère </td><td></td><td></td><td> 400 mg tricaïne 97,9 ddH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml Tris 1 M, pH 9,0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; ajuster le pH à ~ 7,0 magasin à 4 ° C ou à -20 ° C pour le stockage à long terme </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Le poisson-zèbre larvaires sont en train de devenir un modèle pour décrire le développement et la fonction de simples circuits neuronaux. En raison de leur fécondation externe, développement rapide, et la translucidité, le poisson zèbre sont particulièrement bien adaptés pour les approches optogenetic pour étudier la fonction des circuits neuronaux. Dans cette approche, les canaux ioniques sensibles à la lumière sont exprimés dans les neurones spécifiques, permettant à l&#39;expérimentateur d&#39;activer ou d&#39;inhiber les modifier à volonté et ainsi évaluer leur contribution à des comportements spécifiques. L&#39;application de ces méthodes chez le poisson zèbre larvaire est conceptuellement simple mais nécessite l&#39;optimisation des détails techniques. Ici, nous démontrons une procédure pour exprimer une variante channelrhodopsin dans les neurones somatosensoriels larves de poisson zèbre, photo-activation des cellules individuelles, et d&#39;enregistrer les comportements qui en découlent. En introduisant quelques modifications aux méthodes établies précédemment, cette approche pourrait être utilisée pour obtenir des réponses comportementales de neurones isolés activés jusqu&#39;àd&#39;au moins 4 jours post-fécondation (DPF). Plus précisément, nous avons créé un transgène l&#39;aide d&#39;un neurone somatosensoriel amplificateur, CREST3, pour diriger l&#39;expression de la variante marquée channelrhodopsin, chef-tdTomato. L&#39;injection de ce transgène dans embryons en stade 1-cellule se traduit par l&#39;expression dans les neurones de la mosaïque somesthésiques, qui peut être imagé par microscopie confocale. Illuminating identifié les cellules de ces animaux avec de la lumière provenant d&#39;un laser DPSS nm 473, guidé par un câble à fibre optique, suscite des comportements qui peuvent être enregistrées avec une caméra vidéo à grande vitesse et analysés quantitativement. Cette technique pourrait être adapté à l&#39;étude des comportements suscités par l&#39;activation de n&#39;importe quel neurone poisson zèbre. En combinant cette approche avec des perturbations génétiques ou pharmacologiques sera un moyen puissant pour étudier la formation des circuits et de la fonction.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Câble à fibres optiques mis en place. (A) Couches d&#39;un câble à fibre optique. (B) câble à fibres optiques Stripped dans une pipette Pasteur. (C) Câble en fibre optique dans une pipette Pasteur positionné à l&#39;aide d&#39;un micromanipulateur. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Figure 2"/>...

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Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic techniques ont permis d&#39;étudier la contribution des neurones spécifiques de comportement. Nous décrivons une méthode larvaire chez le poisson zèbre pour l&#39;activation de simples neurones somatosensoriels exprimant une variante channelrhodopsin (Chef) avec un pompé par diode à l&#39;état solide (DPSS) laser et d&#39;enregistrer les comportements suscité avec une caméra vidéo à grande vitesse.

L&#39;activation des neurones somatosensoriels optogenetic poisson zèbre en utilisant Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K vues.  University of California, Los Angeles. Optogenetic techniques ont permis d'étudier la contribution des neurones spécifiques de comportement. Nous décrivons une méthode larvaire chez le poisson zèbre pour l'activation de simples neurones somatosensoriels exprimant une variante channelrhodopsin (Chef) avec un pompé par diode à l'état solide (DPSS) laser et d'enregistrer les comportements suscité avec une caméra vidéo à grande vitesse.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L&#39;électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Recherche

Neurosciences

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

L&#39;utilisation abordable tableaux LED pour photo-stimulation des neurones

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Stimulation optogenetic du nerf auditif

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of providing precise and controlled stimulation. This article introduces a technique for recording somatosensory event-related potentials (ERP) that uses a novel mechanical stimulation method involving skin deformation using a robotic device. Controlled deformation of the facial skin is used to modulate kinesthetic inputs through excitation of cutaneous mechanoreceptors. By combining somatosensory stimulation with electroencephalographic recording, somatosensory evoked responses can be successfully measured at the level of the cortex. Somatosensory stimulation can be combined with the stimulation of other sensory modalities to assess multisensory interactions. For speech, orofacial stimulation is combined with speech sound stimulation to assess the contribution of multi-sensory processing including the effects of timing differences. The ability to precisely control orofacial somatosensory stimulation during speech perception and speech production with ERP recording is an important tool that provides new insight into the neural organization and neural representations for speech.

This paper introduces a method for obtaining somatosensory event-related potentials following orofacial skin stretch stimulation. The current method can be used to evaluate the contribution of somatosensory afferents to both speech production and speech perception.

Potentiels liées aux événements somato-sensorielles de la peau Orofacial stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Analyser le comportement larves de drosophile en réponse à une Stimulation des neurones olfactifs Optogenetic

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...