Le financement de ce travail a été fourni par un Passe Garnett et Rodney Williams Memorial Foundation subvention de projet de R. Lim et AJ Camp.

1. Animaux <ol><li> Les souris ont été obtenues auprès du Centre de rongeurs australien (ARC; Perth, Australie) et a tenu à l&#39;Université de Sydney Bosch Animalerie une lumière / obscurité cycle normal de 12 heures à l&#39;enrichissement de l&#39;environnement. Toutes les expériences décrites ont été approuvées par l&#39;Université de Sydney Comité d&#39;éthique animale. </li><li> Des souris mâles et femelles (C57/BL6) ont été utilisés pour toutes les expériences depuis cette souche sont couramment utilisés comme arrière-plan pour la manipulation génétique, et peuvent être considérées comme équivalentes au type sauvage 8-9. </li></ol> 2. Préparation des tissus <ol><li> Préparer 300 ml d&#39;un fluide à base de glycérol artificielle céphalorachidien (ACSF) constitué de (en mM): 26 NaHCO 3, 11 le glucose, le glycérol 250, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl2 et CaCl2 2,5. Avant l&#39;addition de CaCl 2, le gaz de la solution avec carbogène (95% O 2 et 5% de CO 2) pour établir apH de 7,4 et éviter la précipitation de calcium (nébulosité). Congeler la solution dans un congélateur à -80 ° C pendant 45 minutes de telle sorte qu&#39;un coulis de glace est formée. </li><li> Profondément anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg / kg) (Parnell, Alexandrie, Australie) via une injection intra-péritonéale. </li><li> Une fois les réflexes de pincement des membres postérieurs sont des souris de décapiter absents utilisant pointus ciseaux en acier inoxydable et de faire une incision sagittale de la peau avec une lame de rasoir (arrondi n ° 22) pour exposer le crâne. A ce stade et dans les étapes 2.3-2.8 la voûte crânienne, le cerveau, et l&#39;appareil vestibulaire sous-jacente doivent être aussi frais que possible par l&#39;application régulière de ACSF glacée sur le tissu. </li><li> En utilisant le bras de ciseaux pointus de modèle standard (FST, North Vancouver, Canada) faire une petite incision dans le crâne à Lambda et couper le long de la suture sagittale. Assurez-vous que le cerveau n&#39;est pas «traîné» par la lame de cisaillement lors de cette étape. </li><li> Retirer délicatement les os pariétaux loin latéralement et l&#39;os occipital posteriorly avec une faible courbure Pearson rongeurs (FST). </li><li> Une petite spatule en acier inoxydable est ensuite utilisé pour soulever légèrement le cerveau de la surface de la fosse crânienne médiane et postérieure, et le nerf vestibulocochlea exposée (CNVIII) coupée à mi-chemin entre l&#39;oreille interne et le tronc avec une paire de ciseaux iris fines. Couper ce nerf minimise tension indue sur les axones des afférences primaires et leurs connexions avec les cellules ciliées. </li><li> Après la section transversale du CN VIII le cerveau est prélevé dans sa totalité. </li><li> Le labyrinthe vestibulaire est maintenant clairement visible dans la fosse cérébrale moyenne, avec la cochlée pointant anteromedially. Rongeur de chaque côté du labyrinthe vestibulaire avant exciser doucement en saisissant le canal semi-circulaire antérieur et en tirant latéralement. </li><li> Plonger les labyrinthes excisées (figure 1) dans un plat contenant la dissection glacée, ACSF gazés en continu décrit dans la section 2.1. En vertu d&#39;une loupe binoculaire, maintenez le labyrinthe dele fond de la coupelle par préhension de la cochlée. Utilisez une pince fine à gratter à l&#39;os recouvrant l&#39;ampoule du canal semi-circulaire antérieur. Une fois un petit trou dans l&#39;os est atteint commencer à feuilleter l&#39;os loin de l&#39;ampoule. Il faut faire attention à ne pas pousser la pince à travers l&#39;os, car cela peut endommager le labyrinthe membraneux sous-jacente et de l&#39;épithélium sensoriel. Continuez cette procédure jusqu&#39;à ce que les deux la partie antérieure et conduits semi-circulaires membraneux horizontales adjacentes et ampoules sont exposés (figure 2). </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Figure 1. La souris labyrinthe vestibulaire isolée. A. Le panneau de gauche) Représentation schématique de la souris labyrinthe vestibulaire isolée. Points de référence importants pour accéder à l&#39;épithélium vestibulaire sensoriel, la cochlée, antérieure et horizontal canaux semi-circulaires sont labofirent du. Les astérisques indiquent l&#39;ampoule du canal semi-circulaire contenant l&#39;épithélium vestibulaire sensoriel. B. Panneau de droite) Photomicrograph du labyrinthe vestibulaire isolée à partir d&#39;une souris 1-month-old. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;exposition du labyrinthe vestibulaire membraneux. L&#39;os recouvrant les ampoules des canaux semi-circulaire antérieure et horizontales ont été rayés pour révéler les ampoules membraneux noir / brun moucheté et les nerfs ampullaires associés (CNVIII). Le schéma dans le panneau du bas représente les structures dans la région en surbrillance de la microphotographie et montre la relation entre les conduits de canal semi-circulaire pour les ampoules et CNVIII. <ol start="10"><li> En utilisant des pinces fines, soulevez doucement les ampoules et utricle associé loin du labyrinthe osseux, veiller à ce que la région centrale de la ampoules (containing l&#39;épithélium sensoriel) ne soit pas endommagé. Dans certains cas, la partie proximale du canal semi-circulaire membraneux peut être nécessaire de couper avec des ciseaux iris pour libérer les ampoules de l&#39;os. </li><li> Transférer la triade contenant deux ampoules et utricle dans une boîte de Pétri remplie avec-15 L de milieu de culture de Leibovitz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Utilisez une fibre optique à &quot;backlight&quot; le tissu. Cela permet une visualisation claire de la crête contenant l&#39;épithélium sensoriel dans le ampoules. </li><li> Faites une nouvelle incision dans le &quot;toit&quot; moucheté de l&#39;utricule avec les ciseaux iris fines. Poursuivre cette incision à travers le toit de la partie antérieure, puis les ampoules horizontales. Réaliser l&#39;incision la plus proche du bord de l&#39;épithélium sensoriel que possible, sans mise en contact (figure 3A). S&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de morceaux de membrane recouvrant l&#39;épithélium sensoriel (figure 3B) </li><li> Transférer la préparation intacte semi-isolé pour un petit verrechambre d&#39;enregistrement S-fond rempli de L-15 des médias. Peser la préparation à l&#39;aide d&#39;une grille de fibres de nylon fines fixées à un fil de platine en forme de U aplati (figure 3B). Idéalement, les fibres de la grille ne doivent pas recouvrir l&#39;épithélium sensoriel, cependant, dans certains cas où une plus grande stabilité est requise, une seule fibre sectionnant l&#39;épithélium sensoriel peut-être préféré. </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Figure 3. La préparation semi-intactes isolées de l&#39;épithélium. A. Représentation schématique sensorielle vestibulaire de la préparation semi-intacte et de la configuration d&#39;électrode. L&#39;ampoule recouvrant la crête a été «dé-couverte&quot; pour exposer la surface de l&#39;épithélium sensoriel (vert). B. Photomicrograph de la préparation semi-intactes «triade» montrant la partie antérieure (AC) et horizontale (hc) Crista (utricle obscurci êtrehind ac). Noter la fibre de nylon utilisée pour fixer la préparation de la base de la chambre d&#39;enregistrement. Barre d&#39;échelle:. 100 um C. Une électrode d&#39;enregistrement placé sur une cellule de cheveux vestibulaire individu. Barre d&#39;échelle: 15 um. 3. Électrophysiologie <ol><li> Perfuser la préparation semi-intact avec oxygéné en permanence milieu L-15. Le support contient un indicateur de pH (rouge de phénol) et la couleur du milieu doit être surveillée pendant les enregistrements. Le pH avec de l&#39;oxygène doit être 7.3 à 7.4 et correspondent à une couleur rouge. </li><li> Préparer pipettes d&#39;enregistrement de 1,5 mm (1,19 mm de diamètre) en verre borosilicate en utilisant un protocole en deux étapes (étape de chaleur 1: 72, et l&#39;étape de chaleur 2: 50) sur un extracteur micropipette (Narishige, le Japon, le modèle PP-830) pour atteindre un impédance finale de 3-4 MQ. </li><li> Remplir la tige de la pipette à 3-4 mm de la solution interne à base de fluorure de potassium contenant (en mM) 110 KF, KCl 12, 27 KOH, NaCl 1, HEPES 10, EGTA 10, 1.8 de MgCl2,3 D-glucose et 2-Na ATP; pH 7,4 avec KOH. </li><li> Enrouler la tige de la pipette et 3.2 fois aussi loin de la pointe que possible avec une mince bande de parafilm pour isoler l&#39;électrode et de réduire la capacité de la pipette. </li><li> Placez la pipette sur l&#39;épithélium sensoriel à faible grossissement de puissance (5X) sur un microscope droit (Olympus BX51). Passer à haute puissance (40X) et de visualiser les cellules ciliées vestibulaires individuels avec une caméra CCD ci-joint. </li><li> pipette de position sur la membrane d&#39;une cellule de cheveux visualisées (figure 3C) à l&#39;aide d&#39;un micromanipulateur (Sutter Instruments, Californie, USA). Une fois un joint d&#39;étanchéité gigaohm soit atteint, la rupture de la membrane cellulaire avec une petite quantité de pression négative appliquée à travers un orifice d&#39;aspiration sur le porte-pipette. </li><li> Faire des enregistrements de serrage de tension de cellules entières en utilisant des techniques standard 8-9. </li></ol> 4. Microscopie à deux photons <ol><li> Préparer une solution saline à 0,9% contenant 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB-1; sel hexapotassique; Invitrogen, Allemagne). </li><li> Alors qu&#39;il était encore submergée, placez le «dé-couverte&quot; préparation de triade semi-intactes sur un petit morceau de papier filtre (4x4 mm, 0,8 um d&#39;épaisseur, Millipore, Allemagne) veiller à ce que l&#39;épithélium sensoriel est dégagée par le haut. </li><li> Transférer le papier filtre et de la préparation sur le couvert électrode de platine de base et une solution saline (7 pi) d&#39;un électroporateur consistant en la combinaison d&#39;un générateur d&#39;impulsions et d&#39;un amplificateur à large bande, et le couvercle avec un autre 5 ul de solution à 5 mM de calcium synthétique indicateur colorant Oregon Green 488 BAPTA-1 (figure 4). </li></ol><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> Figure 4. Électroporation vrac. A. section de configuration d&#39;électroporation schématique. La préparation semi-intacte (*) est placé sur une feuille de papier filtre immergé dans dy de calciume (Oregon Green 488 BAPTA-1) et le courant appliqué entre les deux électrodes de platine. Adapté de Briggman et Euler 2011 10. <ol start="4"><li> Apportez le haut électrode de platine parallèle avec l&#39;électrode de base à une distance d&#39;environ 2 mm, en prenant soin de ne pas perturber l&#39;orientation de la préparation lorsque le contact avec le Green 488 BAPTA-1 solution Oregon est faite. </li><li> Passez une brève impulsion de courant à travers la préparation (Paramètres pour le courant, +13 V, 10 msec largeur d&#39;impulsion, fréquence de 1 Hz, 10 impulsions rectangulaires) 10-11. </li><li> Sur le fond d&#39;une chambre d&#39;enregistrement à fond de verre rempli de milieu L-15, placez une petite goutte d&#39;huile de silicone et la position de la préparation semi-intact sur elle, assurant à nouveau que l&#39;épithélium sensoriel est dégagée par le haut. Pour assurer la stabilité tout au long de l&#39;imagerie, remplacez la grille de nylon sur la préparation comme décrit ci-dessus (voir point 2.13). </li><li> Utilisation du microscope à deux photons faire des enregistrements optiques de sponactivité de calcium tanée dans l&#39;épithélium sensoriel (figure 7) en utilisant les protocoles classiques d&#39;imagerie 10-11. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses.">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li><li>Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+pre-+and+post-synaptic+recording+from+the+peripheral+vestibular+calyx+and+its+included+type+I+hair+cell.">Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell.</a> , (2009).</li><li>Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+dependent+currents+in+type+I+and+II+hair+cell+and+calyx+terminals+of+primary+afferents+in+an+intact+in+vitro+mouse+vestibular+crista+preparation.">Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation.</a> , (2009).</li><li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista.">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> , (2010).</li><li>Songer, J. E., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+the+mammalian+saccule.">Transduction in the mammalian saccule.</a> , (2010).</li><li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear.">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li><li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista.">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li><li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro.">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li><li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons.">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li><li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals.">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris.">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les mécanismes qui sous-tendent notre sens de l&#39;équilibre ont reçu une attention limitée en comparaison avec d&#39;autres systèmes sensoriels, par exemple, les systèmes visuels et auditifs. Parmi les études qui ont examiné les changements dans la fonction vestibulaire ou de l&#39;équilibre, la plupart ont mis l&#39;accent sur des mesures comportementales, y compris le réflexe vestibulo-oculaire, avec une connaissance incomplète des composantes fondamentales de-la balance cellules ciliées vestibu...

Malgré l&#39;importante contribution du système vestibulaire de notre vie quotidienne, une bonne compréhension des processus responsables de la baisse observée dans la fonction vestibulaire avec l&#39;âge reste insaisissable. Une des raisons de ce manque de connaissances est que le déclin de la fonction vestibulaire a presque exclusivement été explorée en utilisant des tests comportementaux, y compris le réflexe vestibulo-oculaire (VOR), un indicateur précis de la fonction vestibulaire extrinsèque, mais donne un aperçu limité dans les changements de composantes intrinsèques . Il s&#39;agit d&#39;un obstacle majeur à notre compréhension de la fonction des cellules ciliées vestibulaires dans la santé, la maladie ou le vieillissement. Même s&#39;il ya eu de nombreuses études sur les cellules ciliées vestibulaires individuels, une lacune majeure a été le recours à des préparations de cellules de cheveux courte durée, où les cellules ciliées et les terminaisons afférentes même calice sont retirés de leur environnement normal via un traitement mécanique et / ou enzymatique. Approches telles inéviBly perturber la microarchitecture délicat entre cellules ciliées et le calice, et les cheveux cellule et la cellule de soutien. Avec le développement de préparations semi-intactes 1-5, et une souris préparation du labyrinthe isolé 6, il ya maintenant une occasion d&#39;étudier les différentes formes de communication synaptique dans des conditions qui ressemblent davantage à celles in vivo. En effet, Lim et al. (2011) ont montré des différences marquées dans les courants de cellules entières enregistrées à partir du type aigu isolé je cellules ciliées vestibulaires rapport à ceux qui sont restés ancrés dans le neuroépithélium. Plus précisément, le potassium est pensé pour s&#39;accumuler dans l&#39;espace intercellulaire, entre la cellule de cheveux et le calice afférente, et modifie considérablement la réponse des cellules de cheveux 7. Ce type d&#39;information serait impossible à obtenir sans la préparation semi-intact de l&#39;épithélium vestibulaire sensoriel décrit ici. Nous démontrons la préparation semi-intactes de la crête souris 3Et montrer des résultats représentatifs obtenus à partir de cellules entières correctif électrophysiologie et d&#39;imagerie calcique biphotonique.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz medium L-15</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L4386-10X1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA-1-oregon green</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>O6806 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereo microscope</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>A60S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>BX51WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two-photon microscope</td>
 <td>Olympus/La Vision</td>
 <td>BX51WI/ TriMScope II</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 SF Forceps</td>
 <td>FST</td>
 <td>11252-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
 <td>FST</td>
 <td>16221-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>14001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>InstraTECH A-D converter</td>
 <td>HEKA</td>
 <td>ITC-18</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sutter Micromanipulator</td>
 <td>Sutter</td>
 <td>MP-225/M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>multiclamp amplifier</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 <td>700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data acquisition software (electrophysiology)</td>
 <td>Axograph</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imspector Data acquisition software (two-photon)</td>
 <td>Max Planck innovation</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy

Comprendre les cellules ciliées vestibulaires fonctionnent dans des conditions normales, ou comment un traumatisme, la maladie et le vieillissement perturber cette fonction est une étape essentielle dans le développement d&#39;approches préventives et / ou de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, la majorité des études portant sur la fonction vestibulaire anormal n&#39;ont pas été au niveau cellulaire mais porté principalement sur des analyses comportementales des troubles vestibulaires telles que les analyses de la marche et de la performance réflexe vestibulo-oculaire. Bien que ce travail a donné de précieuses informations sur ce qui se passe quand les choses vont mal, peu d&#39;informations ont été glanées sur les causes sous-jacentes de dysfonctionnement. Parmi les études qui se concentrent sur les processus cellulaires et sous-cellulaires qui sous-tendent la fonction vestibulaire, la plupart ont invoqué aiguë cellules ciliées isolés, dépourvus de leurs connexions synaptiques et de l&#39;environnement de la cellule d&#39;appui. Par conséquent, un défi technique majeur a été l&#39;accès aux cellules ciliées vestibulaires extrêmement sensible dans un preparation qui est moins perturbé, physiologiquement. Ici, nous démontrons une préparation semi-intactes de la souris épithélium vestibulaire sensoriel qui conserve le micro-environnement local, y compris des cellules ciliées / complexes afférentes primaires.

Les propriétés électrophysiologiques des cellules ciliées vestibulaires sont tributaires de la microarchitecture complexe dans lequel ils sont intégrés 7. Figure 5 montre que la préparation de l&#39;épithélium vestibulaire semi-intactes peut être utilisé pour différencier type I cellules ciliées (figure 5A), les cellules ciliées de type II (figure 5B), et le calice primaire afférente (figure 5C) sur la base de conductances de c...

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An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Analyse de la fonction des cellules ciliées vestibulaires est compliquée par leur localisation profonde dans la partie la plus difficile du crâne, l&#39;os temporal rocher. La plupart des études sur les cellules capillaires fonctionnels ont utilisé intensément les cellules ciliées isolées. Nous décrivons ici une préparation semi-intactes de souris épithélium vestibulaire pour les études de microscopie électrophysiologiques et à deux photons.

Une préparation semi-intact d&#39;isolement de la souris vestibulaire épithélium sensoriel pour électrophysiologie et haute résolution microscopie à deux photons

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K vues.  University of Sydney. Analyse de la fonction des cellules ciliées vestibulaires est compliquée par leur localisation profonde dans la partie la plus difficile du crâne, l'os temporal rocher. La plupart des études sur les cellules capillaires fonctionnels ont utilisé intensément les cellules ciliées isolées. Nous décrivons ici une préparation semi-intactes de souris épithélium vestibulaire pour les études de microscopie électrophysiologiques et à deux photons.

Vidéo: An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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Neurosciences

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Préparation des tissus et des fibres Immunocoloration souris nerveuses sensitives innervant la peau et les os du membre

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantification de l&#39;architecture vasculaire cérébral en utilisant la microscopie à deux photons dans un modèle de souris de la neuro-inflammation induite par le VIH

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.