Nous remercions Anne-Marie Dion-Côte des discussions menant à l&#39;élaboration de la méthode. JK et RB sont FQNRT chercheurs doctorants, M.-MG est un savant Vanier IRSC, et J.-YM est un chercheur senior du FRSQ. Ce travail a été soutenu par des fonds du Conseil de recherches en génie à JY sciences naturelles et en. M.

Une. Production de baculovirus recombinant Les baculovirus sont générés en utilisant le système d&#39;expression Bac-to-Bac Baculovirus d&#39;Invitrogen principalement en conformité avec le protocole du fabricant avec seulement de légères modifications: <ol><li> Un vecteur pFastBac1 modifié (Gibco, la vie) a été créé contenant la TPS et ses balises (Figure 2). Le site clonage multiple (MCS) d&#39;un animal-52b (+) vecteur (Novagen), contenant un 10xHis-étiquette, a été inséré dans le MCS d&#39;un vecteur pFastBac1 pour générer pFastBac1-Strep-10xHis. La séquence de MCS pET-52b (+) a été amplifié par PCR entre les sites de restriction XbaI et BLPI, en ajoutant un site de restriction BglII à l&#39;extrémité 5 &#39;et un site de restriction HindIII à l&#39;extrémité 3&#39;. Le produit de PCR a ensuite été clone entre les sites BamHI et HindIII de pFastBac1 de restriction, en utilisant la compatibilité de BamHI et BglII séquences de restriction. Etant donné que l&#39;objectif était de produire un pFastBac1 permettant l&#39;expression d&#39;protéine recombinante avec streptavidine et 10xHis-tags, le site de restriction BamHI de l&#39;animal-52b (+) séquence MCS n&#39;a pas été utilisé. En outre, le site de restriction XbaI n&#39;a pas été utilisé pour éviter la redondance des sites de restriction qui se produisent entre les sites déjà dans le SCM de pFastBac1 et les insérer avec le MCS de pET-52b (+). La séquence codante de la TPS avec le site PreScission protéase reconnaissance (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) a ensuite été inséré dans pFastBac1-Strep-10xHis. La séquence d&#39;ADNc de GST pGEX-6P-2 (GE Healthcare) a été amplifié par PCR avec des amorces contenant des sites de restriction Ncol et Kpnl aux extrémités 5 &#39;et 3&#39; des extrémités, respectivement. Le site Ncol permet l&#39;ajout d&#39;un codon d&#39;initiation, mais aussi une alanine à la GST. Le produit de PCR a ensuite été clone dans pFastBac1-Strep-10xHis entre les sites de restriction Ncol et Kpnl, ce qui entraîne la suppression de la streptavidine-tag. Le nouveau vecteur de fusion ainsi obtenu a été nommé pFastBac1-TPS-10xHis. </li><li> Cloner le ADNc codant pour la protein d&#39;intérêt dans le vecteur pFastBac-TPS-10xHis entre le TPS (N-terminal) et l&#39;His-tag (C-terminal). Faire attention à éliminer le codon d&#39;arrêt de l&#39;ADNc à permettre la fusion avec le His-tag C-terminal. </li><li> Transformer E. coli avec le pFastBac DH10Bac recombinant (obtenu à l&#39;étape 1.2) pour générer le bacmide. Permettre aux colonies de se développer pendant une nuit à 37 ° C et plusieurs heures à 30 ° C sur des plaques de sélection contenant Bluo-gal et IPTG (10 ng / ml de tetracycline, 50 pg / ml de kanamycine, 7 ng / ml de gentamycine, 100 ug / ml de Bluo- Gal, 40 ug / ml d&#39;IPTG). </li><li> Choisissez et restreak 2 colonies blanches (de l&#39;étape 1.3) sur des plaques de sélection pour confirmer le phénotype blanc. </li><li> Inoculer 2 ml de LB contenant 10 ug / ml de tetracycline, 50 pg / ml de kanamycine, 10 pg / ml de gentamycine avec les deux colonies blanches de l&#39;étape 1.4 et de les laisser croître pendant une nuit sous agitation (250 rpm) à 37 ° C. </li><li> Afin de purifier l&#39;ADN de bacmide, un culot de bactéries à partir de l&#39;étape 1.5,remettre en suspension les cellules dans 300 ul de solution I et ajouter 300 ul de solution II (kit Maxiprep de Qiagen). Incuber pendant 5 min à température ambiante, ajouter 300 ul de 3 M de KOAc pH 5,5 et incubation pendant 10 min sur de la glace. Centrifuger les échantillons à 4 ° C, la vitesse maximale pendant 10 minutes. Ajouter 800 ul d&#39;isopropanol pour les surnageants et incuber pendant 10 min sur la glace. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 4 ° C et on lave le culot avec 500 ul d&#39;éthanol à 70%. Laissez le culot sec et remettre en suspension dans des conditions stériles dans 40 pi de Tris-EDTA pH 8,0. L&#39;ADN de bacmide doit être conservé à 4 ° C. </li><li> Générer des baculovirus comme décrit dans le protocole du fabricant. Baculovirus peuvent être conservés à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li></ol> 2. Recombinant Protein Expression <ol><li> Afin de choisir le baculovirus plus efficace pour la purification et de surveiller ce temps le pic d&#39;expression de la protéine est atteinte, effectuer une mini-infection essai uns suit: Infect 2 x 10 7 de Sf9 infectées en culture à 27 ° C dans les médias de Grace (complété avec 10% de FBS et 1% P / S) avec 133 pi (1/150) de baculovirus. Recueillir des aliquotes de 1,5 ml à 0, 24, 48, et 72 heures après l&#39;infection. Sédimenter les cellules et d&#39;analyser le niveau de la protéine d&#39;intérêt par Western blot en utilisant des anticorps anti-tag expression. </li><li> Utilisez le baculovirus plus efficace de l&#39;étape 2.1 pour infecter un spinner contenant 1,0 x 10 6 cellules Sf9 par ml dans 500 ml de milieu avec un ratio de 1/150 entre le virus et les médias. Laissez les cellules infectées se développent en suspension à 27 ° C et récolter les cellules où l&#39;expression de la protéine maximale (déterminée à l&#39;étape 2.1 ci-dessus) est atteint. Culot cellulaire peuvent être stockées à -80 ° C jusqu&#39;à son utilisation ultérieure. </li></ol> 3. Préparation de Soluble Cell Lysate Toutes les étapes d&#39;incubation ci-dessous sont effectuées à 4 ° C sous rotation doux. <ol><li> Lyse Scellules F9 exprimant votre protéine d&#39;intérêt à ~ 20 ml de TPS tampon de liaison (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, 1 mM de DTT dans PBS1X pour une concentration finale de NaCl de 250 mM, et de l&#39;inhibiteur de la protéase cocktail (Roche). dans un bain d&#39;eau glacée, la solution 20x Dounce avec un homogénéisateur Dounce, sonication 3 x 30 secondes chacun (de sortie) de 70%, et encore une fois de Dounce 20x. </li><li> (Optionnel). Incuber le lysat cellulaire totale avec 1 mM de MgCl2 et benzonase nuclease 7 (2,5 U / ml) pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer l&#39;ADN de l&#39;ARN ou de contamination. </li><li> Centrifuger à 18 000 tours par minute pendant 30 min à 4 ° C. Gardez le surnageant. </li><li> (Optionnel). Centrifuger le surnageant à nouveau pendant 30 min à 18 000 rpm à 4 ° C pour obtenir un lysat soluble claire. Passez le surnageant à travers un filtre de 0,2 ou 0,45 um pour éviter le colmatage. </li></ol> 4. Liaison de la protéine sur Perles TPS <ol><li> Incuber le lysat cellulaire soluble avec 1 ml de billes de GST (préalablement lavée deux fois avec de l&#39;10 ml de tampon TPS) de liaison pendant 1 h à 4 ° C sous une légère rotation. </li></ol> Commentaire: Le temps d&#39;incubation doit être optimisée en fonction de la stabilité de la protéine et de l&#39;efficacité de liaison. <ol start="2"><li> Tour rapide à 700 rpm et enlever le surnageant contenant les protéines non liées (ce peuvent être conservés pour analyse ultérieure). Laver les protéines de la TPS lié (figure 3B, piste 1) avec le tampon de lavage de la TPS (TPS tampon de liaison avec 350 mM de NaCl final). </li><li> Répétez l&#39;étape 4.2 2x. Au dernier lavage, enlever autant de surnageant que possible. </li><li> Incuber les billes avec 5 mM d&#39;ATP et 15 mM de MgCl2 (10 ml dans un tampon de liaison TPS) pendant 1 h à 4 ° C pour éviter la liaison non spécifique des protéines de choc thermique 8. Laver les billes trois fois avec du tampon de lavage de la TPS. </li></ol> 5. PreScission clivage de la TPS <ol><li> Centrifuger les perles de la TPS, éliminer le surnageant et laver les billes de la TPS avec P5 buffer (50 mM, pH 7,0 NaHPO 4, 500 mM de NaCl, 10% de glycerol, 0,05% de Triton-X-100, 5 mM d&#39;imidazole). </li><li> Incuber les TPS-perles avec PreScission enzyme dans un tampon P5 de 3 heures à une nuit à 4 ° C. (Diviser les perles de la TPS en fractions de 100 ul et ajouter 4-8 unités (2-4 pi) d&#39;enzyme dilué dans 100 pi de tampon P5). </li></ol> Commentaire: Le temps d&#39;incubation de l&#39;étape de PreScission doit être optimisée en fonction de la masse moléculaire ainsi que la stabilité de la protéine. Si la dégradation est observée, ce temps d&#39;incubation peut être réduite à un minimum de 2 heures au lieu d&#39;une nuit. <ol start="3"><li> Rotation rapide et recueillir le surnageant. Répétez cette étape deux fois après addition de 100 pi de P5 tampon pour les perles et mutualiser toutes les fractions (figure 3B, piste 2). </li></ol> Commentaire: Les perles restantes peuvent être utilisées pour l&#39;analyse de l&#39;efficacité de clivage (figure 3B </strong&gt;, piste 3). Habituellement, 70 à 80% de la protéine est clivée. 6. Protéine de liaison à TALON Métal Résine Affinity <ol><li> Diviser l&#39;élution à partir d&#39;au-dessus dans 3 fractions de 1 ml et incuber chacun avec 100 billes sèches Talon de résine d&#39;affinité métallique pl (prélavées deux fois avec du tampon P5) pendant 1 heure sous rotation. </li></ol> Commentaire: La division de la élution en plusieurs fractions augmente de liaison / lavages efficacité. <ol start="2"><li> Laver la résine 5 min avec du tampon P30 (tampon P5 avec une concentration finale de 30 mM imidazole). </li><li> Répétez l&#39;étape 6.2 2x et mutualiser les perles dans un seul tube. Avant le dernier lavage, enlever autant de surnageant que possible. </li></ol> Commentaire: Ceci correspond à la TALON lié échantillon (figure 3B, piste 4). 7. L&#39;élution de la protéine purifiée <ol><li> Incuber la résine TALON lié aux protéines pendant 5 min sous rotation avec P500 un tampon (tampon de P5 avec une concentration finale de 500 mM d&#39;imidazole). Utiliser un ratio entre le tampon et perles de 1:1 v / v (Par exemple, si vous aviez pris 200 ul de billes sèches, vous devrez ajouter 200 ul de P500). Répétez cette étape deux fois et garder chaque fraction éluée séparément (nommé élution 1 (E1), élution 2 (E2) et élution 3 (E3); la figure 3B, pistes 5-7). </li></ol> Commentaire: Les perles restantes peuvent être utilisées pour l&#39;analyse de l&#39;efficacité d&#39;élution (figure 3B, piste 8). Typiquement, 60 à 80% de la protéine est éluée au total. <ol start="2"><li> Analyser la quantité et la qualité de votre protéine purifiée en chargeant environ 20-40 ul de chaque fraction avec une concentration standard BSA sur un SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie (figure 3B) ou SYPRO protéine tache pour la visualisation. </li></ol> Commentaire: La protéine d&#39;intérêt peut également être détectée throughout la procédure de purification utilisant des anticorps anti-GST et ses anti-anticorps (Figure 3C). 8. Le stockage de la protéine purifiée <ol><li> Dialyser la protéine purifiée contre un tampon de stockage approprié (par exemple, 20 mM de Tris acétate pH 8,0, KAc 200 mM, glycérol 10%, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) à 4 ° C. Il est important de vérifier la précipitation de la protéine purifiée au cours de la dialyse. Nous dialyser habituellement 2x pendant 1 h à 4 ° C sous rotation de l&#39;agitation. </li><li> Faire de petites fractions de la protéine purifiée (10-20 pi) et geler sur glace sèche pendant 30 min. Entreposer les aliquotes à -80 ° C et éviter de nombreuses dégel / cycles de congélation. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

Le-His TPS protocole de purification présentée ici est approprié pour la purification d&#39;une large gamme de tailles et de protéines recombinantes: Nous avons purifié avec succès Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), et une protéine de haut poids moléculaire instable de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. En outre, les protéines purifiées avec ce protocole étaient biochimiquement active 6. Le succès de ce procédé dépend uniquement de l&#39;ex...

La purification de protéines recombinantes est crucial de répondre aux questions fondamentales de la biochimie. Des moyens classiques de purification des protéines, comme la Chromatographie d&#39;échange d&#39;ions et une Chromatographie d&#39;exclusion de taille dépendent des propriétés physiques de la protéine cible, tels que son point isoélectrique et la charge ou de la taille, respectivement. Ces dernières caractéristiques de protéine sont partagées par une variété de protéines, ce qui augmente considérablement le risque de contamination de protéines dans des stratégies de purification de protéines classiques. Ce problème peut être contourné par l&#39;utilisation de plusieurs colonnes de purification, ce qui prend du temps. Dans le même temps, ces derniers exigent des méthodes de chromatographie montage expérimental coûteux. Affinity-tag purification augmente fortement cible spécificité, comme dans la plupart des cas, le tag sera unique à la protéine d&#39;intérêt. Dans des études récentes, la purification de drapeau ou HA-affinité a été largement utilisé. Contrairement à rec existanteprotocoles de purification de protéines ombinant dans les balises simples sont utilisés, nous avons établi la combinaison unique de deux balises. Notre procédé implique la fusion d&#39;une GST-tag à l&#39;extrémité N-terminale et une étiquette His à l&#39;extrémité C-terminale de la protéine d&#39;intérêt, pour un rapport optimal entre la quantité et la pureté de la protéine souhaitée. La TPS est une longue étiquette (29 kDa), qui est très efficace pour la purification de glutathion billes de Sepharose. En outre, en utilisant la TPS garantit coût-efficacité de notre méthode 1. La possibilité de cliver la GST avec l&#39;enzyme PreScission (avec la séquence de reconnaissance LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, soit un ajout de seulement deux acides aminés) présente de nombreux avantages, par exemple, cette stratégie permet d&#39;éviter les altérations des fonctions des protéines physiologiques dus à encombrement allostérique. La petite étiquette His fusionnés à l&#39;autre extrémité sert de protéine dans une seconde étape de purification pour augmenter la pureté de la protéine par lavage hors de la TPS clivé, ainsi que les protéines dégradées et les autres<html> contaminants. En outre, le protocole ne nécessite pas d&#39;étape de dialyse lors du passage de la TPS à la colonne de l&#39;étape de purification His-(résine TALON). Contaminants communs dans ces procédés de purification sont Heat Shock Proteins (HSP). L&#39;ajout d&#39;une étape d&#39;incubation avec du MgCl 2 et de l&#39;ATP permet l&#39;élimination de ces contaminants (Figure 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) et chromatographie liquide haute performance (HPLC) sont des techniques courantes qui dépendent de l&#39;instrumentation coûteuse à produire un rendement élevé de la protéine purifiée d&#39;intérêt. Le protocole de purification en discontinu nous présentons ici, en revanche, est manuel et ne nécessite pas une installation coûteuse instrumental. Un rendement élevé de protéines peut être atteint par l&#39;intensification de la protocole. Dans le même temps, avec le protocole de purification en discontinu, le volume d&#39;élution peut être ajusté afin d&#39;augmenter la concentration en protéine, qui n&#39;est pas donné par FPLC ou HPLC. ntent &quot;&gt; En outre, avec la TPS-Son protocole de purification de lots, des protéines avec une gamme de taille de ~ 10-300 kDa peuvent être purifiés. Un des plus grands avantages est donnée par le fait que l&#39;on peut purifier plusieurs protéines en même temps , par exemple, à la fois de type sauvage et de sa protéine mutante. Le succès du protocole présenté dépend uniquement du niveau d&#39;expression et la solubilité de la protéine d&#39;intérêt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Dosages clés en enzymologie pour la caractérisation biochimique des protéines in vitro requièrent des concentrations élevées de la protéine purifiée d&#39;intérêt. protocoles de purification de protéines devraient combiner l&#39;efficacité, la simplicité et l&#39;efficacité des coûts 1. Ici, nous décrivons la TPS-Sa méthode comme un nouveau système de purification d&#39;affinité à petite échelle de protéines recombinantes, basée sur une marque N-terminal glutathion Sepharose (TPS) 2,3 et une étiquette de 10xHis C-terminal 4, qui sont tous deux fusionné pour la protéine d&#39;intérêt. Cette dernière construction est utilisée pour générer des baculovirus, par infection de cellules Sf9 infectées pour l&#39;expression des protéines 5. TPS est un peu long tag (29 kDa) qui sert à assurer l&#39;efficacité de la purification. Toutefois, il pourrait influencer les propriétés physiologiques de la protéine. Par conséquent, il est par la suite éliminé par clivage de la protéine en utilisant l&#39;enzyme PreScission 6. Afin d&#39;assurer une pureté maximale et d&#39;éliminer la TPS clivé, nousd&#39;ajouter une deuxième étape de purification par affinité sur la base de la relativement faible His-Tag. Surtout, notre technique est basée sur deux étiquettes différentes flanquant les deux extrémités de la protéine, qui est un outil efficace pour éliminer les protéines dégradées et, par conséquent, enrichit protéines pleine longueur. La méthode présentée ici ne nécessite pas une configuration instrumentale coûteux, comme FPLC. En outre, nous avons intégré MgCl2 et lavages ATP pour enlever les impuretés chaleur de protéines de choc et de traitement à la nucléase de supprimer les acides nucléiques contaminants. En résumé, la combinaison de deux étiquettes différentes flanquant la N-et C-terminal et la capacité de cliver une des balises, garantit la récupération d&#39;une protéine hautement purifiée et sur toute la longueur d&#39;intérêt.

Afin d&#39;illustrer l&#39;efficacité de la GST-His protocole de purification, nous avons purifié Rec14, un S. protéine de 32,9 kDa pombe. Le Rec14 ADNc a été cloné dans notre vecteur pFastBac1 modifiée permettant l&#39;ajout de la TPS et-ses-tags à la N-et C-terminales, respectivement (figure 1A). Baculovirus recombinants ont ensuite été préparés et utilisés pour infecter des cellules SF9 infectées pour l&#39;expression de la protéine. Les lysats cellulaires solubles on...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Dans le présent protocole, nous démontrons une méthode de purification de protéine hautement efficace et rentable à petite échelle, qui permet la purification de protéines recombinantes en combinant de manière unique un TPS-marqueur clivable et une petite étiquette His.

TPS-Sa purification: A deux pas d&#39;affinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

41.1K vues.  Hôtel-Dieu de Québec.  Dans le présent protocole, nous démontrons une méthode de purification de protéine hautement efficace et rentable à petite échelle, qui permet la purification de protéines recombinantes en combinant de manière unique un TPS-marqueur clivable et une petite étiquette His. 

Vidéo: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Biologie

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purification de Hsp104, une protéine Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d&#39;affinité bispécifiques petits

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80