Agradecemos Gillian Stanfield para comentários sobre o manuscrito. TAJ é apoiado pela Universidade de Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 do NIH NIGMS.

1. Geração de Mosaico <ol><li> Cruzamento genético w FRT 19A banheira: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (do sexo masculino) X * FRT 19A / Bal (fêmeas), onde * representa o mutante para ser examinado. Nota: Configurar atravessar pelo menos um dia antes da experiência, pois isso permite que os animais se acasalar adequadamente. </li><li> Pré-lay: Cruz transferência para frascos voar alimentares com uma pequena mancha de pasta de fermento fresco colocado na mídia. Permitir fixar durante 1 hora a 25 ° C. </li><li> Lay: animais de Transferência de pré-configuração frasco para um novo frasco com uma pequena mancha de pasta de fermento fresco. Permitir a deitar por 6 h a 25 ° C. </li><li> Adultos de transferência de volta ao frasco pré-configuração para armazenamento e uso em experimentos posteriores. Imediatamente choque de calor do frasco contendo leigo 0-6 hr embriões velhos durante 45 min a 38 ° C, num banho de água circulante. Nota: A superfície do alimento deve estar abaixo do nível de água para verificar todosembriões são adequadamente aquecer chocado. </li><li> Incubar calor frascos chocou a 25 ° C por 4-5 dias até larvas de terceiro instar começar a vagar. </li></ol> 2. Tela para Mosaico Animais <ol><li> Usando fórceps finos escolher cuidadosamente errante larvas de terceiro instar a partir dos lados do frasco e colocá-los em refrigeradas glicerol 100% numa pequena placa de plástico. </li><li> Examinar larvas usando um microscópio de alta ampliação de dissecação equipado com óptica fluorescentes. Identificar larvas com expressão mosaico de células de traquéia fluorescente etiquetado. Tipicamente, isto pode ser feito em 10-20X de ampliação. </li></ol> 3. Fixação de calor <ol><li> Utilizando uma pinça fina escolher cuidadosamente os animais mosaico fora do prato e coloque em uma gota de fresco 100% de glicerol em um mm branco vidro lâmina de microscópio 75x25x1. Nota: vários animais podem ser colocados na gota (Figura 1A). Os animais também podem ser colocados numa gota de glicerol sobre uma lamela directamente,mas cuidado deve ser tomado durante a fixação (passo 3.2), já que os animais vão aquecer muito rapidamente e pode tornar-se mais fixo. </li><li> Lugar lâmina de vidro para 70 ° C em bloco de calor até que os animais só parar de se mover, não mais do que 20 segundos para um slide, e 10 seg para uma lamela (Figura 1B). Animais vão torcer inicialmente, mas parar e tornar-se rígida e alongada, uma vez morto. Nota: A exposição prolongada ao calor pode danificar ramos terminais e lúmens, bem como fazer o sinal GFP fraca e difusa. Para a máxima eficiência recomenda-se que o bloco de calor no mesmo quarto que os microscópios. </li><li> Usando fórceps finos orientar cuidadosamente todas as larvas na gota num único sentido, de tal modo que todas as larvas do slide são orientados paralelamente uns aos outros (Figura 1C). </li><li> Suavemente colocar uma tampa de vidro de micro 18x18mm no topo das larvas (ou a lamela invertido sobre uma lâmina de vidro) e evitar a formação de bolhas (Figura 1D). Nota: lamela pode não estar exatamenteplana sobre larvas, isto não é um problema. </li><li> Larvas de Imagem dentro de 30 min. Células terminais fixas de calor irá degradar o sinal de GFP e irá tornar-se muito difusa. </li></ol> 4. Imagem in vivo de células terminais traqueais <ol><li> Coloque deslize no palco de um microscópio estereoscópico composto. Usando um objetivo 5X localizar os dois troncos dorsal paralelas que correm de anterior para posterior na superfície dorsal do animal (Figura 1F). Localize as duas células terminais dorsal, diretamente entre os dois troncos dorsal. Isso ajuda a identificar o segmento apropriado para análise. </li><li> Uma vez orientada, rodar os animais para as células da imagem de terminais desejados. Para fazer isso, empurrar cuidadosamente a lamela na extremidade com a pinça perpendicular ao eixo longo das larvas, rolando lentamente as larvas sob a lamela (Figuras 1E e 1G). </li><li> Selecionando as células terminais apropriados é fundamental para resultados consistentese as comparações entre os mutantes. Células terminais do ramo de gordura corporal (FB) são facilmente encontrados junto ao tronco dorsal, lateral à linha média. As células do Grupo G terminais laterais (LG) são facilmente encontradas e estão localizadas imediatamente lateral da linha média ventral (Figura 1H). Nota: nos (TR10) segmentos mais anteriores (Tr1) e posterior o arranjo de célula terminal é divergente de outros segmentos. Nós só analisar as células terminais em segmentos Tr2-TR9. Células terminais dorsais têm um padrão de ramificação mais estereotipados do que outras células do terminal da traquéia. Isto pode depender de sinais autónomas adicionais, não-celulares, e isso deve ser considerado quando se decide se a incluí-los na análise. </li><li> Uma vez que uma célula de terminal de interesse tiver sido identificado, a captura de uma imagem utilizando a ampliação desejada; tipicamente 10X ou 20X é melhor (Figura 2A). Nota: devido a padrões de ramificação variáveis, tentar capturar imagens que incluem como muitos ramos e dicas ramo como possível. </li><li> Sem mover o palco, desligue a fluorescência e acender a luz transmitida para capturar uma imagem de campo claro da mesma célula e plano focal (Figura 2B). O lúmen será visualizado como escura contrastante dentro do espaço celular terminal. Se planejando quantificar ramos terminais celulares e lúmens, recolher várias imagens em múltiplos planos focais de cada célula terminal. </li></ol> 5. Análise e Quantificação da morfologia celular Terminal Usando ImageJ <ol><li> Abra as imagens fluorescentes e brightfield usando o ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Usando o &quot;Add traçados&quot; ferramenta, traçar manualmente os ramos e lúmen da célula do terminal inteiro. </li><li> Usando a ferramenta &quot;Etiqueta traçados&quot;, renomear e reColor atribuir a cada linha dentro do trace uma designação específica. </li><li> Usando a ferramenta &quot;Definir parâmetros&quot;, ajustar a largura da linha 6-10 pixels (512x512 para imagens obtidas a partir da câmera digital conectada ao microscópio composto. Para câmaras maior ou menor resolução, a largura de pixel deve ser dimensionado de forma adequada), utilizando todos outras configurações padrão e clique em &quot;OK&quot;. Em seguida, use a ferramenta &quot;Faça snapshot&quot; para tirar uma foto. Escolha &quot;Draw trace&quot; para obter um instantâneo do traço que pode ser mostrado, lado a lado com o original. </li><li> Selecione a ferramenta &quot;Measure traçados&quot; e selecione o tipo de rastreamento (ou seja, que se ramifica para medir com base nas designações específicas atribuídas no passo 5.3). Em seguida, selecione &quot;Mostrar medições de rastreamento&quot; e &quot;Limpar medições anteriores&quot; e clique em &quot;Executar&quot;. Isto produzirá uma folha de cálculo que contém o nome, a etiqueta, o comprimento (em pixels), e outros dados para a imagem. Estes dados podem ser salvos como uma planilha do Microsoft Excel para posterior estatísticaanálise. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

Os autores declaram que não têm concorrentes interesse financeiro.

A técnica de fixação calor aqui descrito é uma ferramenta rápida e conveniente para as células terminais traqueais imagem Drosophila larvas. Aqui, podemos utilizar esta técnica para examinar o padrão de ramificação e do lúmen de células do tipo selvagem. Células de traquéia expressando GFP, impulsionada pelo promotor específico traqueal fôlego, pode ser facilmente visualizado através da cutícula larval após a fixação de calor. Os padrões de ramificação específicos de células i...

Forma celular é crítico para a função das células individuais dentro de um organismo, bem como células que funcionam como parte de um tecido ou órgão. Nós usamos células terminais de Drosophila traqueais, um componente do sistema respiratório de insetos, para investigar os mecanismos moleculares que participam no controle de dois tipos conservados de morfologia celular: Desvios e formação do tubo (lumenogenesis). Células terminais estão localizadas nas pontas de uma rede de tubos ramificados que funciona para fornecer oxigénio aos tecidos internos 1 e têm uma morfologia ramificado elaborado, que depende de uma via de sinalização do FGF, que é controlado por níveis de oxigénio dentro dos tecidos locais-alvo 2. Ramos terminais celulares são tubos finos, com cheias de gás lúmen subcelulares que atravessam cada ramo. As arquitecturas celulares distintas de células de terminal, juntamente com a facilidade através da qual a análise genética pode ser realizada em Drosophila, tornar essas células um modelo excelente fou investigar os mecanismos de crescimento celular, a ramificação, e a formação do tubo intracelular. Células Terminal provaram um modelo útil para compreender algumas das vias de sinalização que levam à diferenciação de células ramificadas, conseqüência, e maturação 2-4. Usando este sistema imparcial, telas para a frente genéticos para mutantes morfogênese celular foram realizados, gerando insights sobre os mecanismos que controlam a forma da célula 5,6. Por exemplo, estas telas tenham revelado que um RabGAP específico é necessário para a polaridade do citoesqueleto e o tráfico de vesículas na formação de lúmen e de posicionamento 7, que a adesão mediada pela integrina é necessária para a estabilidade do ramo 8, e que as proteínas de PAR-polaridade epiteliais regular tráfico membrana polarizado necessário tanto para a ramificação e formação de lúmen 9. Outros estudos em células de terminais têm mostrado que a acumulação de actina assimétrica e organização de microtúbulos é necessária para o alongamento das células e lumenogenesis <saté&gt; 10. Assim, diversos mecanismos biológicos, células conservadas contribuir para a morfogénese do terminal da célula. Aqui, descrevemos um método para corrigir rapidamente as larvas Drosophila terceiro instar intacto para análise de células ramificação terminal e formação de lúmen. Este protocolo pode também ser efectuada em ambos os primeiro e segundo instar animais. A chave para esta técnica é a capacidade de visualizar as células terminais que estão geneticamente marcadas através da expressão da proteína fluorescente directamente através da cutícula larval de animais intactos. Uma vez que este procedimento não requer quaisquer manipulações pós-fixação, tais como a coloração do anticorpo, para observar as células, que é bem adequado à análise de alto rendimento, incluindo o rastreio genético ou fármaco. A expressão da proteína fluorescente que revela a estrutura dos ramos cheias de citoplasma. Formação do tubo pode ser controlado em paralelo utilizando microscopia de campo claro para identificar o lúmen cheio de gás, o que contrasta com o ambiente fluido enchatecidos ed. Incluído neste protocolo é o método para a geração de mosaicos genéticos baseados no sistema MARCM 11, para produzir as células terminais mutantes homozigotos marcadas com proteínas fluorescentes em animais unlabeled contrário. Isto é necessário, uma vez que as células terminais só elaborar suas estruturas complexas relativamente tarde no desenvolvimento; mosaicos genéticos permitem a derivação de requisitos de genes em outros tecidos anteriores em desenvolvimento. . Gerar clones MARCM, traquéia são rotulados usando o driver específico-traqueal sem fôlego (BTL) 12 aqui descrito é o protocolo para o cromossomo X Drosophila, por outros cromossomos, um procedimento semelhante pode ser usado, com reagentes genético apropriado para o cromossoma ser examinados. Aqui, a traqueia são rotulados por expressão de uma GFP citoplasmaticamente localizada, mas o procedimento funciona igualmente bem com a expressão de outras proteínas fluorescentes, tais como DsRed. Além disso, nós incluímos um método para quantificar os padrões de ramificação e formação de lúmen em células de terminais, com base em métodos desenvolvidos para a caracterização de padrões de ramificação neuronal 13. Este tipo de dados quantitativos pode ser crítico para discernir o papel exacto de genes no processo de ramificação ou lumenogenesis, bem como permitindo comparações directas entre diferentes mutantes 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

Forma celular é crítico para a função celular. No entanto, apesar da importância da morfologia celular, pouco é conhecido sobre as células individuais como gerar formas específicas. Células terminais traqueais Drosophila tornaram-se um modelo genético poderosa para identificar e elucidar os papéis dos genes necessários para a geração de morfologias celulares. Células de terminais são um componente de uma rede tubular ramificada, o sistema traqueal que funciona de modo a fornecer oxigénio aos tecidos internos. Células de terminais são um excelente modelo para investigar questões de forma da célula que possuam duas arquitecturas celulares distintas. Primeiro, as células terminais têm uma morfologia ramificado elaborado, semelhante aos neurónios complexos, em segundo lugar, os ramos celulares terminais são formadas como tubos finos e contêm um lúmen ligada à membrana intracelular. A análise quantitativa do número de células ramo terminal, organização ramo e forma ramo individual, pode ser usado para fornecer informações sobre o papel do mecanismo genético específicomos na confecção de uma célula ramificada. Análise de formação de tubos nestas células pode revelar os mecanismos conservadas do tubulogenesis comuns a outras redes tubulares, tais como a vasculatura vertebrado. Aqui, descrevem técnicas que podem ser usadas para corrigir rapidamente, imagem e analisar os padrões de ramificação e em células de formação de tubo de terminal dentro larvas de Drosophila. Estas técnicas podem ser utilizadas para analisar as células terminais em animais de tipo selvagem e mutante, ou mosaicos genéticos. Devido à elevada eficiência deste protocolo, é também adequada para genético, baseado RNAi, ou telas da droga no sistema de Drosophila traqueal.

Os resultados são mostrados na Figura 2. Um grupo lateral, único (LG) célula do terminal mostra extensa ramificação subcelular (visualizado por GFP; A) e um cheios de gás lúmen subcelulares que atravessa cada um dos ramos (visualizadas por microscopia de campo claro, B). Estas imagens foram coletadas a partir de um mosaico L3 larva, gerado através do sistema MARCM descritos nas seções 1 e 2, eo calor fixa e fotografada, conforme descrito nas seções 3 e 4. Painéis C e D mostram um traço Neu...

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Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Aqui, apresentamos um método para análise de microscopia de luz das células terminais traqueal em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas. Este método permite uma análise rápida do ramo lumen e morfologia em animais inteiros e seria útil para a análise dos mutantes individuais ou ecrãs de mutações que afectam o desenvolvimento das células do terminal.

Exame<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval células terminais traqueais por microscopia de luz

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.3K visualizações.  University of Utah. Aqui, apresentamos um método para análise de microscopia de luz das células terminais traqueal em Drosophila Larvas. Este método permite uma análise rápida do ramo lumen e morfologia em animais inteiros e seria útil para a análise dos mutantes individuais ou ecrãs de mutações que afectam o desenvolvimento das células do terminal.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larval Dissection MNJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

Sinapses pré-sináptico Silencioso Estudou com Microscopia de Luz

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissecção e coloração de Drosophila Larval Ovários

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

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