Biz el yazması yapılan yorumlar için Gillian Stanfield teşekkür ederim. TAJ NIH NIGMS Utah Genetik Eğitim Grant T32-GM007464 Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

1. Mozaik Üretimi <ol><li> Genetik Çapraz w FRT 19A küvet: Gal80 FLP 122 / Y, Pak-GAL4, UAS-GFP (erkek) X * incelenecek mutant temsil * FRT 19A / Bal (kadın),. Not: Bu hayvanların uygun arkadaşı için izin verdiği, önce deneme için en az bir gün çapraz kurun. </li><li> Ön yatıyordu: Transferi çapraz Ortama yerleştirilen yaş maya hamur küçük bir smear ile uçmak-gıda şişeleri için. 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca girebilmesine izin verir </li><li> Lay: öncesi yatıyordu şişe Transfer hayvanların yaş maya hamur küçük bir smear ile yeni bir flakon. 25 ° C&#39;de 6 saat boyunca girebilmesine izin verir </li><li> Transferi yetişkin geri depolama ve sonraki deneylerde kullanılmak üzere şişe önceden bırakmaya. Hemen ısı şok bir dolaşan su banyosunda 38 ° C&#39;de 45 dakika, için 0-6 saat eski embriyoları içeren yatıyordu flakon. Not: gıda yüzeyinin tamamını doğrulamak için, su seviyesinin altında olmalıdırEmbriyolar uygun ısı şokuna. </li><li> Üçüncü dönem larva dolaşmaya başlayıncaya kadar 4-5 gün boyunca 25 ° C&#39;de ısı şok şişeleri inkübe edin. </li></ol> 2. Mozaik Hayvanlar için ekran <ol><li> Ince forseps kullanarak yavaşça flakon taraftan dolaşıp üçüncü evre larvaları almak ve küçük bir plastik plaka soğutulmuş% 100 gliserol içine yerleştirin. </li><li> Floresan optik ile donatılmış yüksek büyütme-diseksiyon mikroskobu kullanılarak larva inceleyin. Floresan etiketli trakeal hücrelerinin mozaik ifade ile larva tanımlayın. Tipik haliyle, bu 10-20X büyütme ile yapılabilir. </li></ol> 3. Isı Fixation <ol><li> Ince forseps kullanarak dikkatli bir 75x25x1 mm beyaz cam mikroskop lamı üzerine taze% 100 gliserol bir damla çanak ve yer mozaik hayvanlar ortaya çıkarmak. Not: birden fazla hayvan damla (Şekil 1A) yerleştirilebilir. Hayvanlar ayrıca, doğrudan doğruya, bir lamel üzerine gliserol bir damla yerleştirilebilirhayvanların çok hızlı bir şekilde ısı ve aşırı sabit olabilir gibi ama bakım, sabitleme (adım 3.2) sırasında alınmalıdır. </li><li> Hayvanlar kadar 70 ° C ısı bloğu üzerine yerleştirin cam slayt sadece bir kapak kayma (Şekil 1B) için bir slayt, ve 10 saniye, en fazla 20 saniye hareket durdurmak. Hayvanlar ilk sıyrılmak olacak ama durdurmak ve sert ve uzun bir kez ölü olmak. Not: ısıya gereğinden fazla maruz kalma hem de GFP sinyal loş ve yaygın yapmak gibi terminali şube ve lümen zarar verir. Optimum verimlilik için bu mikroskoplar aynı odada ısı bloğu olması tavsiye edilir. </li><li> Ince forseps kullanarak dikkatli bir şekilde yönlendirmek slayt tüm larvaları birbirine (Şekil 1C) paralel bulunmaktadır böyle tek yönde açılan tüm larvaları,. </li><li> Yavaşça larva üst (veya bir cam slayt üzerine lamel ters) bir 18x18mm mikro cam kapak yerleştirin ve şekillendirme kabarcıklar (Şekil 1D) kaçının. Not: lamel tam olarak yalan değillarvaları üzerinde olabildiğince düz, bu bir sorun değildir. </li><li> 30 dakika içinde görüntü larvaları. Isı sabit terminal hücreleri düşer ve GFP sinyal çok yaygın olacak. </li></ol> 4. Trakeal Terminal Hücre In vivo Görüntüleme <ol><li> Bir bileşik stereomikroskopta sahnede slayt yerleştirin. 5X amacı hayvanın sırt yüzeyi (Şekil 1F) üzerinde posterior anterior çalışan iki paralel dorsal gövdeleri bulun kullanma. Doğrudan iki dorsal gövdeleri arasındaki iki dorsal terminali hücreleri, bulun. Bu analiz için uygun segmentinde belirlemenize yardımcı olur. </li><li> Bir kez odaklı, görüntü istenen terminali hücrelere hayvanlar döndürün. Bunu yapmak için, dikkatle forseps yavaşça lamel altında larvaları (Şekil 1E ve 1G) haddeleme, larvaların uzun eksenine dik olan kenarında lamel itin. </li><li> Uygun Terminal hücrelerin seçilmesi tutarlı sonuçlar için önemlidirve mutantlar arasında karşılaştırmalar. Vücut yağ dalı (FB) terminali hücreleri kolayca orta hatta lateral dorsal gövde, bitişik bulunmaktadır. Yanal Grup G terminali hücreleri (LG) kolayca bulunabilir ve ventral orta hat (Şekil 1 H) sadece yanal yer almaktadır. Not: En ön (Tr1) ve posterior (TR10) segmentlerinde terminali hücrenin düzenleme diğer kesimlerinden farklı. Biz sadece segmentleri Tr2-TR9 terminal hücreleri analiz. Sırt terminali hücreleri diğer trakea terminali hücreleri daha kalıplaşmış dallanma desen var. Bu ek, olmayan hücre özerk sinyalleri bağlı olabilir ve analiz dahil etmek karar verirken bu düşünülmelidir. </li><li> Ilgi bir terminal hücre tespit edildikten sonra, istenen büyütme kullanarak bir görüntü yakalamak, genellikle 10X veya 20X (Şekil 2A) en iyisidir. Not: Değişken dallanma desen nedeniyle, birçok şube ve mümkün olduğu kadar şube ipuçları içermektedir görüntü yakalamak için deneyin. </li><li> Sahne hareket ettirmeden, floresan kapatın ve aynı hücre ve odak düzlemi (Şekil 2B) bir aydınlık görüntü yakalamak için iletilen ışık açın. Lümen koyu terminal hücre alanı içinde zıt olarak görünür olacaktır. Terminal hücre şube ve lümen ölçmek planlıyor ise, her bir terminal hücrenin birden fazla odak düzlemleri birden fazla resim toplamak. </li></ol> 5. ImageJ kullanarak Terminal Hücre morfolojisi analizi ve miktar tayini <ol><li> ImageJ (kullanarak floresan ve aydınlık görüntüleri açın <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) NeuronJ plug-in ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> &quot;Ekle iz&quot; aracını kullanarak el ile tüm terminali hücrenin şube ve lümen iz. </li><li> &quot;Etiket iz&quot; aracını kullanarak, yeniden adlandırma ve riz belirli bir atama içinde her satırı atamak ecolor. </li><li> &quot;İlgili parametreler&quot; seçeneğini kullanarak, 6-10 piksel Çizgi genişliğini ayarlamak (bileşik mikroskop bağlı dijital kameradan elde edilen 512x512 görüntüler için. Yüksek veya daha düşük çözünürlüklü kameralar için, piksel genişliği uygun ölçeklenebilir olmalıdır), tüm kullanarak diğer varsayılan ayarları, ve &quot;Tamam&quot; seçin. Sonra bir görüntü çekmek için &quot;anlık olun&quot; aracını kullanın. Seçin, orijinal ile yan yana gösterilebilir iz bir anlık almak için &quot;iz çizin&quot;. </li><li> &quot;Ölçü iz&quot; aracını seçin ve izleme tipi (ölçmek için şube adım 5.3 &#39;de atanan belirli belirtme dayalı yani) seçin. Sonra, &quot;RUN&quot; tıklayın ardından &quot;izleme ölçümleri göster&quot; ve &quot;Clear önceki ölçümleri&quot;. Bu ad, etiket, uzunluğu (piksel) ve görüntü için diğer verileri içeren bir tablo üretecek. Bu veriler daha sonra daha ileri istatistiksel bir Microsoft Excel elektronik tablosu olarak kaydedilebiliranalizi. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi olduğunu beyan ederim.

Burada açıklanan ısı sabitleme tekniği görüntüleme Drosophila larva trakeal terminali hücreleri için hızlı ve kullanışlı bir araçtır. Burada, dallanma ve yabani tip hücrelerin lümen desen incelemek için bu tekniği kullanın. Nefes nefese trakeal özel organizatörü tarafından tahrik GFP, ifade Trakeal hücreleri ısı sabitleme sonra larva manikür ile kolayca görüntülenebilir. Hem de hava dolu lümeninin gibi tek tek terminal hücreler, belirli bir desen dallanma hızlı bir ...

Hücre şekil bir organizma içinde, tek tek hücrelerin fonksiyonu için kritik yanı sıra hücreler, bir doku ya da organın bir parçası olarak işlev gördüğü. Dallanma ve tüp oluşumu (lumenogenesis): Biz hücresel morfoloji iki korunmuş tür kontrol katılmak moleküler mekanizmalarının araştırılması Drosophila trakeal terminali hücreleri, böcek solunum sisteminin bir bileşeni kullanın. Terminal hücreleri dallı tüpler bir ağın ucunda yer aldığını iç doku 1 oksijen teslim ve hedef dokularda 2 içinde yerel oksijen seviyesi ile kontrol edilir bir FGF sinyal yolu bağlıdır ayrıntılı bir dallı morfolojisi için çalışır. Terminal hücre dalları her şube ile çalışan gaz ile dolu bir hücre içi lümen ile, ince tüpler vardır. Genetik analiz Drosophila yapılabilir hangi kolaylığı ile birlikte terminali hücrelerin farklı hücresel mimarileri, bu hücreler, mükemmel bir model F yapmakya da, hücresel akıbet mekanizmaları araştıran dallanma, ve hücre içi tüp oluşumu. Terminal hücreleri dallı hücre farklılaşması, akıbet ve olgunlaşma 2-4 giden sinyal yollarının bazıları anlamak için yararlı bir model kanıtlamıştır. Bu sistem tarafsız kullanarak, hücre morfolojilerinden mutantlar için ileri genetik ekranlar hücre şekli 5,6 kontrol mekanizmaları içine anlayışlar verimli, yapılmıştır. Integrin-aracılı yapışma şube istikrar 8 için gerekli olduğunu,, örneğin, bu ekranlar belirli bir RabGAP lümen oluşumu ve konumlandırma 7 iskelet kutup ve vezikül ticareti için gerekli olduğunu ortaya koymuştur ve bu epitel PAR-kutup proteinler gerekli polarize membran ticareti düzenleyen dallanma ve lümen oluşumu 9 her ikisi için de. Terminal hücrelerinde Diğer çalışmalar, asimetrik aktin birikimi ve mikrotübül organizasyonu hücre uzaması ve lumenogenesis için gerekli olduğunu göstermiştir <s&gt; 10 kadar. Böylece, farklı, korunmuş hücre biyolojik mekanizmaları terminali hücre morfolojilerinden katkıda bulunur. Burada, biz hızla terminali hücre dallanma ve lümen oluşumu analizi için sağlam üçüncü evre Drosophila larvaları düzeltmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, aynı zamanda birinci ve ikinci instar hayvanlar üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin anahtarı genetik doğrudan sağlam hayvanların larva manikür floresan proteini ifade tarafından etiketli terminali hücreleri görselleştirmek için yeteneğidir. Bu işlem bu antikor boyama gibi sonrası tespit manipülasyonlar,, hücreleri gözlemlemek için gerekli olmadığından, iyi genetik ya da ilaç tarama dahil olmak üzere, yüksek verimlilik analizi için uygundur. Floresan proteini ifade sitoplazma dolu dalların yapı ortaya koymaktadır. Tüp oluşumu paralel çevreleyen sıvı-dolgu ile tezat gazlı lümen, tanımlamak için aydınlık mikroskobu kullanarak izlenebilired dokular. Bu protokole dahil başka etiketlenmemiş hayvanlar floresan ile etiketlenmiş proteinleri homozigoz mutant terminali hücreleri üretmek için MARCM sistemi 11 esas genetik mozaik üretmek için bir yöntemdir. Terminal hücreler sadece nispeten geç gelişiminde onların kompleks yapıların ayrıntılı çünkü bu, gereklidir; genetik mozaikler önceki gelişiminde diğer dokularda gen gereksinimleri bypass için izin verir. . MARCM klon oluşturmak için, trakea burada tanımlanan nefes nefese trakeal-özel bir sürücü (btl) 12 kullanılarak etiketli Drosophila X kromozomu için protokoldür, diğer kromozomlar için, benzer bir prosedür olan kromozom uygun genetik reaktifler ile, kullanılabilir incelenmiştir. Burada, trakea bir sitoplazma lokalize GFP ifade etiketli, ancak prosedür gibi DsRed gibi diğer floresan proteinleri, ifade eşit derecede iyi çalışır. Ayrıca, nöronal şube modelleri 13 tanımlamak için geliştirilen yöntemlere dayalı, Terminal hücrelerde dallanma desen ve lümen oluşumu ölçmek için bir yöntem dahil ettik. Nicel verilerin bu tür seçici kesin dallanma veya lumenogenesis sürecinde genlerin rolü, hem de farklı mutantlar 9 arasında doğrudan karşılaştırmalar için izin kritik olabilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

Hücre şekli hücre fonksiyonu için önemlidir. Ancak, hücre morfolojisi önemi rağmen, biraz tek tek hücrelerin belirli şekiller oluşturmak konusunda bilinmektedir. Drosophila trakea terminali hücreleri hücresel morfoloji üretmek için gerekli genlerin rolleri belirlemek ve aydınlatmak için güçlü bir genetik model haline gelmiştir. Terminal hücreleri, kollara ayrılmış boru şebekesinin bir parçası, iç dokulara oksijen sağlamak için işlevler, trakeal sistemi vardır. Terminal hücreler iki ayrı cep mimarileri sahip olarak hücre şekli soruları araştırmak için mükemmel bir model vardır. İlk olarak, Terminal hücreleri karmaşık nöron benzer ayrıntılı bir dallı morfolojisi, var, ikinci terminal hücre dalları ince tüpler olarak oluşan ve bir membrana bağlı hücre içi lümen içerirler. Terminal hücre şube sayısı, şube kuruluş ve bireysel şube şekli, kantitatif analiz belirli genetik mekanizma rolü hakkında bilgi vermek için kullanılabilirDallı bir hücrenin yapımında anisms. Bu hücrelerde tüp oluşumu analizi gibi omurgalı damar gibi diğer boru ağlara ortak tubulogenesis bir korunmuş mekanizmaları, ortaya çıkarabilir. Burada hızlı bir şekilde, görüntü düzeltmek için kullanılabilecek teknikler tarif ve Drosophila larvaları içinde hem dallanma desen ve terminal hücrelerde tüp oluşumu analiz. Bu teknikler, yabani tip ve mutant hayvanlar ya da genetik mozaik terminal hücreleri analiz etmek için kullanılabilir. Bu nedenle protokolün yüksek verimlilik, aynı zamanda iyi genetik, RNAi tabanlı veya Drosophila trakeal sisteminde ilaç ekranlar için uygundur.

Sonuçlar Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Ve şube her geçen gaz ile dolu bir hücre içi lümen (aydınlık mikroskobu ile görüntülendi, B); Tek bir yan grubu (LG) Terminal hücre geniş hücre içi dallanma (A GFP ile görünür) gösterir. Bu görüntüler, bölüm 1 ve 2&#39;de tarif edilen MARCM sistemi kullanılarak oluşturulan bir mozaik L3 larva toplandı ve ısı sabit ve görüntülü olarak bölüm 3 ve 4 &#39;te tarif edilmiştir. Paneller C &amp; D A &amp; B Paneller gösterilen gör...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy at JoVE.com

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Burada, trakea terminali hücrelerinin ışık mikroskobu analizinde için bir yöntem mevcut<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva. Bu yöntem, bütün hayvanlarda şube ve lümen morfolojisi hızlı incelenmesi için izin verir ve bireysel mutantlar veya terminal hücre gelişimi etkileyen mutasyonlar için ekranlar analizi için yararlı olacaktır.

İncelenmesi<em&gt; Drosophila</emIşık Mikroskopi tarafından&gt; Larva Trakeal Terminal Hücreleri

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K Görüntüleme.  University of Utah. Burada, trakea terminali hücrelerinin ışık mikroskobu analizinde için bir yöntem mevcut Drosophila Larva. Bu yöntem, bütün hayvanlarda şube ve lümen morfolojisi hızlı incelenmesi için izin verir ve bireysel mutantlar veya terminal hücre gelişimi etkileyen mutasyonlar için ekranlar analizi için yararlı olacaktır.

Video: Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

Işık Mikroskop ile İncelenen Presynaptically Sessiz Sinapslar

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...