L&#39;assistance technique et l&#39;instrumentation de l&#39;Université du Maryland Greenebaum Cancer Center translationnelle base installation, en particulier MM. Rena Lapidus et Mariola Sadowska, grandement appréciée. Le travail responsable de l&#39;élaboration de cet essai a été financé en partie par les NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un prix d&#39;excellence VA à AP, et par l&#39;Université de Maryland cigarettes fonds de restitution (CRF) fourni à la Marlene Stewart &amp; Cancer Center Greenebaum.

Plusieurs étapes sont effectuées à l&#39;avance, et plusieurs réactifs sont préparés et stockés avant la procédure: (1) la culture de cellules et de la protéine isolée, (2) la préparation d&#39;un oligonucléotide, (3) la préparation des plaques à 96 puits, (4) un extrait nucléaire incubation pendant une nuit. Procédure nécessite deux jours en raison de la nuit d&#39;incubation de la protéine nucléaire avec des oligonucléotides d&#39;ADN. Une. Préparation de tampons 1.1 l&#39;isolement de la protéine nucléaire <ol><li> Hypotonique tampon: Pour préparer 100 ml de tampon hypotonique, ajouter 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 pi (1 M MgCl 2), 333 pi (3 M KCl) à 98,3 ml H 2 O. Les concentrations finales: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM de KCl. Pour tampon hypotonique + NP40 (pour utilisation à l&#39;étape 2.11): Ajouter 0,5 ml (10% NP40) à 9,5 ml de tampon hypotonique pour finale de 0,5% NP40. </li><li> Tampon bas du sel: Pour préparer 100 ml de tampon de faible teneur en sel (pour utilisation à l&#39;étape 2.15), ajouter 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycérol, 150 pi (1 M MgCl 2), 666 pi (3 M KCl), 40 pi (0,5 M EDTA) à 73 ml H 2 O. Concentration finale: 10 mM HEPES, 25% de glycerol, 1,5 mM MgCl 2, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM. </li><li> Buffer High Salt: Pour préparer 100 ml de tampon de sel élevé (pour une utilisation à l&#39;étape 2.15), ajouter 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml de glycérol, 150 pi (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 pi (0,5 M EDTA) à 47 ml de H 2 O. Concentration finale: 10 mM HEPES, 25% de glycerol, 1,5 mM MgCl 2, KCl 800 mM, EDTA 0,2 mM. </li><li> 10% de NP40 détergent: 10 ml de NP40 à 90 ml H 2 O </li><li> Les inhibiteurs de protéase et la phosphatase [ajoutée à un tampon hypotonique + NP40 (étape 2.11), à faible tampon de sel (étape 2.15), et de tampon élevée en sel (étape 2.15) juste avant d&#39;utiliser]: Ajouter 2,5 pi (1 M DTT) et 50 ul d&#39;inhibiteurs de protéases (100x) à 5 ml de tampon pour chaque concentration finale de 0,5 mM de DTT et des inhibiteurs de protéase 1x. Le 100x actions mélange inhibiteur de la protéase comprend:le fluorure de sodium (Ser / Thr, phosphatases acides), orthovanadate de sodium (Tyr, phosphatases alcalines), β-glycérophosphate (phosphatases Ser / Thr), le pyrophosphate de sodium (les phosphatases Ser / Thr), aprotinine (Ser proteases), la bestatine (amino-peptidases ), E64 (les protéases à cystéine), leupeptine (protéases Ser / Cys), EDTA (métalloprotéases). </li></ol> 1.2 Préparation des plaques d&#39;essai <ol><li> Solution plaque de fixation: Pour préparer 500 ml de solution, ajouter du carbonate de sodium à 5,25 g pour 500 ml H 2 O, bien mélanger et ajuster le pH à 9,7 pour une concentration finale de carbonate de sodium à 0,1 M. </li><li> Plaque solution de blocage: Pour préparer magasin poly dI / dC oligonucléotide, remettre en suspension 1 unité (~ 50 mg) de poly dI / dC dans 1 ml de Tris 10 mM / HCl, pH 7,9 contenant 1 mM d&#39;EDTA pour une concentration de l&#39;action de 50 ug / pl. Le stock est diluée à 1 pg / pl avant utilisation. </li></ol> 1.3 tampons de lavage et des dilutions d&#39;anticorps REMARQUE: tampon de lavage streptavidine est<html> utilisée pour le lavage des plaques entre les deux additions et de diluer les anticorps primaires et secondaires. <ol><li> Pour préparer 1 L de tampon de lavage de la streptavidine, ajouter 2,4 g de Tris / HCl, 37,5 ml (4 M de NaCl), 10 ml (10% de BSA), 5 ml (10% de Tween-20), à une eau filtrée L Millipore stérile , pH 7,18. Stocker à 4 ° C. Concentration finale: 20 mM Tris / HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20. </li></ol> 1,4 tampon de liaison à l&#39;ADN NOTE: Ce tampon est conservé à -20 ° C. <ol><li> Pour préparer 15 ml de tampon de liaison de l&#39;ADN, ajouter 180 pi (1 M HEPES, pH 7,9), 300 pi (3 M KCl), 12 pi (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 pi (1 M TNT), 3,0 ml (60% de glycerol), 300 ul (50 ug / ul de poly dI / dC) dilué avec désionisée / distillée H 2 O (12 ml). Les concentrations finales: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM de KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM de DTT, 12% glycérol, 1 ug / ul poly dI / DC. </li></ol> 2. Culture cellulaire et l&#39;isolement de la protéine nucléaire t &quot;&gt; NOTE: La préparation nécessite environ 3 heures de stimulation des cellules dépendra de l&#39;expérience, le nombre de cellules utilisées pour chaque expérience sera variable et tous les volumes reflètent une expérience typique utilisant 3 x 10 7 cellules / Point ajuster les volumes d&#39;accommodement... le nombre de cellules effectivement utilisée dans l&#39;expérience 6. <ol><li> Pour préparer la protéine nucléaire à des essais de liaison ADN, des cultures de cellules humaines qui expriment RUNX2 (endothélial, l&#39;ostéosarcome, des cellules de cancer du sein) dans des milieux appropriés 6. </li><li> Traiter les cellules sous-confluentes avec du nocodazole (0,2 pg / ml pendant 16 heures) pour arrêter les cellules en G2 / M du cycle cellulaire limite 6. Dans ces conditions, la protéine de RUNX2 ADN est stabilisé et la liaison maximale est atteinte. De cette manière, assez de protéine nucléaire est disponible pour de multiples dosages et les inhibiteurs peuvent être comparées à la même préparation. </li><li> Pour chaque étape, de pré-refroidir la centrifugeuse à 4 ° C et préparer des tampons et refroidir 20 min à 4 ° C avant la récolte des cellules.</li><li> cellules Chill (4 ° C) et les procédures de conduite sur glace. </li><li> Centrifuger les cellules à 1000 rpm pendant 5 min dans un tube à fond rond de 15 ml en polypropylène. </li><li> Laver 1x avec du PBS glacé (Ca 2 + et Mg 2 + libre). </li><li> Centrifuger à nouveau et jeter PBS surnageant. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon hypotonique sans inhibiteurs de protéase, en prenant soin de remettre en suspension complètement le culot cellulaire. </li><li> Transférer le contenu dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger immédiatement à 5500 tours par minute pendant 5,5 min; jeter le surnageant et garder le culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon hypotonique contenant 0,5% de NP40. Ajouter protéase et d&#39;inhibiteurs de phosphatase et 0,5 mM de DTT (comme décrit dans l&#39;étape 1.1.5). </li><li> Laisser l&#39;échantillon reposer sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Centrifuger à 13000 rpm pendant 10 min. </li><li> Jeter le surnageant (contient les protéines cytosoliques). </li><li> Reprendre le culot nucléaire dans 60 pi de chacun bas salt tampon (à laquelle les inhibiteurs de protéase et 0,5 mM de DTT ont été ajoutés à l&#39;étape 1.1.5) et le tampon de sel élevé (dont les inhibiteurs de protéase et 0,5 mM de DTT ont été ajoutés à l&#39;étape 1.1.5) pour un total de 120 pi. Ajouter 60 ul de tampon de faible teneur en sel de la pastille première et remettre en suspension, puis ajouter 60 ul de tampon élevée en sel. Vortex le culot pour aider à la remise en suspension. </li></ol> REMARQUE: Cette étape permet de se débarrasser de certaines des protéines de la membrane nucléaire et mis en place pour l&#39;étape de lyse: faible teneur en sel en premier (remettre le culot, vortex), puis élevée en sel (vortex) optimise cette étape. Gardez extrait sur la glace pendant 30 minutes, avec des vortex après les 10 premières minutes. <ol start="16"><li> Centrifugeuse à 12000 rpm pendant 15 min; garder le surnageant contenant la protéine nucléaire. </li><li> Mesurer la concentration de protéine (essayer de conserver les échantillons à 2-5 mg / ml), aliquote en quantités appropriées (10 pl / tube) et conserver à -80 ° C. </li></ol> NOTE: Le rendement estimé: 30 x 10 6 cells donneront 5 ug / ul protéine dans 120 pl. 5 x 10 6 cellules vont donner 2,2 ug / ul protéine dans 40 pi. 3. Préparation des oligonucléotides double brin <ol><li> Concevoir des oligonucléotides complémentaires avec demi-sites compatibles sur les extrémités. Pour RUNX2 ce sont: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-biotine (sens) et 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-biotine (antisens). </li></ol> REMARQUE: Des expériences pilotes déterminés que trois sites de liaison de RUNX2 et unique fin biotine ont donné les résultats les plus reproductibles. <ol start="2"><li> Préparer le tampon d&#39;hybridation 5x: ajouter 300 ul (1 M de Tris-HCl, pH 7,6), 30 ul (1 M MgCl 2), 10 ul (1 M DTT) à 260 ul de H 2 O (finale 600 ul). </li><li> À 200 pmol de chaque olig simple brinonucleotide (3 pi), ajouter 12 ul de tampon d&#39;hybridation 5x et 45 ul de H 2 O pour un total de 60 ul (ul) 200 pmol/60. </li><li> On chauffe à 95 ° C pendant 5-10 min dans un bloc de chauffage. </li><li> Refroidir à 65 ° C lentement (en réglant la température à 65 ° C, il faut 15 min), puis refroidir à température ambiante lentement par la mise hors tension du bloc de chauffage (ou en le plaçant dans 50 ml de l&#39;eau à 65 ° C dans un bécher sur la glace, ce qui prend 15-20 min). </li></ol> 4. Préparation des plaques à 96 puits NOTE: Ne pas utiliser de protéines de lait dans les tampons de lavage. <ol><li> Fixer la platine avec une solution de fixation (carbonate de sodium 0,1 M): ajouter 300 pl / puits. </li><li> Incuber pendant 2 heures par basculement à température ambiante (RT), ou pas de basculer à 4 ° C (O / N). </li><li> Laver la plaque 3x avec du tampon de lavage de streptavidine (BM): ajouter 300 pl / puits à chaque fois. </li><li> Ajouter oligonucléotide double brin marqué à la biotine (sites de liaison 3 de consensus par nucléotide) pendant 2 h wrâce à bascule (1,25 nmol / bien; 100 pl / puits). </li><li> Laver pendant 3x avec la BM froid: ajouter 300 pl / puits, puis inverser immédiatement la plaque dans un évier et efface les bords sur une serviette en papier après chaque addition. </li></ol> NOTE: Ne pas utiliser des embouts de pipette pour éliminer le liquide des plaques car cela peut gratter avidine: biotine: complexes d&#39;ADN provenant des puits. Pour ce faire, pour toutes les étapes de lavage ultérieures. 5. L&#39;incubation avec l&#39;extrait nucléaire NOTE: Ne pas remplacer le saumon ou l&#39;ADN de sperme de hareng pour la poly tampon de blocage dI / dC. Éviter le blocage des plaques avec des protéines de lait. Ces deux agents bloquants entraînent des valeurs de fond élevé. <ol><li> Incuber avec le facteur de transcription spécifique préparé à partir d&#39;extrait nucléaire (90 pl / puits). Préparer un mélange maître contenant de l&#39;extrait nucléaire (protéine de liaison à l&#39;ADN; 3-9 pg / puits) + poly dI / dC (1 pg / pl d&#39;une ug / stock ul 50) 1x ADN tampon de liaison. Le volume est nécessaire pour que le nombre total d&#39;puits nécessaires (90 pl / puits). </li><li> Tout inhibiteur potentiel, tel que la vitamine D3 (figure 2) ou d&#39;un composé CADD 5221975 (figure 3), ou de la dilution appropriée de la commande solvant, tel que l&#39;éthanol, est ajouté à cette étape. </li><li> Placez la plaque sur la plate-forme à bascule, O / N à 4 ° C. </li><li> Laver pendant 3x avec la BM: ajouter 300 pl / puits </li></ol> 6. L&#39;addition d&#39;anticorps primaire REMARQUE: des dilutions d&#39;anticorps primaires devraient être préparées - stockage n&#39;est pas recommandé. <ol><li> Diluer l&#39;anticorps monoclonal spécifique RUNX2 (stock 1 pg / pl) 1/5, 000 en streptavidine tampon de lavage. Préparer suffisamment pour être ajoutés à chaque puits de la plaque à 96 puits (90 pl / puits) en trois exemplaires. </li><li> Incuber pendant 1 heure à température ambiante sur une plate-forme à bascule. </li><li> Laver pendant 3x avec la BM, ajouter 300 ul / puits. </li></ol> 7. L&#39;addition d&#39;un anticorps secondaire REMARQUE: des dilutions d&#39;anticorps secondaires peuvent être storouge à 4 ° C pendant la nuit si nécessaire le lendemain. <ol><li> Diluer F ab-spécifique purifié par affinité-HRP anticorps conjugué (7,1 mg / stock ml) à 1:1,400 dans streptavidine tampon de lavage: tampon 3,5 pi antibody/5.0 ml de lavage. Préparer suffisamment pour être ajoutés à chaque puits de la plaque à 96 puits (90 pl / puits) en trois exemplaires. </li><li> Incuber pendant 30 min à température ambiante sur une plate-forme à bascule. </li><li> Laver 6x avec la BM en retournant la plaque dans l&#39;évier (300 pl / puits). </li></ol> 8. HRP Substrate et développement de produits <ol><li> Ajouter 50 ul de substrat TMB par puits directement sur stock bouteille. </li><li> Incuber 10-20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité (arrêt procédé de réaction) ou mesurer l&#39;absorbance directement (suivi cinétique continu). </li></ol> 9. Réaction de mesure <ol><li> Arrêtez méthode de réaction: Pour la réaction d&#39;arrêt visuel, vérifier le changement de couleur du clair au bleu et arrêter la réaction avec de l&#39;acide sulfurique 50 pi. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance à 450 nm avecle lecteur de plaque visible spectrophotomètre Biotrak II (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) ou un instrument similaire. </li><li> Continue méthode de suivi cinétique: Ajouter substrat après le dernier lavage et juste avant de passer dans le spectrophotomètre (ne vous arrêtez pas la réaction). </li><li> Mesurer l&#39;absorbance à 635 nm avec le Bio-Tek Synergy HT Multi-réaction lecteur de microplaques Spectrophotomètre (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, États-Unis) ou un instrument similaire. </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

des dosages de liaison à l&#39;ADN sont utilisées pour mesurer la capacité des facteurs de transcription pour interagir avec l&#39;ADN. Les dosages de liaison de l&#39;ADN comprennent la mobilité électrophorétique (EMSA) et une chromatine immuneprecipitation (ChIP) essais basés 3 ainsi que des dosages utilisant des formats à 96 puits 4 tels que des dosages chimiluminescents 2. L&#39;EMSA est non quantitative et utilise radiomarqué (32 P) oligonucléotides. ...

des dosages de liaison à l&#39;ADN sont utiles dans la mesure de la capacité des facteurs de transcription pour interagir avec l&#39;ADN. Les dosages pour l&#39;ADN de liaison comprennent des dosages de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) qui dépendent des oligonucleotides radiomarqués 1 ou 2 essais de chimioluminescence. Essais chromatine immuneprecipitation (ChIP) sur la base 3, ainsi que des tests employant des formats de 96 et 4 ont également été décrites. Cependant, l&#39;EMSA est un essai non-quantitative qui nécessite l&#39;utilisation d&#39;oligonucléotides radiomarqués. Lorsque les protéines nucléaires associent à des séquences spécifiques de promoteur de nucléotides, complexes de liaison sont retardés sur des gels de polyacrylamide et le facteur de transcription spécifique puissent être validées par un anticorps &quot;supershift&quot;. Nous avons développé un dosage de liaison à l&#39;ADN quantitative en utilisant un format d&#39;immuno-enzymatique (ELISA-D), qui est capable de mesurer l&#39;interaction des RUNX2 avec des séquences de liaison à l&#39;ADN correspondant à des éléments promoteurs définis igènes cibles de n RUNX2. Utilisation d&#39;un anticorps anti-RUNX2 fournit la spécificité de l&#39;essai et de l&#39;absence de ce dosage radio-marqueur de distinction à partir de l&#39;essai de décalage de gel traditionnel 5. La détection de complexes de liaison est possible avec l&#39;utilisation d&#39;un anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort (HRP), qui convertit un substrat HRP, tétraméthyl benzidine (TMB) en un produit coloré pour l&#39;analyse spectrophotométrique. L&#39;analyse présentée ici peut intégrer l&#39;utilisation d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN mutées comme témoins et peut être utilisé pour la détection des inhibiteurs compétitifs ou non compétitifs de liaison à l&#39;ADN. Le criblage de composés anti-tumoraux est également possible avec ce dosage.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

De nombreux essais de liaison à l&#39;ADN tels que les tests électrophorétique de décalage de mobilité (EMSA), des dosages chimioluminescents, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à base de tests et des analyses multi-puits-base sont utilisés pour mesurer l&#39;activité du facteur de transcription. Cependant, ces tests sont non quantitative, manquent de spécificité, peuvent impliquer l&#39;utilisation d&#39;oligonucléotides radiomarqués, et peuvent ne pas être adaptable pour le dépistage des inhibiteurs de liaison à l&#39;ADN. D&#39;autre part, en utilisant un dosage quantitatif de liaison d&#39;ADN immuno-enzymatique (D-ELISA), nous démontrons les interactions entre protéines nucléaires avec l&#39;ADN en utilisant le facteur de transcription de RUNX2 qui dépendent de la liaison spécifique à des séquences de liaison à l&#39;ADN consensus présents sur biotine- oligonucléotides marqués. Préparation de cellules, extraction de protéine nucléaire, et la conception des oligonucléotides bicaténaires sont décrits. Plaques de 96 puits revêtues d&#39;avidine sont fixées avec du tampon alcalin et incubées avec des protéines nucléaires dans un tampon de blocage nucléotidique. Follen raison lavage extensif des plaques, un anticorps primaire spécifique et les incubations d&#39;anticorps secondaires sont suivies par l&#39;addition du substrat de la peroxydase de raifort et le développement de la réaction colorimétrique. mode de réaction d&#39;arrêt ou suivi cinétique continue ont été utilisés pour mesurer quantitativement l&#39;interaction de la protéine avec l&#39;ADN. Nous discutons des contrôles de spécificité appropriées, y compris le traitement par IgG non spécifique ou sans protéines ou anticorps primaire. Les applications de l&#39;essai sont décrits notamment son utilité dans le criblage de médicaments et les résultats positifs et négatifs représentatifs sont discutés.

Procédé D-ELISA est hautement spécifique de la protéine de liaison d&#39;ADN désignée dans la mesure où, d&#39;un oligonucléotide double brin spécifique de séquence qui contient trois copies du site de liaison consensus de RUNX2 (ACACCA) est utilisé. L&#39;anticorps primaire reconnaissant le facteur protéique améliore également la spécificité. L&#39;anticorps secondaire lié de manière covalente contient la peroxydase de raifort (HRP) qui convertit un substrat transparent (tétraméthyl benzidine) en un...

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A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Nous avons développé, un dosage quantitatif liaison à l&#39;ADN à base d&#39;ELISA pour mesurer les interactions de facteurs de transcription à l&#39;ADN. Une spécificité élevée pour la protéine de RUNX2 a été obtenue avec un consensus de l&#39;ADN-oligonucléotide reconnaissance et l&#39;anticorps monoclonal spécifique. Détection colorimétrique avec un substrat de réaction de l&#39;anticorps couplé à une enzyme a été suivie en temps réel.

Un dosage quantitatif pour l&#39;étude de protéines: ADN Interactions, Découverte de transcription régulateurs de l&#39;expression des gènes, et identifier les agents anti-tumoraux

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

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JoVE Journal

Biology

18.5K vues.  University of Maryland School of Medicine.  Nous avons développé, un dosage quantitatif liaison à l'ADN à base d'ELISA pour mesurer les interactions de facteurs de transcription à l'ADN. Une spécificité élevée pour la protéine de RUNX2 a été obtenue avec un consensus de l'ADN-oligonucléotide reconnaissance et l'anticorps monoclonal spécifique. Détection colorimétrique avec un substrat de réaction de l'anticorps couplé à une enzyme a été suivie en temps réel. 

Vidéo: A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Salut-C: une méthode d&#39;étude de l&#39;architecture tridimensionnelle des génomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l&#39;expression et l&#39;activité transcriptionnelle des astrocytes<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)