Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

NOTE: Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de recherche et d&#39;éthique de Ear Animal Hospital Royal Victorian yeux et (RVEEH AEC; # 10-199AB). Les sujets ont été traités selon le «Code australien de pratiques pour le soin et l&#39;utilisation des animaux à des fins scientifiques&quot; de Medical Research Council (2013) et la «prévention de la cruauté envers les animaux loi&quot; Santé nationale et (1986 et amendements). Toutes les procédures d&#39;évaluation et électrophysiologiques chirurgicaux, cliniques ont été réalisées sous anesthésie et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. 1. énucléation et fixation REMARQUE: Suivez la procédure d&#39;énucléation et la fixation décrite en détail dans le manuscrit de 16 compagnon, en prenant soin supplémentaire autour de câbles de périphérique ou des ports de vitrectomie, se il est présent. En bref, il se agit de: <ol><li> Transcardiaque perfuser le sujet avec une solution saline chaude suivie Buffe neutre froideformol rouge. </li><li> Attachez sutures sur le globe oculaire pour servir de points de repère. </li><li> Énucléer l&#39;œil 16, maintenir les câbles du périphérique et tout attachement patches / onglets. </li><li> Post-fixer l&#39;œil dans une solution de Davidson pour les 18 - 36 heures. </li><li> Transfert à 50% d&#39;éthanol pendant 6-8 heures. </li><li> Transfert à 70% d&#39;éthanol et réfrigérer (4 ° C) jusqu&#39;à ce que la dissection. </li></ol> 2. Electrode Enlèvement et Dissection. REMARQUE: tous les implants épirétiniennes auront le même facteur de forme, mais en général, il y aura un réseau d&#39;électrodes et une certaine forme de matériau de support flexible et adaptable. Les périphériques qui sont cloués à la rétine disposent d&#39;un trou d&#39;amure où le point d&#39;amure métallique pénètre dans le tableau et l&#39;arrière de l&#39;œil, en gardant ces ensemble. <ol><li> Visualiser l&#39;implant et le point où elle est fixée à la rétine. <ol><li> En utilisant une lame de 15 degrés faire une incision trans-cornéen périphérique et retirez le capot cornéen à expose l&#39;iris et le cristallin sous-jacents. </li><li> En utilisant une lame de 15 degrés, disinsert les fibres zonulaires de la lentille, retirer la lentille en totalité, l&#39;exposition de la chambre postérieure avec l&#39;implant épirétinienne et le point d&#39;amure de métal in situ. </li></ol></li><li> Selon l&#39;implant et l&#39;étude effectuée, supprimer des composants étrangers avant de poursuivre la dissection. NOTE: Dans le présent exemple, le tableau epiretinal en cours d&#39;évaluation composée d&#39;un ensemble d&#39;électrodes de diamant et de l&#39;électronique hermétique prototype logée dans un support conforme de silicone (produit dans la maison; reportez-vous à 20). <ol><li> Ici, retirez délicatement le paquet électrode de diamant par dissection fine avec un scalpel. Laissez le corps en silicone de l&#39;implant ainsi que le point d&#39;amure de la rétine et les restes du câblage de platine (figure 2). Si un tableau / logement intégré ne fait pas partie de la conception du dispositif à l&#39;étude, puis omettre cette étape (2.2). </li></ol></li><li> Soigneusementdisséquer un échantillon qui inclut le point d&#39;amure et le tissu environnant dans l&#39;orientation désirée. Utilisez des ciseaux fins de dissection à couper des bandes de pleine épaisseur à l&#39;arrière de l&#39;œil, y compris la sclérotique, la choroïde et de la rétine. Prélever un échantillon, qui donne une vue en coupe longitudinale de l&#39;adhésivité, qui montre toutes les couches rétiniennes adjacentes à la pointe (Figure 2) REMARQUE: L&#39;orientation désirée pour l&#39;échantillon peut différer en fonction du résultat particulier désiré. Par exemple, si l&#39;on veut examiner la proximité de l&#39;endommager de dépoussiérage pour le disque optique, puis le disque optique devrait être incluse dans l&#39;échantillon. </li></ol> 3. Déshydratation, Embedding, de montage, de broyage, de coloration, et Imagerie <ol><li> Déshydrater l&#39;échantillon sur trois jours dans les étapes de production d&#39;éthanol progressistes: <ol><li> Déshydrater l&#39;échantillon deux fois dans 70% d&#39;éthanol pendant 2 heures. </li><li> Déshydrater l&#39;échantillon dans 80% d&#39;éthanol pendant 2 heures, puis deux fois O / N. </li><li> Déshydrater l&#39;échantillon dans 90% d&#39;éthanol pendant 2 heures TWICe. </li><li> Déshydrater l&#39;échantillon dans 100% d&#39;éthanol pendant 2 heures deux fois, puis O / N. </li></ol></li><li> Déshydrater deux fois l&#39;échantillon dans 100% d&#39;acétone pendant 2 heures. <ol><li> Retirer l&#39;échantillon de l&#39;acétone et l&#39;observer sous un microscope optique à mesure qu&#39;il sèche à l&#39;air à la température ambiante. Transférer l&#39;échantillon à l&#39;époxy (voir l&#39;étape 3.4), juste avant qu&#39;il ne commence à friser / effondrement. REMARQUE: en enlevant le liquide à partir des résultats des tissus mous dans les cellules effondrées et retrait. Une appréciation du moment où le curling tissus / effondrement se produit est développé avec l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Préparer résine époxy de qualité médicale selon les instructions du fabricant. Pour durcir la résine, utiliser soit 55 ° C pendant 1 heure ou 24 heures à température ambiante. Placez dans une chambre à vide pendant environ 5 min à environ 50 mbar pour enlever les bulles d&#39;air. Réglementer le vide manuellement comme un vide excessive provoque le mélange époxy à ébullition et dégazage ne se produira pas efficace REMARQUE: Effectuez l&#39;étape 3.3 en même temps que l&#39;étape 3.2. </li><li> Incluez la sample dans de la résine époxy transparente. Plonger le tissu oculaire en époxy dégazé dans un contenant hermétique approprié et laisser O / N à température ambiante pour guérir. </li><li> Prenez soin d&#39;intégrer l&#39;échantillon dans l&#39;orientation désirée (Figure 2) en redimensionnant et en re-enrobage le bloc époxy durcie. Re-incorporer le bloc redimensionnée contenant le tissu de l&#39;oeil de telle sorte que l&#39;axe long de l&#39;adhésivité est orientée parallèlement au fond du moule (coupelle jaune - Figure 3A). </li><li> Montez la résine dans un porte-échantillon de broyage et broyer l&#39;échantillon (230 à 250 tours par minute avec de l&#39;eau sur, ponçage manuel) en utilisant du papier de carbure de silicium (à partir de 800 grille; figures 3C et 3E). </li><li> Pour la coloration, tremper la surface du sol dans le bleuissement toluidine pour 3-5 min, ou jusqu&#39;à ce que la tache se développe (figure 3F). </li><li> Rincer à l&#39;eau du robinet (figure 3G). </li><li> L&#39;image de la surface du sol de l&#39;échantillon avec un champ d&#39;application haute puissance de dissection de visualiser les couches cellulaires de larétine (figure 3H). Appliquer une goutte d&#39;eau distillée sur la surface supérieure de l&#39;époxy-dessus du spécimen pour lisser la diffraction à l&#39;interface air-résine époxy. Utilisez une fibre source de lumière optique «col de cygne» pour éclairer l&#39;échantillon. </li><li> Répéter les étapes 3.6 à 3.9, à chaque fois une épaisseur de meulage distance prédéterminée de l&#39;échantillon (incrément minimal de meulage précis et reproductible de porte-échantillon est de 20 pm). </li></ol>

<ol>
	<li>Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+prostheses+for+the+blind.">Visual prostheses for the blind.</a> Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Saunders, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+procedure+for+implantation+of+a+prototype+suprachoroidal+retinal+prosthesis.">Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis.</a> Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+microelectrode+arrays+for+artificial+retinal+implants+using+liquid+crystal+polymers.">Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+electrical+stimulation+with+a+suprachoroidal+multichannel+electrode+in+rabbit+eyes.">Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes.</a> Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).</li><li>Majji, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+stimulation+at+the+electrode-retina+interface.">Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).</li><li>Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+damaging+electrical+stimulation+in+the+retina.">Pathology of damaging electrical stimulation in the retina.</a> Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Electrical+Stimulation+with+a+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis:+A+Preclinical+Safety+and+Efficacy+Study.">Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study.</a> PLoS One. 9, e97182 (2014).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Processing+Eyes+Implanted+With+a+Retinal+Prosthesis+for+Localized+Histopathological+Analysis.">Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).</li><li>Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+techniques+for+implantation+of+a+wireless+intraocular+epiretinal+retina+implant+in+Gottingen+minipigs.">Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs.</a> Graefe's Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).</li><li>Gerding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+evaluation+of+intraocular+titanium+tacks+for+the+mechanical+stabilization+of+posterior+segment+ocular+implants.">Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants.</a> Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).</li><li>Seo, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+retinal+tack+for+the+epiretinal+&#64257;xation+of+the+polyimide+electrode+array.">Silicon retinal tack for the epiretinal &#64257;xation of the polyimide electrode array.</a> Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).</li><li>Hadjinicolaou, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+retinal+ganglion+cells+with+diamond+and+the+development+of+an+all+diamond+retinal+prosthesis.">Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis.</a> Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).</li><li>Briggs, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+round+window+and+cochleostomy+approaches+with+a+prototype+hearing+preservation+electrode.">Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode.</a> Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).</li><li>Shepherd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cochlear+implant+electrode+array+for+use+in+experimental+studies.">An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies.</a> Hear Res. 277, 20-27 (2011).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21, 205-211 (2000).</li><li>Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+imaging+and+3D+reconstruction+of+mammalian+cochlea+by+fluorescent+confocal+microscopy.">A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy.</a> Brain Res. 1000, 200-210 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Techniques histologiques standard sont incapables de traiter des implants métalliques durs in situ en raison des limites de coupe ces objets de métal, de verre ou même des lames diamant. Dans notre document d&#39;accompagnement 16, nous avons montré que l&#39;utilisation d&#39;une technique de fixation des yeux toute modification pourrait réduire le délaminage de la rétine artefact. Dans le manuscrit en cours, un meulage et de polissage établis technique pour visualiser les implants cochléaires 21-23 in situ a été modifié pour les prothèses rétiniennes. Une adhérence de titane, utilisé pour fixer un réseau d&#39;électrodes de la rétine, epiretinally, a été noyé dans de l&#39;époxy avec le tissu oculaire environnant. Ce bloc de résine a alors été orienté de manière appropriée et la terre progressivement / poli afin de révéler la morphologie des tissus immédiatement adjacente à la punaise de métal. Images de la surface polie du bloc à différentes profondeurs ont été prises avec un microscope de dissection puissant. Cette technique est utile pour: visualisation et évaluatment la réponse du tissu adjacent à l&#39;implant épirétinienne; pour évaluer le traumatisme chirurgical associé à l&#39;implantation de l&#39;implant; pour déterminer la réaction biologique pour les pièces en métaux durs; et à mesurer la distance entre l&#39;implant et la surface de la rétine. Cette technique sera utile dans les futures études de sécurité pour la visualisation in situ de la région adjacente à une attache rétinienne ou d&#39;autres (par exemple, métalliques) des objets durs dans l&#39;œil dans. Cela a une application directe pour évaluer l&#39;innocuité préclinique de prothèses cloué à la rétine epiretinally. Il peut également être utile pour l&#39;évaluation des dommages aux tissus de la rétine dans des régions en contact avec des implants situés à l&#39;emplacement du sous-rétinien. Il ya plusieurs façons de vérifier que la technique a été effectuée correctement. A chaque étape, la rétine doit rester attaché aux couches externes de l&#39;œil. Se il ya décollement de la rétine artefact brute, ce qui peut Indicmangé un problème avec la fixation. Lorsque l&#39;échantillon est intégré et re-orienté dans la résine finale bloquer la rétine devrait être proche de l&#39;orthogonale-face de meulage du bloc; ce qui réduira la coupe oblique. Il est utile de vérifier que le nombre d&#39;étapes supplémentaires de broyage (de taille de pas connu) nécessaire pour parcourir un objet (comme une attache rétinienne) corrélation conséquence avec les dimensions de l&#39;objet. La technique peut être optimisée de plusieurs façons. Rayures sur la surface du bloc époxy associé au processus de broyage peuvent être réduites progressivement polissage de qualité plus fine. Pour la présente étude, nous avons utilisé 800, 1000, 1200, 2400, 4000 et papier au carbure de silicium de qualité. Pâte de diamant pourrait également être utilisé pour améliorer la finition de surface. Une finition de surface plus fine donne une image de qualité supérieure mais au prix de temps de polissage supplémentaire. Un autre élément clé pour améliorer les résultats de cette technique est le choix et la qualité de l&#39;optics et d&#39;éclairage utilisés pour la capture d&#39;image. Autres taches histologiques de base - en particulier les taches de Nissl, peuvent être utilisés à la place du bleu de toluidine, mais peuvent nécessiter une optimisation plus poussée. Certaines taches peuvent tacher la résine ainsi que le tissu (par exemple, l&#39;éosine), donc un vernis peu profonde peut être nécessaire après la coloration de fond pour enlever la décoloration. Taches spécialisées, des colorants fluorescents et la coloration immunohistochimique n&#39;a pas été tentée, mais moins qu&#39;un résultat très spécifique est souhaitée, le temps nécessaire pour effectuer ces tâches à chaque niveau de broyage est susceptible d&#39;être prohibitif. Toutefois, il peut être possible de teindre le tissu dans son ensemble avant l&#39;étape de l&#39;incorporation (étape 3.4) 24. La principale limite de cette technique est que, une fois la région d&#39;intérêt a été meulés, il ne peut pas être récupéré, par conséquent, il est prudent de capturer plusieurs images (éventuellement redondantes) à une variété de grossissements à chaque étape de meulage et le polissage. Il estégalement important d&#39;utiliser de petits incréments pour chaque réglage de la profondeur de broyage. Une autre limite de cette technique est que de l&#39;agrandissement et de la résolution optique en comparaison avec le tissu monté sur une lame de verre et lu avec un écart (transmission) microscope optique. Aux fins de prototypage et d&#39;évaluer la sécurité d&#39;un dispositif d&#39;implant roman, l&#39;évaluation macropathologique est d&#39;un intérêt primordial. Cette technique fournit un procédé efficace pour l&#39;observation des dommages cliniquement significative associée à une attache rétinienne. Avec la pratique, le temps global nécessaire pour réunir, meuler, polir et de photographier un échantillon donné (une fois embarqués) est comparable au temps qu&#39;il faudrait pour la section d&#39;un bloc de paraffine ou de l&#39;article congelé. Il ya aussi la possibilité que les techniques actuelles d&#39;être étendu à des applications en dehors du champ d&#39;application des implants rétiniens. Cette technique est adaptée à l&#39;évaluation le tissu adjacent à un implant dur, où l&#39;extraction de l&#39;implant ne est pas feasible ou nuirait à l&#39;interface. Par exemple, cette technique pourrait être étendu à évaluer implants fabriqués à partir de métal (par exemple, le platine, le nitinol, etc.) qui ne peut être coupé par des techniques histologiques classiques, tels que certains cérébrale profonde ou électrodes de nerfs périphériques, les canules pour la délivrance de médicaments, les endoprothèses vasculaires ou des prothèses orthopédiques.

Rétinite pigmentaire (RP) est une maladie héréditaire qui provoque la perte généralisée de photorécepteurs, qui sont les cellules de la couche la plus externe de la rétine responsable de la transduction de lumière, sous la forme de photons, dans l&#39;activité neuronale. Fait important, les patients atteints de RP ont typiquement des neurones résiduels dans les autres couches de la rétine qui sont encore fonctionnelles. Prothèses rétiniennes sont capables de restaurer une vision limitée à ces patients en ciblant ces neurones survivants avec stimulation électrique pour activer leur parcours 1,2 visuelle. Les résultats d&#39;essais cliniques de perception ont montré de premiers résultats prometteurs et récemment certains appareils ont été approuvés pour un usage commercial. Actuellement, il existe trois principaux emplacements anatomiques dans lequel prothèses rétiniennes cliniques ont été positionnés: epiretinally 3,4, 5,6 et sous-rétinienne suprachoroidally 7,8. Différents dispositifs utilisent différents matériaux et leur forme est personnaliséà l&#39;emplacement dans lequel ils sont implantés. Cependant, ils ont tous créent percepts visuels en activant les neurones résiduelles de la rétine avec des impulsions électriques. Il ya le potentiel pour une prothèse médicale d&#39;endommager les tissus environnants en raison d&#39;effets mécaniques du placement initial ou des forces en cours ultérieurs. Dans le cas de stimulateurs implantables, tels que les prothèses rétiniennes, il est la contrepartie supplémentaire que les paramètres électriques devraient être dans des limites sûres. La sécurité des patients est primordiale, de sorte dispositifs doit être testé rigoureusement dans les études précliniques avant de passer à la fixation d&#39;un clinique 9-15. Dans notre article d&#39;accompagnement, nous avons décrit une méthode pour évaluer l&#39;histopathologie localisée de l&#39;œil entourant un implant positionné dans l&#39;espace suprachoroïdien 16. Dans la présente manuscrit, nous décrivons une méthode pour visualiser les tissus oculaires entourant un réseau d&#39;électrodes plaquées à la rétine epiretinally, dans une préclinique (feligne) modèle (figure 1). L&#39;emplacement épirétinienne est la position la plus couramment utilisée pour localiser une prothèse visuelle. réseaux d&#39;électrodes situées ici sont généralement fixés sur la rétine avec une pointe métallique qui pénètre dans toutes les couches 17-20 de l&#39;oeil. Avant les techniques décrites dans le présent manuscrit, il était difficile d&#39;évaluer avec précision la rétine et d&#39;autres tissus environnants immédiatement un virement de bord. La fixation de l&#39;oculaire standard utilisant du formol tamponné neutre causé des dommages de la rétine artefact dû au mouvement différentiel de la rétine et la sclérotique contre le point de l&#39;amure fixe. Par conséquent, toute la réalité du dommage causé par le point d&#39;amure et le réseau epiretinal n&#39;a pas pu être observé avec précision. En outre, la coupe du tissu oculaire ne pouvait pas être effectuée avec le point d&#39;amure de la rétine in situ comme des objets métalliques ne peuvent pas être facilement coupés avec un appareil histologique traditionnelle; enlever le point d&#39;amure avant le traitement histologique a également étéindésirable, car cela a aussi conduit à des lésions rétiniennes artefact. Le but de la présente étude était double: 1) pour réduire décollement de rétine artefact sorte que tout dommage causé par le point d&#39;amure et le tableau implant epiretinal peut être évaluée de façon fiable; et 2) pour visualiser l&#39;architecture de la rétine à proximité de l&#39;adhésivité sans l&#39;enlever. Afin de parvenir à une vue, une nouvelle technique de fixation a été utilisé (comme décrit dans l&#39;article compagnon 16), ce qui réduit le délaminage de la rétine artefact. Pour atteindre objectif 2, nous avons modifié un plongement, le meulage, le polissage et technique, développée à l&#39;origine pour l&#39;observation in situ d&#39;électrodes d&#39;implant cochléaire en 21-23. Les méthodes décrites dans ce manuscrit permettent la visualisation de la rétine environnante et adjacent à un virement de bord in situ tout en minimisant les dommages à la rétine et artéfactuelles permettant ainsi une évaluation précise des dommages potentiels causés par le point d&#39;amure et le réseau epiretinal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Le protocole de fixation réduit sensiblement détachement artefact et le délaminage de la rétine 16. Orientation de l&#39;échantillon dans le bloc de résine époxy a été obtenu en utilisant le procédé constamment enrobage en deux étapes décrit. La procédure de broyage incrémentale nécessaire un niveau modéré de dextérité manuelle pour obtenir des résultats optimaux, mais a été aidé par le porte-échantillon réglable qui fourni un contrôle précis de la résolution de l&#39;incrément. Dans tous les cas (n = 5) le point d&#39;amure a été localisé et sol / poli avec des résultats souhaitables et cohérentes. La rétine à côté des punaises étaient résoluble et colorée appropriée. Le polissage de la surface du bloc de résine époxy avec une # 800 papier au carbure de silicium de grade P était suffisante pour imager la macrostructure cellulaire du tissu enrobé. Un papier de qualité supérieure, ou de diamant suspension peuvent être utilisés pour polir la surface supplémentaire à toute profondeur donnée, si désiré. Un microscope de dissection et fibre optique &#39;col de cygne&#39; light la source se est avérée appropriée pour l&#39;imagerie de la surface du bloc de masse et l&#39;échantillon de tissu incorporé. La position de la source lumineuse a été modifiée par essais et erreurs pour trouver un emplacement et l&#39;angle qui a donné le meilleur éclairage et le contraste à travers le microscope. L&#39;ajout d&#39;une goutte d&#39;eau distillée sur la surface du bloc, au-dessus de l&#39;échantillon, est utile pour réduire la diffraction de trajet de lumière et / ou des distorsions lisses à l&#39;interface air époxy. La figure 4 montre un exemple d&#39;images de tissu rétinien visualisées immédiatement adjacente à une rétine de titane virer de bord en utilisant cette technique. Décollement de la rétine d&#39;artefact non-pliage et peut être vu de chaque côté de la silicone (figure 4A). L&#39;arbre de la punaise est visible intégré dans silicone; la tête de l&#39;amure a pénétré la rétine et la sclérotique. Il est décollement de la rétine non-artefact dans la rétine non coloré et d&#39;autre de la silicone (figure 4C). La technique a montré que, dans ce cas, there est la désorganisation de la rétine à proximité de l&#39;adhésivité et la compression de la rétine due à une côté à un angle oblique d&#39;insertion. A noter que les images présentées ne sont que des illustrations du succès de la technique, et non collante représentant de dommages histopathologie en général. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Figure 1. Placement d&#39;un réseau d&#39;électrodes épirétinienne. (A) Représentation schématique de l&#39;œil montrant une coupe transversale agrandie de la sclérotique postérieure, la choroïde et de la rétine dégénérée (manquant photorécepteurs). Un réseau d&#39;électrodes est représentée en bleu, apposée epiretinally. (B) assisté par ordinateur d&#39;étirage d&#39;un ensemble d&#39;électrode épirétinienne. un, à circuit intégré («puce») et emballage des électrodes; b, titane attache rétinienne; c, le logement de silicone de qualité médicale; d, point de sortie de plomb. Panel A modifiée de un illustrati originauxsur une gracieuseté de Bionic Vision Australia, auteur Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Figure 2. Electrode élimination et la dissection de l&#39;œil. Grande gamme dynamique macro photographies d&#39;un oeil félin énucléé avec amure epiretinal in situ. (A) la fixation Poster avec le fixateur de Davidson pour préserver l&#39;architecture de la rétine 16, l&#39;œil énucléé a été disséqué. Le paquet de réseau d&#39;électrodes a été retiré du support de silicone (contour carré en pointillés indique l&#39;emplacement d&#39;origine du réseau d&#39;électrodes) avec le point d&#39;amure (flèche) et le corps de silicone de l&#39;implant restant. (B) L&#39;œil a été disséqué avec la section longitudinale adjacente à la punaise(Ligne pointillée). Le collant reste noyé dans la paroi postérieure de l&#39;œilleton (flèche), stabilisée principalement par la sclérotique. La section de tissu contenant le point d&#39;amure a été préparé à l&#39;encastrement de résine et de broyage (segment droite), tandis que la section contenant la rétine sous le réseau d&#39;électrodes enlevé a été préparé pour le traitement histologique norme 16 (segment de gauche). Une règle avec incréments de 0,5 mm est indiqué au bas de chaque panneau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Figure 3. Epoxy encastrement et le broyage de la tactique et le tissu rétinien. Photographies de l&#39;époxy et intégré échantillon de tissu aligné, de broyage, de coloration et d&#39;imagerie de la sellerie et les tissus de la rétine. (A) Le tac<html> k échantillon a été noyé dans un bloc de résine époxy. Utilisation du moule, l&#39;échantillon a été orienté de sorte que le plan longitudinal est parallèle au fond du moule. (B) Le bloc époxy durcie contenant l&#39;échantillon de dépoussiérage. (C) Le bloc de résine époxy a été montée dans un porte-échantillon broyage, prêt pour meuler . (D) L&#39;échantillon a été orienté sections afin imagées du tissu du sol contiennent les couches cellulaires de la rétine et l&#39;axe longitudinal de l&#39;amure. (E) L&#39;échantillon a été broyé en utilisant du papier de carbure de silicium sur un broyeur rotatif. (F) La surface au sol de le bloc a été coloré avec du bleu de toluidine pour identifier les couches de la rétine. (G) Le bloc a été rincé à l&#39;eau du robinet pour enlever l&#39;excès de colorant. (H) Le toluidine couches de la rétine colorées en bleu et la sellerie ont été imagées en utilisant un champ de dissection haute puissance. ad / 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figure 4. images de haute et basse puissance de la tactique et de la rétine. À divers moments les images de processus de broyage ont été prises avec un microscope à dissection, montrant des sections longitudinales de l&#39;amure (astérisque) pénétrant à travers l&#39;œil et à la sortie de la sclérotique (&#39;S&#39; ), silicone (hash) et bleu de toluidine teinté et de la rétine non coloré («R») attenant. Notez que ce sont des exemples d&#39;images seulement pour démontrer la technique de visualisation présente, et ne sont pas représentatifs de tous les implants ou tack résultats insertion d&#39;histologie épirétiniennes. restes de sol du câblage de platine sont visibles dans les panneaux AD («W»). (A) de faible puissance, l&#39;image immaculée de la amure pénétrer la rétine et la sclérotique. (B) Haute qualité d&#39;image motorisé du décollement de la rétine et de pliage dans la rétine tache adjacente sur le support de l&#39;image A. silicone (C) image de faible puissance dans au centre de l&#39;arbre de la punaise. <strong&gt; (D) d&#39;image de haute puissance du centre de la punaise de l&#39;image C (E) Dans un échantillon distinct, sans support de silicone, une image de haute puissance du bleu de toluidine rétine teinté sous la garde du collant est indiqué, immédiatement avant broyage de l&#39;arbre de la punaise (F) toluidine normale bleu architecture rétinienne teinté (GCL: de couche de cellules ganglionnaires de la rétine; INL: Couche nucléaire interne; ONL: Couche nucléaire externe; PR: photorécepteurs; T: féline tapetum lucidum). visualisée en utilisant la même technique de broyage . Barres d&#39;échelle dans chaque panneau sont: A et C = 2 mm; B et D = 500 um; E = 200 um; F = 100 um.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks at 

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Les techniques de traitement des yeux implantés avec une prothèse rétinienne pour localisée histopathologique Analyse: Partie 2 épirétinienne implants avec des bords de la rétine

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Research

JoVE Journal

Medicine

11.4K vues.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

Vidéo: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Techniques pour les yeux de traitement implantés avec une prothèse rétinienne pour l&#39;analyse histopathologique localisée

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Recherche

Médecine

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

Quantitative Fundus autofluorescence pour l&#39;évaluation des maladies rétiniennes

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A l&#39;étape par le protocole de l&#39;étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Un modèle aigu rétinienne pour l&#39;évaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are now available for the shoulder, hip, ankle and the first metatarsalphalangeal joint. While providing pain reduction and clinical improvement, progressive degenerative changes of the opposing cartilage are observed in many patients. The mechanisms leading to this damage are not fully understood. This protocol describes a tribological experiment to simulate a metal-on-cartilage pairing and comprehensive analysis of the articular cartilage. Metal implant material is tested against bovine osteochondral cylinders as a model for human articular cartilage. By applying different loads and sliding speeds, physiological loading conditions can be imitated. To provide a comprehensive analysis of the effects on the articular cartilage, histology, metabolic activity and gene expression analysis are described in this protocol. The main advantage of tribological testing is that loading parameters can be adjusted freely to simulate in vivo conditions. Furthermore, different testing solutions might be used to investigate the influence of lubrication or pro-inflammatory agents. By using gene expression analysis for cartilage-specific genes and catabolic genes, early changes in the metabolism of articular chondrocytes in response to mechanical loading might be detected.

This protocol describes the preparation, biotribological testing, and analysis of osteochondral cylinders sliding against metal implant material. Outcome measures included in this protocol are metabolic activity, gene expression and histology.

Essais et analyse biotribologiques du cartilage articulaire glissant contre le métal pour les implants

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induction et analyse du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes transfectées par transposon de la belle endormie

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Transplantation d’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle de primate non humain pour les maladies dégénératives de la rétine

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...