Ce protocole décrit la meilleure façon de fonctionnaliser les cantilevers AFM à l’aide de cellules T simples et de particules solides. Ces conseils peuvent ensuite être utilisés pour sonder les interactions de cellules dendritiques à couple unique et pour surveiller les réponses cellulaires de taille volage, respectivement. Un avantage principal de cette technique est qu’elle utilise une colle biocompatible pour la fonctionnalisation à cellule T unique des cantilevers.
Cette colle est inerte pour les cellules eucaryotes, gardant ainsi les cellules T dans leur stade d’activation de base. Ces méthodes fournissent un aperçu de l’activation des cellules immunitaires et des événements intercellulaires complexes, tels que la formation de synapse immunitaire. Les méthodes peuvent également être étendues à d’autres systèmes impliquant des interactions cellule-cellule ou cellule-surface.
Pour quelqu’un qui est nouveau à cette technique, il est important de s’assurer que les cellules T sont en bon état avant l’utilisation et qu’ils sont prétraités avec IL-2 pendant la nuit. En outre, lors de l’utilisation de la colle biocompatible, déplacez-vous rapidement pour la protéger contre l’oxydation inutile. Pour commencer cette procédure, préparez les cellules T individuelles à la microscopie en suivant le protocole texte.
Ensuite, préparez des couvertures de verre ensemencées avec des cellules DC2.4, et incubez les cellules pendant la nuit dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius et 5% de CO2. Nettoyez les cantilevers mous et sans pointe avec une faible constante printanière à l’aide d’un traitement piranha, d’un nettoyage plasmatique ou d’un nettoyage à l’ozone UV. Montez ensuite le porte-à-faux nettoyé jusqu’à la tête de balayage de l’AFM.
Ensuite, préparez une chambre d’échantillon propre et remplissez-la d’eau pure. Calibrer le porte-à-faux dans la solution d’eau en exécutant d’abord une courbe de force sur le substrat de verre pour obtenir la sensibilité du porte-à-faux. Ensuite, enregistrez un spectre de bruit thermique pour extraire la constante printanière.
Lorsque le porte-à-faux est correctement calibré, retirez la tête de balayage AFM de la solution. Lavez le porte-à-faux monté avec quelques gouttes d’éthanol pur et gardez le porte-à-faux au sec sur la tête de balayage. Préchauffer un enclos de milieu cellulaire vivant à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.
Ensuite, montez le coverslip en verre ensemencé avec des cellules DC2.4 à l’assemblage de chambre d’échantillon, et ajoutez immédiatement 600 microlitres de B moyen à la chambre. Placez l’assemblage terminé sur l’étape de l’échantillon de l’AFM. Ajouter les lymphocytes T CD4-positifs à incubation IL-2 dans la chambre de l’échantillon.
Attendez que les cellules T de ciblage soient complètement réglées sur le fond du coverslip, puis amenez les cellules dans le champ de vision sous le microscope. Maintenant, ajoutez une goutte de colle biocompatible de deux microlitres sur l’extrémité du porte-à-faux monté avec une pipette. Une fois que la colle biocompatible a été appliquée sur le porte-à-faux, les étapes suivantes doivent être terminées dès que possible afin de maximiser l’adhérence.
Placez rapidement la tête de balayage sur l’étape de l’échantillon, en immergeant le porte-à-faux recouvert de colle dans la solution. Déplacez l’étape de l’échantillon jusqu’à ce qu’une cellule T sanitaire soit située sous la pointe du porte-à-faux. Ensuite, ajustez finement sa position en déplaçant la tête de balayage.
Ensuite, abaissez le porte-à-faux manuellement. Commencez par une taille d’étape de 50 microns, puis diminuez à 10, cinq, et deux et enfin 0,5 microns graduellement, comme indiqué par la netteté de l’image en porte-à-faux. Maintenant, maintenez la position des moteurs stepper, et ajuster le positionnement de la tête de balayage pour mieux aligner la pointe en porte-à-faux et la cellule.
Continuer jusqu’à ce que le contact ferme soit indiqué par un petit déplacement de la position du laser, correspondant à une force typique de 0,5 à 1,5 nanonewtons. Après 30 secondes de contact, rétractez le porte-à-faux. Si la cellule se déplace avec le porte-à-faux, l’attachement a été un succès.
Si ce n’est pas le cas, répétez l’adhérence jusqu’à trois fois avant de passer à un nouveau porte-à-faux. Placez la cellule T attachée au-dessus d’une cellule DC2.4 en déplaçant l’étape de l’échantillon et la tête de balayage. Après avoir mis en place des paramètres appropriés, exécutez la spectroscopie de force sur l’échantillon.
Pour une nouvelle série d’enquête, montez un nouveau porte-à-faux propre. Calibrez-le dans de l’eau pure, puis retournez à une paire de cellules T cellule dendritique et répétez l’analyse. Montez un couvercle en verre nettoyé jusqu’à l’assemblage de la chambre d’échantillon.
Sur le côté gauche du coverslip, ajouter une goutte d’une solution de perles diluée dans de l’éthanol et contenant des perles de polystyrène de six microns de diamètre. Une fois que le solvant s’évapore, vérifiez l’espacement des perles à l’aide d’un microscope à champ lumineux équipé d’un objectif 20x. Assurez-vous que les perles individuelles sont bien séparées.
Ensuite, trempez une pointe de micropipette ou un cure-dent dans une colle époxy bien mélangée, et transférez une petite quantité de colle à trois endroits distincts avec des touches douces successives sur le côté droit mais près du centre du coverslip, comme indiqué ici. Ensuite, montez un porte-à-faux nettoyé et sans pointe sur la tête de balayage de l’AFM, et calibrez-le dans l’air avec une surface propre pour obtenir la constante printanière. Ensuite, placez la pointe en porte-à-faux au-dessus de la limite gauche de la dernière tache de colle époxy, et rapprochez lentement le porte-à-faux de la colle à l’aide de petites tailles d’étapes sur les moteurs stepper.
Une fois que le contact a été fait avec la colle, tirez rapidement le porte-à-faux latéralement en déplaçant la tête de balayage AFM vers l’arrière. Retirez tout excès de colle en le frottant contre le verre, en ne laissant qu’une petite quantité de colle à l’extrémité de la pointe. Maintenant, déplacez la pointe en porte-à-faux sur une perle bien isolée.
Approchez la perle simple lentement, et entrez en contact ferme avec elle dans la gamme de deux à cinq nanonewtons pendant environ 10 secondes. Tout en prenant contact, utilisez l’ajustement de pointe fine pour positionner la perle à la toute fin de la pointe. Rétractez la pointe à la fin du contact.
Si la perle disparaît du plan focal d’origine, un événement d’adhérence réussie s’est produit. Enfin, démonter soigneusement le porte-à-faux modifié par les perles et le conserver dans une boîte en porte-à-faux pendant la nuit pour que l’époxy guérisse complètement. Voici les courbes typiques de distance de force de l’interaction contraignante entre une seule cellule T et une seule cellule dendritique au cours d’un cycle d’approche-rétractation.
La courbe rouge clair est la courbe d’extension, et la courbe rouge foncé est la courbe de rétractation. La valeur minimale dans la courbe donne une mesure de la force maximale d’adhérence entre la cellule T et la cellule dendritique, et la zone sous la courbe représente le travail nécessaire pour les séparer. Les événements de rupture brusques et pas à pas peuvent être interprétés comme des attaches membranaires retirées de la surface de la cellule en raison de la forte liaison à l’interface cellule-cellule, puis se brisant discrètement sous la traction continue.
Ici, la liaison conventionnelle de cellule T aux cellules dendritiques est montrée dans le gris, et la liaison réglementaire de cellule T aux cellules dendritiques est montrée en bleu. Les forces d’adhérence entre une cellule T conventionnelle et une cellule T réglementaire reconnaissent les antigènes peptidiques présentés par les cellules présentant des antigènes, tandis que les cellules T répressifs sont des cellules T suppressrices qui terminent l’immunité conventionnelle à técture des cellules T vers la fin d’une réaction immunitaire. Ce schéma d’une cellule RAW264.7 phagocytique étiquetée fluorescente montre la cellule approchée avec une seule perle de polystyrène nue de six microns de diamètre.
Lors de l’engagement de la perle, membrane PIP2 est triés sur le site de contact, près de b, ce qui induit ensuite le recrutement membranaire de moesin, résultant en un événement phagocytique. En plus de la procédure décrite ici, la spectroscopie à force unicellique basée sur l’AFM peut être utilisée avec l’imagerie par fluorescence pour étudier l’activation des cellules immunitaires en temps réel au niveau d’une seule cellule. Techniques combinées de fluorescence, cette méthode permet d’aborder des processus cellulaires plus complexes en temps réel, tels que la formation d’une synapse immunitaire entre la cellule dendritique et la paire de cellules T.
