Nous remercions Gillian Stanfield de commentaires sur le manuscrit. TAJ est soutenu par l&#39;Université de l&#39;Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 de NIGMS NIH.

1. Mosaic Generation <ol><li> Génétique Croix w FRT 19A bain: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (mâles) X * FRT 19A / Bal (femelles), où * représente le mutant à examiner. Note: Mettre en place traverser au moins un jour avant l&#39;expérience, car cela permet aux animaux de s&#39;accoupler de façon appropriée. </li><li> Pré-lay: croix de transfert des flacons voler alimentaires avec une petite tache de pâte de levure fraîche placé sur le support. Laisser poser pendant 1 heure à 25 ° C. </li><li> Lay: animaux de transfert de pré-mise flacon à un nouveau flacon avec une petite tache de pâte de levure fraîche. Laisser poser pendant 6 heures à 25 ° C. </li><li> adultes de transfert retour à pré-Lay flacon pour le stockage et l&#39;utilisation dans des expériences ultérieures. Choc thermique immédiatement le flacon laïque contenant 0-6 h embryons pendant 45 min à 38 ° C, dans un bain d&#39;eau en circulation. Remarque: La surface de l&#39;aliment devrait être en dessous du niveau de l&#39;eau pour vérifier tousembryons sont correctement choc thermique. </li><li> Incuber les flacons choc thermique à 25 ° C pendant 4-5 jours jusqu&#39;à la troisième larves commencent à se promener. </li></ol> 2. Écran pour Mosaic Animaux <ol><li> En utilisant des pinces fines ramasser doucement errance larves de troisième stade larvaire sur les côtés du flacon et placez-les dans réfrigéré 100% de glycérol dans une petite plaque en plastique. </li><li> Examiner les larves à l&#39;aide d&#39;un microscope grossissement dissection haut équipé d&#39;optiques fluorescentes. Identifier les larves avec l&#39;expression de la mosaïque de cellules trachéales marquées par fluorescence. Typiquement, cela peut être fait à 10 grossissement de 20x. </li></ol> 3. Fixation de la chaleur <ol><li> En utilisant des pinces fines choisir soigneusement les animaux de mosaïque sur le plat et le placer dans une goutte de frais 100% de glycérol sur un mm verre blanc lame de microscope 75x25x1. Remarque: plusieurs animaux peuvent être placés dans la liste (figure 1A). Les animaux peuvent également être placés dans une goutte de glycérine directement sur une lamelle,mais il faut faire attention lors de la fixation (étape 3.2), que les animaux vont chauffer très rapidement et peuvent devenir trop fixe. </li><li> Placer la lame de verre sur 70 ° bloc thermique C jusqu&#39;à ce que les animaux s&#39;arrête pas bouger, pas plus de 20 secondes pour une diapositive, et 10 sec pour une lamelle (figure 1B). Les animaux se soustraire au départ, mais arrêter et devenir rigide et allongé une fois mort. Note: exposition trop longue à la chaleur peut endommager les branches terminales et lumières ainsi que de faire le signal GFP faible et diffus. Pour une efficacité optimale, il est recommandé d&#39;avoir le bloc de chaleur dans la même pièce que les microscopes. </li><li> Utilisation de pinces fines soin d&#39;orienter toutes les larves à la baisse dans une seule direction, de telle sorte que toutes les larves sur la lame sont orientées parallèlement les unes aux autres (figure 1C). </li><li> Placez délicatement une lamelle micro 18x18mm au-dessus de larves (ou inverser la lamelle sur une lame de verre) et éviter les bulles en forme (figure 1D). Note: lamelle ne peut trouver exactementplat sur les larves, ce n&#39;est pas un problème. </li><li> Les larves de l&#39;image dans 30 min. Cellules terminales fixes chaleur va se dégrader et le signal de GFP deviendront très diffuse. </li></ol> 4. L&#39;imagerie in vivo de cellules terminales trachéales <ol><li> Placer la lame sur la scène d&#39;un microscope stéréoscopique composé. L&#39;utilisation d&#39;un objectif 5x localiser les deux troncs dorsaux parallèles qui courent d&#39;avant en arrière sur la face dorsale de l&#39;animal (figure 1F). Repérez les deux cellules terminales dorsales, directement entre les deux troncs dorsaux. Cela permet d&#39;identifier le segment approprié pour l&#39;analyse. </li><li> Une fois orienté, tournez les animaux Image cellules terminales désirées. Pour ce faire, poussez délicatement la lamelle sur le bord avec les forceps perpendiculaires à l&#39;axe longitudinal de la larve, en roulant lentement les larves sous la lamelle (figures 1E et 1G). </li><li> Sélection des cellules terminales appropriées est essentiel pour des résultats constantset les comparaisons entre les mutants. Cellules terminales au Service de la graisse corporelle (FB) sont faciles à trouver à côté du tronc dorsal, latéral de la ligne médiane. Les cellules de la borne G du groupe latérales (LG) sont faciles à trouver et sont situés juste en dehors de la ligne médiane ventrale (figure 1H). Remarque: en (RT10) les segments les plus antérieures (Tr1) et postérieure la disposition de la cellule de terminal est divergente des autres segments. Nous n&#39;analysons cellules terminales des segments TR2-Tr9. Cellules terminales dorsales ont un schéma de branchement plus stéréotypée que les autres cellules terminales trachéales. Cela peut dépendre de signaux autonomes supplémentaires, non-cellulaires, et cela devrait être considéré au moment de décider de les inclure dans l&#39;analyse. </li><li> Une fois qu&#39;une cellule terminale d&#39;intérêt a été identifié, capturer une image en utilisant le grossissement souhaité, typiquement 10X ou 20X est meilleur (figure 2A). Note: en raison d&#39;une ramification variables, essayer de capturer des images qui comprennent autant de branches et des conseils de succursales que possible. </li><li> Sans bouger la scène, éteindre la fluorescence et allumer la lumière transmise pour capturer une image en fond clair de la même cellule et le plan focal (figure 2B). La lumière sera visualisé comme sombre contrastant à l&#39;intérieur de l&#39;espace de cellule de terminal. Si la planification de quantifier les branches et les lumens des cellules terminales, de recueillir des images multiples dans plusieurs plans focaux de chaque cellule de terminal. </li></ol> 5. L&#39;analyse et la quantification des terminal morphologie cellulaire en utilisant ImageJ <ol><li> Ouvrez les images fluorescentes et brightfield utilisant le ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Utilisation de l&#39;outil «tracés Ajouter&quot;, tracer manuellement les branches et la lumière de la cellule terminale entier. </li><li> Utilisation de l&#39;outil «tracés d&#39;étiquettes&quot;, renommer et recolor d&#39;attribuer à chaque ligne dans la trace d&#39;une désignation spécifique. </li><li> Utilisation de l&#39;outil &quot;Set paramètres&quot;, ajuster la largeur de la ligne 6 à 10 pixels (pour 512x512 images issues de la caméra numérique reliée au microscope composé. Pour les caméras de résolution supérieure ou inférieure, la largeur de pixel doit être réduite de façon appropriée), en utilisant tous d&#39;autres paramètres par défaut et cliquez sur &quot;OK&quot;. Ensuite, utilisez la fonction &quot;Faire instantané» pour prendre une image. Choisissez «Dessine trace&quot; pour obtenir un instantané de la trace qui peuvent être indiquées côte-à-côte avec l&#39;original. </li><li> Sélectionnez l&#39;outil «tracés de mesure» et sélectionnez le type de traçage (ie qui se ramifie à mesure fondée sur les désignations spécifiques assignées à l&#39;étape 5.3). Ensuite, sélectionnez &quot;Afficher les mesures de traçage&quot; et &quot;les mesures précédentes claires&quot; puis cliquez sur &quot;Exécuter&quot;. Ceci va produire une feuille de calcul qui contient le nom, l&#39;étiquette, la longueur (en pixels) et d&#39;autres données de l&#39;image. Ces données peuvent ensuite être enregistrées dans un tableur Microsoft Excel pour plus de statistiquesanalyse. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier compétition.

La technique de fixation à la chaleur décrit ici est un outil rapide et pratique pour drosophile cellules terminales trachéales larvaires imagerie. Ici, nous utilisons cette technique pour examiner le branchement et le modèle lumen des cellules de type sauvage. Cellules trachéales exprimant la GFP, dirigé par le promoteur spécifique trachéale à bout de souffle, peuvent être facilement visualisées à travers la cuticule des larves après la fixation de la chaleur. Les schémas de branchement ...

la forme des cellules est essentiel pour la fonction de cellules individuelles au sein d&#39;un organisme, ainsi que des cellules qui fonctionnent comme une partie d&#39;un tissu ou d&#39;organe. Nous utilisons des cellules terminales trachée chez la drosophile, une composante du système respiratoire des insectes, pour étudier les mécanismes moléculaires qui participent à contrôler deux types conservées de la morphologie cellulaire: L&#39;éclaircie et la formation du tube (lumenogenesis). cellules de terminaux sont situés à l&#39;extrémité d&#39;un réseau de tubes ramifiés qui sert à fournir de l&#39;oxygène aux tissus internes 1 et ont une morphologie ramifiée complexe qui dépend d&#39;une voie de signalisation FGF qui est contrôlée par les niveaux d&#39;oxygène dans les tissus locaux cibles 2. branches de la cellule de terminaux sont des tubes minces, avec un gaz remplies de lumière sub-cellulaires fonctionnant par chaque branche. Les architectures cellulaires distincts de cellules terminales, ainsi que la facilité avec laquelle l&#39;analyse génétique peut être réalisée chez la drosophile, font de ces cellules un excellent modèle fou mécanismes d&#39;excroissance cellulaire enquête, la ramification et la formation du tube intracellulaire. cellules terminales sont avérés un modèle utile pour comprendre certaines des voies de signalisation conduisant à la différenciation cellulaire ramifiée, excroissance, et la maturation 2-4. Grâce à ce système impartial, écrans avant génétiques pour mutants de morphogenèse cellulaires ont été réalisées, ce qui donne un aperçu des mécanismes de contrôle de la forme des cellules 5,6. Par exemple, ces écrans ont révélé qu&#39;un RabGAP spécifique est nécessaire pour la polarité du cytosquelette et le trafic vésiculaire dans la formation de lumière et de positionnement 7; que l&#39;adhésion médiée par l&#39;intégrine est nécessaire pour la stabilité de la branche 8, et que les protéines PAR-polarité épithéliale réguler le trafic membranaire polarisée requis à la fois pour la ramification et formation de lumière 9. D&#39;autres études dans des cellules de terminaux ont montré que l&#39;accumulation d&#39;actine asymétrique et l&#39;organisation des microtubules est nécessaire à l&#39;élongation cellulaire et lumenogenesis <sup&gt; 10. Ainsi, la diversité des mécanismes biologiques, conservées par les cellules contribuent à la morphogenèse des cellules en phase terminale. Ici, nous décrivons une méthode pour fixer rapidement intact troisième stade larves de drosophile pour l&#39;analyse des cellules ramification de terminal et formation de lumière. Ce protocole peut aussi être réalisée à la fois premier et deuxième animaux de stade. La clé de cette technique est la possibilité de visualiser les cellules terminales qui sont génétiquement marquées par l&#39;expression de la protéine fluorescente directement à travers la cuticule des larves d&#39;animaux intacts. Depuis que cette procédure ne nécessite pas de manipulations post-fixation, tels que la coloration d&#39;anticorps, d&#39;observer les cellules, il est bien adapté à l&#39;analyse à haut débit, y compris le dépistage génétique ou de drogue. Expression de la protéine fluorescente révèle la structure des branches cytoplasme remplis. la formation du tube peut être contrôlée en parallèle en utilisant la microscopie à champ clair d&#39;identifier la lumière remplie de gaz, ce qui contraste avec le fluide environnant-filltissus éd. Inclus dans ce protocole est la méthode pour générer des mosaïques génétiques basés sur le système marcm 11, pour produire des cellules mutantes homozygotes terminaux étiquetés avec des protéines fluorescentes dans les animaux autrement non étiquetés. Cela est nécessaire, car les cellules terminales seulement élaborer leurs structures complexes relativement tard dans le développement; mosaïques génétiques permettent de contournement des exigences de gènes dans d&#39;autres tissus plus tôt dans le développement. . Pour générer des clones marcm, de la trachée sont étiquetés en utilisant le pilote spécifique à bout de souffle trachéal (BTL) 12 décrit ici est le protocole pour le chromosome X chez la drosophile, car d&#39;autres chromosomes, une procédure similaire peut être utilisée, avec des réactifs génétique approprié au chromosome étant examiné. Ici, la trachée sont marquées par l&#39;expression d&#39;une GFP localisée dans le cytoplasme, mais la procédure fonctionne aussi bien avec l&#39;expression d&#39;autres protéines fluorescentes, comme DsRed. En outre, nous avons inclus une méthode pour quantifier les schémas de branchement et la formation de lumière dans les cellules terminales, basée sur des méthodes développées pour déterminer les caractéristiques de la branche neuronales 13. Ce genre de données quantitatives peut être critique pour discerner le rôle exact de gènes dans le processus de branchement ou lumenogenesis, ainsi que de permettre des comparaisons directes entre les différents mutants 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

la forme des cellules est essentiel pour la fonction cellulaire. Cependant, malgré l&#39;importance de la morphologie des cellules, on en sait peu sur la façon dont les cellules individuelles génèrent des formes spécifiques. Cellules terminales trachéales drosophile sont devenus un modèle génétique puissant pour identifier et élucider les rôles des gènes nécessaires pour générer des morphologies cellulaires. des cellules de bornes sont un composant d&#39;un réseau tubulaire ramifiée, le système trachéal qui fonctionne pour fournir de l&#39;oxygène aux tissus internes. cellules terminales sont un excellent modèle pour étudier les questions de la forme des cellules car ils possèdent deux architectures cellulaires distincts. Tout d&#39;abord, les cellules terminales ont une morphologie ramifiée complexe, semblable à des neurones complexes, deuxièmement, branches de cellules terminales sont formées comme des tubes minces et contiennent une lumière intracellulaire membranaire. L&#39;analyse quantitative de nombre de succursales de la cellule terminale, l&#39;organisation de la branche et la forme de la branche individuelle, peut être utilisé pour fournir des informations sur le rôle de mech génétique spécifiquenismes dans la fabrication d&#39;une cellule ramifiée. L&#39;analyse de la formation du tube dans ces cellules peuvent révéler des mécanismes conservées de tubulogenèse communs à d&#39;autres réseaux tubulaires, tels que le système vasculaire vertébré. Nous décrivons ici les techniques qui peuvent être utilisés pour fixer rapidement, l&#39;image et analyser à la fois les modèles de branchement et la formation de tubes dans les cellules de terminaux au sein de larves de drosophile. Ces techniques peuvent être utilisées pour analyser les cellules terminales chez les animaux de type sauvage et mutant, ou des mosaïques génétiques. En raison de la grande efficacité de ce protocole, il est également bien adapté pour les écrans de drogue dans le système trachéal Drosophila génétique, basées sur l&#39;ARNi, ou.

Les résultats sont présentés dans la figure 2. Un groupe latéral unique (LG) de la cellule terminale montre très étendue ramification subcellulaire (visualisé par la GFP; A) et rempli de gaz subcellulaires lumière traversant chacune des branches (visualisées par microscopie en fond clair, B). Ces images ont été recueillies à partir d&#39;une mosaïque L3 larve, généré en utilisant le système de marcm décrit dans les sections 1 et 2, et de la chaleur fixes et imagés, tels que décrits d...

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Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Ici, nous présentons une méthode pour l&#39;analyse de microscopie optique des cellules trachéales terminaux en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves. Cette méthode permet d&#39;examen rapide de la branche et de la morphologie de la lumière dans des animaux entiers et serait utile pour l&#39;analyse des mutants individuels ou écrans pour les mutations affectant le développement des cellules terminal.

Examen de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaires cellules terminales trachéales par microscopie optique

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

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JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K vues.  University of Utah. Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse de microscopie optique des cellules trachéales terminaux en Drosophila Larves. Cette méthode permet d'examen rapide de la branche et de la morphologie de la lumière dans des animaux entiers et serait utile pour l'analyse des mutants individuels ou écrans pour les mutations affectant le développement des cellules terminal.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Recherche

Biologie

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophile larvaire JNM Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophile larvaire JNM immunohistochimie

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

Synapses présynaptique silencieux étudiée en microscopie optique

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Mesure de larves activité dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Moniteur d&#39;activité

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...