Les auteurs tiennent à remercier Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, et Eric Lam pour leur aide dans ce projet. Ce projet a été financé par le NIH # 018208 PO1 HL.

1. Méthodes 1.1 Chambre débit cellulaire Une chambre d&#39;écoulement, illustré à la figure 1, a été construit de telle sorte que les cellules peuvent être cultivées sous un cisaillement de 1,0 Pa (10 dynes / cm 2), puis transféré directement à un asile MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). <ol><li> La chambre de circulation a été préparé pour l&#39;expérience d&#39;abord nettoyer les lames de verre dans une solution piranha (3:1 H 2 SO 4 H 2 O 2) pendant 15 min, puis les laver avec de l&#39;eau distillée. Ils ont ensuite été cuit à sec et revêtue d&#39;aminopropyltriéthoxysilane (APTES) dans une chambre de dépôt sous vide. </li><li> Un joint en silicone a été coupé à l&#39;aide d&#39;un outil de coupe Silhouette SD. Cela nous a permis de contrôler finement les dimensions de la chambre de débit pour le contrôle du débit et de la contrainte de cisaillement au cours de la croissance cellulaire. Typiquement, un chenal a été creusé de 6,4 mm de large par 19 mm de longueur à partir d&#39;une feuille de 0,4 mm de silicone. Le débit nécessaire à des genreste une contrainte de cisaillement de 1,0 Pa (10 dynes / cm 2) est calculé en supposant un écoulement laminaire dans un canal rectangulaire à l&#39;équation: </li></ol><img alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> où Q est le débit, τ est la contrainte de cisaillement, μ est la viscosité du milieu, supposé ici être 1,0 mPa (0,01 dynes * s / cm 2), h est la hauteur et w est la largeur de la chambre d&#39;écoulement . <ol start="3"><li> La pièce supérieure de la chambre d&#39;écoulement est alignée avec le joint d&#39;étanchéité dans la boîte de culture de cellules et fixé avec un anneau magnétique. L&#39;ensemble a été rempli avec de l&#39;alcool isopropylique (IPA) pour la stérilisation. </li><li> Le système en circuit principal a été assemblé. Les orifices d&#39;écoulement dans la boîte de culture cellulaire sont connectés à trois voies. Les vannes ont été raccordés à ouvrir seringue de 30 mls. IPA est passée dans le système, qui a été ensuite lavée avec 30 ml de milieu McCoy avec 4% de sérum de veau foetal (FCS). Le système a ensuite été rempli avec 20 ml du milieu Vec Technologies croissance cellulaire. Couvertures ont été placés sur les sommets des seringues. Le capuchon de la seringue capture réservoir avait une aiguille en place pour aller moyennes vers le réservoir d&#39;alimentation. Stériles filtres de 0,2 pm ont été attachés à des entrées d&#39;air dans les couvertures pour éviter la contamination du système. La chambre d&#39;écoulement est alors prêt pour l&#39;ensemencement des cellules. </li></ol> 1.2 Culture Cellulaire <ol><li> Les cellules endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) et le milieu de croissance ont été achetés auprès Technologies Vec (Rensselaer, État de New York) et cultivées jusqu&#39;à confluence dans un flacon T25. </li><li> Le milieu de croissance a été retiré de la fiole et la monocouche de cellules du modèle avec 2 ml de trypsine 2,5%. Une fois que les cellules sont en solution, le traitement à la trypsine a été stoppée par l&#39;ajout de 10 ml de milieu de culture cellulaire dans le ballon. </li><li> Thsuspension cellulaire est centrifugée e pendant 5 min et le surnageant a été éliminé. Les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu de culture cellulaire (contenant du sérum) pour l&#39;injection dans la chambre d&#39;écoulement. </li><li> La suspension de cellules (0,5 ml, ~ 50.000 cellules) a été chargée dans une seringue et injecté dans la chambre d&#39;écoulement à travers une vanne à trois voies. </li><li> Les cellules ont été autorisés à s&#39;installer et à adhérer au substrat de verre pendant 2 heures avant que le débit a été lancé. Les cellules ont été cultivées dans des flux dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 à 5 jours jusqu&#39;à confluence. </li></ol> 1.3 Préparation Cantilever et par pénétration cellulaire <ol><li> Sans pointe cantilevers AFM (NanoWorld, Suisse) ont été nettoyés dans de l&#39;acide nitrique pendant 5 min et fonctionnalisés avec aminopropyltriéthoxysilane (APTES) dans une chambre de dépôt en phase vapeur. </li><li> Une solution de 5 mg / ml en poids NHS-sulfo-LC-biotine dans une solution saline tamponnée de Hank (HBSS) a été préparé. Les consoles ont été immergés dans la solution pendant 15 min à conjuguésporte le silane avec du N-hydroxysuccinimide (NHS) chimie. </li><li> Une solution de biotine milieu exempt a été faite par incubation de 20 ml de Vec Technologies milieu de culture cellulaire (y compris le sérum) avec 200 ul de billes streptavadin pour 12 h. Les billes sont séparées du milieu d&#39;un aimant et le milieu a été filtré à travers un filtre stérile 0,22 um. </li><li> La chambre d&#39;écoulement a été retiré de la boîte de culture cellulaire et les cellules ont été lavées à 37 ° C sans biotine milieu. </li><li> Une solution mère de 1 ul de 2,4 um perles recouvertes de streptavidine dans 1 ml de biotine libre milieu a été préparé, et 100 ul du stock a été ajouté à la boîte de culture cellulaire. </li><li> Billes de streptavidine ont été ramassés en porte à faux avec l&#39;atterrissage par la pointe sur la surface du verre à côté d&#39;une perle, se rétractant, en positionnant le sommet de la console sur le talon, puis en appuyant vers le bas sur le cantilever les secondes de perles et de repos pour plusieurs. </li><li> La sensibilité de la mesure était en porte à fauxd par indentation sur une région de verre nu et en utilisant la pente de la courbe pour définir la déviation pointe en fonction de la tension. </li><li> La constante de rappel du levier a ensuite été calculé à partir d&#39;un calibrage thermique dans le logiciel MFP3D. </li><li> Le cantilever calibré a ensuite été utilisé pour indenter les échantillons, comme le montre la figure 2. Ces billes 2,4 um offrir une plus grande surface de contact avec la surface de la cellule de telle sorte que les propriétés mécaniques de la couche douce glycocalyx peut être détectée. Le cantilever a été placé sur une cellule près du noyau cellulaire et une approche douce de la pointe sur la cellule a été utilisée pour régler la hauteur cantilever environ 3 um-dessus de la surface de la cellule. Le logiciel a été créé pour 20 empreintes répétées à un taux de 1 um / s à une force maximale de 7 nN. Environ 6 secondes écoulé entre les contacts successifs. Il est possible d&#39;utiliser différents taux de retrait pour tester les propriétés dépendant du temps du glycocalyx, bien que dans ces premiers<html> expériences, seul un taux unique indentation (1 um / s) a été utilisé. </li></ol> 2. Théorie indentation Indentation dans un demi-espace élastique avec une sphère de rayon R peut être décrite en utilisant la théorie de Hertz, où la force d&#39;indentation, F, est donnée par l&#39;équation: <img alt="Équation 2" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> Où δ est la profondeur de pénétration et * E est le module de réduction de la matière en cours de test (figure 3). Dans le cas d&#39;un pénétrateur infiniment rigides projeter un uniforme élastique demi-espace, E * est donné par l&#39;équation: 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; où E est le module d&#39;élasticité et ν est le coefficient de Poisson du matériau. Les travaux récents de films polymères a inspiré le développement d&#39;un modèle à deux couches pour déterminer le module et l&#39;épaisseur des couches minces 1. Nous appliquons ce modèle pour la biologie cellulaire en traitant le glycocalyx comme un film uniforme mince souple sur la surface du corps de cellule. En utilisant ce modèle, le module réduit du système devient: <img alt="L&#39;équation 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> Où E est le module CA du glycocalyx, cellule E est le module d&#39;élasticité du corps de cellule, P, Q et n sont des constantes qui ont été déterminées empiriquement, à partir du polymère s&#39;insère, et z est donnée par l&#39;équation: <p class="jove_content" fo:keepTogether.within-pages = &quot;always&quot;&gt; <img alt="L&#39;équation 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> Où t est l&#39;épaisseur de la couche de glycocalyx. Un schéma de ces paramètres est illustré à la figure 3. Le modèle a été montré pour être un moyen précis de déterminer le module et l&#39;épaisseur d&#39;un film mince sur substrat rigide 1. Cette équation peut être utilisée pour ajuster les courbes obtenues à partir de l&#39;indentation dans les cellules pour déterminer le module et l&#39;épaisseur du glycocalyx endothéliale, comme le montre la figure 4.

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons utilisé les valeurs calculées à partir du modèle à deux couches et la théorie de Hertz pour modéliser l&#39;interaction d&#39;un leucocyte circulant dans le sang avec la paroi endothéliale. Nous avons calculé qu&#39;une microvillosités sur les leucocytes d&#39;un diamètre de 50 nm sous une charge de 10 pN aurait tiret environ 150 nm dans le glycocalyx, seule une fraction de l&#39;épaisseur totale. Ceci indique que le glycocalyx, avec des propriétés telles que mesurées dans cette expérience, es...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> McCoy moyen </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endothelial Cell Growth Medium </td><td> Technologies Vec </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Communs cellules humaines endothéliales de veine ombilicale </td><td> Technologies Vec </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Acide sulfurique </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triéthoxysilane </td><td> Aldrich </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Alcool isopropylique </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Cellgro </td><td> 25-054 C1- </td><td></td></tr><tr><td> Hank solution saline tamponnée </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-biotine </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Perles Streptavadin </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asylum Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers sans pointe </td><td> Nanomonde </td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouette-SD </td><td></td></tr><tr><td> Le caoutchouc de silicone </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 seringues ml </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 aiguilles de calibre </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongateurs </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> Vannes 4 voies </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Casquettes Port Mâle / Femelle </td><td> Smith médicale </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Pompe péristaltique </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Tuyau péristaltique </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> filtres stériles </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Notre compréhension de l&#39;interaction des leucocytes et la paroi de la cuve lors de la capture des leucocytes est limitée par une compréhension incomplète des propriétés mécaniques de la couche de surface endothéliale. Il est connu que les molécules d&#39;adhésion sur les leucocytes sont répartis non uniformément par rapport à la topographie de surface 3, que la topographie limite la formation de liaison adhésive avec d&#39;autres surfaces 9, et que les forces de contact physiologiques (≈ 5,0 à 10,0 pN par microvillosités) permet de compresser les microvillosités comme moins un tiers de leur longueur au repos, ce qui augmente l&#39;accessibilité des molécules à la surface opposée 3, 7. On considère que l&#39;endothélium d&#39;une structure à deux couches, le corps de cellule relativement rigide, plus la glycocalyx, un enrobage de sucre souple de protection sur la surface luminale 6. Il a été démontré que le glycocalyx peut agir comme une barrière pour réduire l&#39;adhérence des leucocytes à l&#39;endothélium 4 Surface.Dans ce rapport, nous commençons à aborder la déformabilité des surfaces endothéliales de comprendre comment la rigidité mécanique endothéliale pourrait affecter la formation de liaisons. Les cellules endothéliales en culture statique n&#39;expriment pas un glycocalyx robuste, mais les cellules cultivées dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques commencent à approcher le glycocalyx observée in vivo 2. Le module de l&#39;organisme des cellules endothéliales a été mesurée par microscopie à force atomique (AFM) à environ 5 à 20 kPa 5. L&#39;épaisseur et la structure du glycocalyx ont été étudiés en microscopie électronique à 8, et le module du glycocalyx a été estimés à l&#39;aide des méthodes indirectes, mais à notre connaissance, il n&#39;y a pas eu de rapports publiés par une mesure directe du module glycocalyx des cellules vivantes . Dans cette étude, nous présentons des expériences faites avec indentation une nouvelle sonde AFM sur des cellules qui ont été cultivées dans des conditions de maximiser leur expression glycocalyx à mamesures directes de la ke module et de l&#39;épaisseur de la glycocalyx endothéliale.

Dans une expérience typique, 20 force vs distance courbes ont été obtenues à partir d&#39;une région donnée de la cellule, généralement dans la région périnucléaire, à proximité, mais pas sur le noyau (dans ~ 2 um). Les courbes ont été alignés pour tenir compte de toute dérive échantillon au cours de la durée de la mesure, puis la moyenne pour éliminer le bruit en porte à faux, comme le montre la figure 4. Les courbes ont été analysés et qui cadrent avec le modèle à deux couche...

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Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Les caractéristiques mécaniques du glycocalyx endothéliale ont été mesurées par indentation à l&#39;aide des sphères micrométriques sur des cantilevers AFM. Les cellules endothéliales ont été cultivées dans une chambre de mesure dans des conditions physiologiques de flux pour induire l&#39;expression glycocalyx. Les données ont été analysées en utilisant un modèle de film mince pour déterminer l&#39;épaisseur et le module glycocalyx.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K vues.  University of Rochester. Les caractéristiques mécaniques du glycocalyx endothéliale ont été mesurées par indentation à l'aide des sphères micrométriques sur des cantilevers AFM. Les cellules endothéliales ont été cultivées dans une chambre de mesure dans des conditions physiologiques de flux pour induire l'expression glycocalyx. Les données ont été analysées en utilisant un modèle de film mince pour déterminer l'épaisseur et le module glycocalyx.

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Recherche

Bio-ingénierie

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthèse des hydrogels avec des propriétés antisalissure Membranes pour la purification de l&#39;eau

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Un système de test en flexion millimètre pour mesurer les propriétés mécaniques des Spicules d’éponges marines

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Biaxiales caractérisations mécaniques des valvules auriculo-ventriculaire

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...