우리는 원고에 대하여 코멘트를위한 질리안 스탠 필드 감사합니다. TAJ는 NIH의 NIGMS에서 유타 유전학 교육 그랜트 T32-GM007464의 대학에 의해 지원됩니다.

1. 모자이크 생성 <ol><li> 유전 크로스 W FRT 19A 욕조 : GAL80 FLP 122 / Y, BTL-GAL4, UAS - GFP (남성) X *는 검사 할 돌연변이를 나타냅니다 * FRT 19A / 발 (여성). 참고 :이 동물들이 적절하게 짝짓기를 할 수로, 사전 실험 적어도 하루를 건너 설정합니다. </li><li> 사전 평신도 : 전송 크로스 미디어에 배치 신선한 효모 붙여 넣기의 작은 얼룩을 가진 비행 식품 유리 병에. 25 ℃에서 1 시간 동안 누워 허용 </li><li> 레이아웃 : 사전 누워 병에서 전송 동물을 신선한 효모 붙여 넣기의 작은 얼룩과 신선한 유리 병. 25 ℃에서 6 시간 동안 누워 허용 </li><li> 이전 성인은 다시 저장 및 다음 실험에 사용하기 위해 병을 사전에 배치합니다. 즉시 열 충격 순환 물 목욕 38 ° C에서 45 분, 대한​​ 0-6 시간 이전 배아를 포함하는 평신도 병. 참고 : 음식의 표면은 모두를 확인하기 위해 물 수준 이하이어야한다배아는 적절한 충격을 열 수 있습니다. </li><li> 세 번째 instar의 유충이 방황하기 시작 때까지 4 ~ 5 일 25 ° C에서 열 충격 튜브를 품어. </li></ol> 2. 모자이크 동물을위한 화면 <ol><li> 미세 집게를 사용하여 부드럽게 병의 측면에서 방황하는 세 번째 instar의 유충을 선택하고 작은 플라스틱 접시에 냉장 100 % 글리세롤에 배치합니다. </li><li> 형광 광학 탑재 한 고배율 해부 현미경을 사용하여 유충을 검사합니다. 찬란 분류 기관 세포의 모자이크 식으로 애벌레를 식별합니다. 일반적으로이 10-20X 배율에서 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 열 고정 <ol><li> 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 75x25x1 mm 흰색 유리 현미경 슬라이드에 신선한 100 % 글리세롤의 드롭 접시와 장소의 모자이크 동물을 선택하십시오. 참고 : 여러 동물 드롭 (그림 1A)에 배치 할 수 있습니다. 동물은 또한 직접 coverslip을에 글​​리세롤의 드롭 배치 할 수 있습니다동물이 매우 빠르게 열 것 이상 고정 될 수 있지만,주의, 고정 (단계 3.2) 동안주의해야합니다. </li><li> 동물까지 70 ° C 열 블록 위에 장소 유리 슬라이드은 커버 슬립 (그림 1B)에 대한 슬라이드, 10 초, 더 이상 20 초를 이동하지 중지합니다. 동물은 처음 몸부림되지만 중지하고 엄밀한 길게 한 번 죽은됩니다. 주 : 열까지 너무 긴 노출뿐만 아니라 GFP 신호가 희미하고 산만하게 같은 터미널 지점과 루멘 손상 될 수 있습니다. 최적의 효율성을 위해 그것을 현미경 같은 방에 열 블록을 가지고하는 것이 좋습니다. </li><li> 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 방향을 슬라이드에있는 모든 애벌레는 다른 (그림 1C)에 평행되는 등 한 방향에있는 드롭의 모든 애벌레. </li><li> 부드럽게 애벌레의 상단 (또는 유리 슬라이드에 coverslip을 반전)에 18x18mm 마이크로 커버 유리를 배치하고 형성하는 거품을 (그림 1D)하지 마십시오. 참고 : coverslip을 정확하게 거짓말을하지 않을 수 있습니다유충에 평면이 문제가되지 않습니다. </li><li> 30 분 안에 이미지 유충. 열 고정 터미널 세포가 저하되고 GFP 신호가 매우 확산 될 것입니다. </li></ol> 4. 기관 내 터미널 세포의 생체 내 이미징 <ol><li> 복합 입체 현미경의 무대에 슬라이드를 놓습니다. 배 목적은 동물의 등쪽 표면 (그림 1 층)에서 후부 앞쪽에에서 실행되는 두 개의 병렬 지느러미 줄기를 찾아 사용. 직접 두 개의 지느러미 줄기 사이에 두 개의 지느러미 터미널 세포를 찾습니다. 이 분석을위한 적절한 세그먼트를 식별하는 데 도움이됩니다. </li><li> 일단 지향, 이미지 원하는 단말기 세포에 동물을 돌립니다. 이 작업을 수행하려면 신중 집게 천천히 coverslip에 아래의 유충 (그림 1E 및 1G) 압연, 유충의 긴 축에 수직으로 가장자리에 coverslip을 밀어 넣습니다. </li><li> 해당 단말기 셀을 선택하면 일관성있는 결과를 위해 중요합니다과 돌연변이 사이의 비교. 체지방 지점 (FB) 단자 세포는 쉽게 정중선 외측 등쪽 트렁크에 인접 발견된다. 측면 그룹 G 단자 세포 (LG)를 쉽게 찾을 수 있습니다 및 복부 정중선 (그림 1H)의 바로 옆에 위치하고 있습니다. 참고 : 대부분의 전방 (TR1)과 후방 (TR10) 세그먼트의 단자 세포의 배열이 다른 세그먼트에서 분기됩니다. 우리는 세그먼트 TR2-TR9에서 터미널 세포를 분석합니다. 등의 단말기 세포는 다른 기관 단자 세포보다 더 많은 박힌 분기 패턴이 있습니다. 이 추가 비 셀 자율적 인 신호에 따라 달라질 수 있습니다, 분석에 포함할지 여부를 결정할 때 고려되어야한다. </li><li> 관심 단자 세포가 확인되면 원하는 배율을 사용하여 이미지를 캡처, 일반적으로 10 배 또는 20 배 (그림 2A) 최고입니다. 참고 : 변수 분기 패턴으로 인해, 많은 지점과 가능한 한 가지 팁을 포함 이미지를 캡처하려고. </li><li> 스테이지를 이동하지 않고, 형광을 끄고 동일한 셀 및 초점면 (그림 2B)의 시야 이미지를 캡처하는 투과광의 전원을 켭니다. 루멘은 멍하니 단자 세포 공간에 대조로 보여 질 것입니다. 단말기 세포의 가지와 루멘의 양을 계획하는 경우, 각 터미널 셀의 다중 초점면에 여러 이미지를 수집합니다. </li></ol> 5. ImageJ에 사용 터미널 세포 형태의 분석 및 정량화 <ol><li> ImageJ에 (사용하는 형광 및 명 시야 이미지를 열고 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) NeuronJ 플러그인 ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/을</a> ). </li><li> &quot;추가 트레이싱&quot;도구를 사용하여 수동으로 전체 단말기 세포의 가지와 루멘을 추적. </li><li> &quot;라벨 경시&quot;도구를 사용하여, 이름 바꾸기 및 R추적 특정 지정 내의 각 행을 할당 할 ecolor. </li><li> &quot;파라미터 설정&quot;도구를 사용하여 6-10 픽셀의 선 폭을 조정 (복합 현미경에 연결된 디지털 카메라에서 얻은 512x512 크기 이미지. 높거나 낮은 해상도의 카메라를 들어, 픽셀 너비가 적절히 조정되어야한다), 모두를 사용하여 다른 기본 설정 및 &quot;OK&quot;를 선택합니다. 다음 이미지를 촬영하기 위해 &quot;스냅 샷 만들기&quot;도구를 사용하십시오. 선택한 원본에 나란히 표시 할 수 있습니다 추​​적의 스냅 샷을 얻기 위해 &quot;추적을 그립니다.&quot; </li><li> &quot;측정 표목&quot;도구를 선택하고 추적 유형 (측정 지점 단계 5.3에서 할당 된 특정 지정에 따라 예)를 선택합니다. 다음, &quot;실행&quot;을 클릭하여 &quot;추적 측정을 표시&quot;하고 &quot;지우기 이전 측정&quot;. 이 이름, 레이블, 길이 (픽셀), 이미지에 대한 다른 데이터를 포함하는 스프레드 시트를 생성합니다. 이 데이터는 또한 통계에 대한 Microsoft Excel 스프레드 시트로 저장할 수 있습니다분석. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 관심이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명 된 열 고정 기술은 이미징 Drosophila의 애벌레 기관 단자 세포에 대한 신속하고 편리한 도구입니다. 여기, 우리는 분기와 야생형 세포의 내강 패턴을 조사하기 위해이 기술을 사용합니다. 숨 기관 특이 적 프로모터에 의해 구동 GFP를, 표현 기관 세포는 열 고정 후 유충의 표피를 통해 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 뿐만 아니라 공기 채워진 루멘의 그 같은 개별 단말기 세포?...

세포의 모양은 유기체 내의 개별 세포의 기능에 중요한뿐만 아니라, 세포 인 조직이나 기관의 일부로서 그 기능. 분기 및 튜브 형성 (lumenogenesis) : 우리는 세포 형태의 두 가지 보존 유형을 제어에 참여하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 초파리 기관 단자 세포, 곤충 호흡기 시스템의 구성 요소를 사용합니다. 터미널 세포는 분기 튜브 네트워크의 끝 위치되는 내부 조직 1에 산소를 전달하고 표적 조직 2에서 현지 산소 농도에 의해 제어되는 FGF 신호 전달 경로에 따라 정교한 지형 형태를 가지고하는 기능.에게 터미널 셀 분기 각 지점을 통해 실행 가스로 채워진 세포 내 루멘으로, 얇은 튜브입니다. 유전자 분석은 초파리에서 수행 할 수있는 용이성과 함께 단말기 세포의 독특한 세포 구조는,이 세포에게 훌륭한 모델 F을또는, 휴대 가지의 메커니즘을 조사 분기 및 세포 내 튜브를 형성합니다. 터미널 세포는 분기 세포 분화, 가지,과 성숙 2-4로 이어지는 신호 전달 경로의 일부를 이해하기위한 유용한 모델을 입증했다. 이 시스템은 공정한 사용하여, 세포 형태 형성의 돌연변이에 대한 앞으로 유전자 스크린은 세포의 모양 5,6를 제어 메커니즘에 대한 통찰력을 항복 수행되었다. 인테 매개 접착력을 가지 안정성 8을 위해 필요합니다; 예를 들어,이 화면은 특정 RabGAP가 루멘 형성과 포지셔닝 7 골격 극성 소포 인신 매매를 위해 필요하다는 것을 밝혀 그 상피 PAR 극성 단백질은 필요한 편광 막 인신 매매를 규제 분기 및 루멘 형성 9 모두. 단말기 세포에서 다른 연구는 비대칭 말라 축적과 미세 소관 조직 세포의 신장과 lumenogenesis 필요한 것으로 나타났습니다 <s&gt; 10 최대. 따라서, 다양한, 보존 세포 생물 학적 메커니즘 터미널 세포 형태 형성에 기여한다. 여기, 우리는 신속하게 터미널 휴대 분기 및 루멘 형성의 분석을위한 본래 제 령 초파리의 애벌레를 해결하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 첫 번째와 두 번째 모두 탈피 동물에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 핵심 유전자 직접 그대로 동​​물의 애벌레 표피를 통해 형광 단백질 식으로 표시되어 단자 세포를 시각화 할 수있는 기능입니다. 이 절차와 같은 항체 염색으로 사후 고정 조작은, 세포를 관찰 할 필요가 없기 때문에, 그것은 잘 유전자 또는 약물 검사를 포함하여, 높은 처리량 분석에 적합합니다. 형광 단백질의 발현은 cytoplasmically 채워진 가지의 구조를 보여준다. 관 형성은 병렬 주변의 유체은 - 채우기와 대조 가스 채워진 루멘을 식별하는 브라이트 현미경을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다ED 조직. 이 프로토콜에 포함 달리 레이블이 동물에 형광 단백질로 표시된 동형 접합체 돌연변이 단자 세포를 생산하는 MARCM 시스템 11에 따라 유전 모자이크를 생성하는 방법입니다. 단말기 세포는 비교적 늦게 개발에서의 복잡한 구조를 정교 때문에 이것은 필요하다, 유전 모자이크 이전에 개발에 다른 조직의 유전자 요구 사항을 우회 할 수 있습니다. . MARCM 클론을 생성하는 기관이 여기에 설명 숨 기관 - 특정 드라이버 (BTL) 12를 사용하여 표시하는 것은 초파리의 X 염색체를위한 프로토콜이며, 다른 염색체에 대해 유사한 절차가되는 염색체에 적합한 유전자 시약과 함께 사용할 수 있습니다 하였다. 여기에, 기관은 cytoplasmically 지역화 된 GFP의 발현에 의해 표시되지만, 절차는는 DsRed 다른 형광 단백질의 발현과 동일하게 작동합니다. 또한, 우리는 신경 가지 패턴 13 특성화 개발 방법에 따라 단말기 세포에서 분기 패턴과 루멘 형성을 정량화하는 방법을 포함했다. 정량적 데이터의이 종류는 안목 정확한 분기 또는 lumenogenesis 과정에서 유전자의 역할뿐만 아니라, 다른 돌연변이 9 사이의 직접 비교를 허용에 중요 할 수 있습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

세포의 모양은 세포 기능에 중요합니다. 그러나 세포 형태의 중요성에도 불구하고, 약간은 개별 세포가 특정 모양을 생성하는 방법에 대해 잘 알려져 있습니다. 초파리 기관 단자 세포는 세포의 형태학 생성에 필요한 유전자의 역할을 확인하고 해명 할 수있는 강력한 유전 적 모델이되고있다. 터미널 세포 분지 관 네트워크의 구성 요소, 내부 조직에 산소를 공급하는 기능하는 기관 시스템입니다. 터미널 세포들은이 두 가지 세포 구조를 가지고 같은 세포 형태의 질문 조사를위한 훌륭한 모델입니다. 첫째, 단말기 세포는 복잡한 신경 세포와 유사한 정교한 지형 형태를 가지고, 둘째, 단말기 세포의 가지 얇은 튜브로 형성 막 결합 세포 내강을 포함하고 있습니다. 터미널 셀 지점 번호, 지점 조직과 개인의 지사 형태의 정량 분석​​은 특정 유전자 기계화의 역할에 대한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다분기 셀의 제작에 anisms. 이러한 세포의 관 형성 분석은 척추 동물의 혈관과 같은 다른 관 네트워크에 공통 tubulogenesis의 보존 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 여기에서 우리는 빠르게 이미지를 수정하는 데 사용할 수있는 기술을 설명하고, 초파리 유충에서 모두 분기 패턴과 단말기 세포의 관 형성을 분석합니다. 이 기술은 야생형과 돌연변이 동물, 또는 유전 모자이크의 터미널 세포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 때문에 프로토콜의 높은 효율, 그것은 또한뿐만 유전, RNAi의 기반 또는 초파리 기관 시스템의 마약 화면에 적합합니다.

결과는 그림 2에 표시됩니다. 그리고 각 분기를 통해 실행 가스로 채워진 세포 내 루멘 (브라이트 현미경으로 시각, B) 하나의 측면 그룹 (LG) 단자 셀은 광범위한 세포 내 분기를 (GFP로 시각화)를 보여줍니다. 이러한 이미지는 섹션 1과 2에 설명 된 MARCM 시스템을 사용하여 생성, 모자이크 L3 유충에서 수집, 열은 고정 군데과 같은 섹션 3 및 4에 설명 하였다. 패널 C &amp; D는 A &amp; B. 패널에 ...

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Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

여기, 우리는 기관 단자 세포의 광학 현미경 분석에 대한 방법을 제시<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레. 이 방법은 전체 동물의 지사와 루멘 형태의 빠른 검사를 위해 허용하고 개별 돌연변이 또는 터미널 세포 발달에 영향을 미치는 돌연변이 화면의 분석에 유용 할 것입니다.

의 검사<em&gt; 초파리</em가벼운 현미경으로&gt; 애벌레 기관 내 터미널 셀

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K 조회수.  University of Utah. 여기, 우리는 기관 단자 세포의 광학 현미경 분석에 대한 방법을 제시 초파리 애벌레. 이 방법은 전체 동물의 지사와 루멘 형태의 빠른 검사를 위해 허용하고 개별 돌연변이 또는 터미널 세포 발달에 영향을 미치는 돌연변이 화면의 분석에 유용 할 것입니다.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

연구

생물학

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

라이트 현미경과 연구 Presynaptically 사일런트 시냅스

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

의 준비 Drosophila</em라이트 현미경을 위해> S2 세포

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

에서 애벌레 활동의 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 활동 모니터

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...