Discussions utiles avec Isja de Feijter et Matt Baker grandement appréciée.

Une. Synthèse des capteurs <ol><li> Dans la section suivante, nous proposons une procédure pour la conjugaison d&#39;indicateurs de pH de dendrimères PAMAM. Le même protocole peut être appliqué avec une modification minimale de substitution amine dendrimères porteurs. 5,17,13,14 dendrimères et les colorants disponibles dans le commerce peuvent être utilisés sans autres purifications. </li><li> Dissoudre le dendrimère dans du DMSO anhydre (50 uM de concentration finale). Préparer des solutions de 10 mM d&#39;achat d&#39;actions de la fluorescéine NHS et tétraméthyl-rhodamine-NHS (TMR) dans DMSO anhydre. </li><li> Ajouter à la solution de dendrimère la quantité désirée de la fluorescéine et TMR. Le rapport molaire dans le mélange va tenir compte de la quantité de colorants chargées sur le dendrimère. Typiquement, 1 ml de solution de dendrimère de PAMAM G4 dans un microtube est mis à réagir avec 8 eq (40 ul) de la fluorescéine et 8 eq (40 ul) de la TMR. Agiter la solution à la température ambiante pendant 12 heures. </li><li> Diluer à 1:10 avec de l&#39;eau déminéralisée et charger la réactionmélange dans un sac de dialyse (MWCO = 10 kDa). Dialyser pendant 24 heures contre de l&#39;eau désionisée le remplacement fréquent de l&#39;eau dans le réservoir. </li><li> Transférer la solution dans un flacon et lyophiliser pendant 24 heures. Une poudre pourpre devrait être obtenu. Poids du solide obtenu et dissoudre dans de l&#39;eau milliQ à une concentration finale de 10 uM. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C. </li></ol> 2. Mesures in vitro de pH <ol><li> Pour vitro étalonnage en préparer une solution de 500 nM de dendrimère dans du PBS (phosphate 2 mM) dans une cuvette en quartz. L&#39;utilisation d&#39;un tampon PBS très diluée (2 mM) afin d&#39;éviter des changements brusques de pH au cours de la titration est recommandée. </li><li> Mesurer les spectres d&#39;émission de la fluorescéine (exc 488 nm) et TMR (exc 550 nm) et d&#39;optimiser les paramètres optiques du fluorimètre pour obtenir un bon rapport signal-sur-bruit. </li><li> Effectuer un titrage pH en ajoutant de petites quantités de NaOH 0,1 N et HCl 0,1 N. Après chaque ajout secouer la cuvettepour mélanger, attendre 1 min pour atteindre l&#39;équilibre et de mesurer le pH au moyen d&#39;une micro-électrode de pH. Les spectres d&#39;émission de la fluorescéine et TMR doivent être enregistrées pour chaque étape sans aucun changement dans les paramètres optiques. </li><li> Tracer l&#39;intensité de la fluorescence en fonction du pH pour le titrage. Le signal de la rhodamine devrait pas être affecté par le pH (&lt;10%). Le signal de la fluorescéine doit être une courbe sigmoïde et doit être équipé d&#39;un modèle unique de liaison avec pK = 6,4. </li></ol> 3. Culture cellulaire et électroporation <ol><li> Cultiver des cellules HeLa dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine (Invitrogen). Maintenir une culture de cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5%. </li><li> Pour dendrimère électroporation, lorsque les cellules sont confluentes, retirez le support et laver les cellules en utilisant DPBS (tampon phosphate salin de Dulbecco). Retirez le DPBS et ajouter la trypsine-EDTA. Neutraliser le tryppécher par addition de milieu contenant du sérum mais pas d&#39;antibiotiques. Centrifuger à 900-1,200 rpm pendant 2 min à température ambiante. Retirez le support et rincer les pastilles en utilisant DPBS. </li><li> Compter les cellules et prendre 4 * 10 6 cellules. Centrifuger à 1.200-1.500 tours par minute pendant 2 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 pi de tampon de microporation (fourni par le fabricant du microporateur) et transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter solution aqueuse dendrimère dans les cellules remises en suspension. La quantité de dendrimère requis par échantillon dépend du type PAMAM (typiquement de 250 nM pour le cationique et 2 uM de dendrimères neutres). </li><li> Ajouter du tampon d&#39;électroporation (fourni par le fabricant de microporateur) dans un tube de microporation. Introduire à la pipette les cellules et les dendrimères mélanges avec la pointe d&#39;électroporation de 100 pi volume de taille. Insérer la pipette d&#39;microporateur dans le poste de pipette. Définir l&#39;état d&#39;impulsion pour microporation: tension d&#39;impulsion = 1,005 V; impulsion wide = 35 ms, le nombre d&#39;impulsions = 2. </li><li> Après que les cellules de transfert de l&#39;impulsion à une 1,5 ml, tube à centrifuger et centrifuger les cellules pendant 5 min à 1200 rpm pour éliminer l&#39;excès de dendrimère dans le milieu. Plaque 10 pi de cellules par électroporation sur des boîtes à fond de verre de 35 mm (WillCo-plat GWSt-3522) avec du milieu frais w / o des antibiotiques. </li></ol> 4. pH de détection dans les cellules vivantes HeLa <ol><li> cellules d&#39;image avec un microscope confocal 12 heures après l&#39;électroporation. </li><li> Jeu de filtres standard pour la fluorescéine et la rhodamine peuvent être utilisés. Si des filtres accordables sont disponibles ensemble un canal vert 500-550 nm et un canal rouge de 580 nm à 650 nm. Excitation à 488 nm est optimale pour la fluorescéine pendant rhodamine peut être imagée soit avec le 543nm ou de la ligne de laser 561. </li><li> Focus sur l&#39;échantillon et ajuster les lasers de puissance et détecteurs acquérir pour maximiser le rapport signal-sur-bruit. Si l&#39;électroporation des cellules était de succès devraient être fluorescent brillamment dans les deux canaux. Lalocalisation dépend de la taille et la charge du dendrimère utilisé. Souvent certains localisation lysosomale (petites vésicules périnucléaires) est présent en raison d&#39;endocytose ou cloisonnement. Si la localisation lysosomale est prédominant, c&#39;est à dire la majeure partie de la fluorescence est localisée à l&#39;intérieur des vésicules et un signal faible est observée dans le cytosol, cela indique une toxicité et de mesure doivent être jetés. Acquérir successivement les deux canaux, si nécessaire l&#39;acquisition de plusieurs images et la moyenne des images pour améliorer la qualité de l&#39;image. </li><li> Pour l&#39;étalonnage pince cellule pH en utilisant des tampons avec des ionophores à différents pH et à acquérir au moins 20 cellules par un pH tel que décrit ci-dessus. Pour une description détaillée de la procédure et la composition des tampons s&#39;il vous plaît se référer à Bizzarri et Collègues. 16 Nous proposons de mesurer au moins 5 points de pH = 5,5 à pH = 7,5. pH inférieur à 6 sont toxiques pour les cellules, mais toléré pour peu de temps, nous vous proposons d&#39;acquérir les images aussi vite que possible. Si les cellulesmontrer des signes d&#39;apoptose, jetez les cellules et redémarrer. </li><li> Utilisez ImageJ ou un logiciel analogue pour l&#39;analyse des données. Importez les images de la voie verte et rouge, soustraire fond et créer un pixel par pixel rapport imagerie avec l&#39;outil &quot;Calculateur de l&#39;image&quot;. </li><li> Dessiner une région d&#39;intérêt (ROI) en sélectionnant la cellule souhaitée et mesurer le rapport du vert au rouge intracellulaire. Analyser toutes les images acquises puis tracer le ratio par rapport au pH. Dans la gamme de 5,5 à 7,5 la tendance devrait être linéaire. L&#39;ajustement linéaire des points obtenus donnera la courbe d&#39;étalonnage qui sera utilisé pour convertir le rapport du vert au rouge à pH. </li><li> En outre le contrôle acquérir plusieurs cellules non traitées (sans ionophores) et essayer de calculer le pH de la courbe d&#39;étalonnage obtenue. Une valeur comprise entre 7,2 et 7,4 soit obtenu. </li></ol> 5. In Vivo Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Les expériences ont été effectuées sur C57BL/6J (mâles et femelles) entre postnatale day 28 et 70. Anesthésiés la souris par une injection intrapéritonéale d&#39;uréthane (c&#39;est-carbamate d&#39;éthyle) (20% p / v dans une solution saline physiologique, 20 mg / kg d&#39;uréthane). Les animaux ont été sacrifiés après essai avec une surdose d&#39;uréthane suivie d&#39;une injection intracardiaque de la même anesthésique. </li><li> Effectuer une injection intramusculaire de phosphate sodique de dexaméthasone (2 mg / kg de poids corporel) pour réduire la réponse au stress et l&#39;oedème cérébral cortical au cours de la chirurgie. </li><li> Raser la tête de l&#39;animal et appliquer le gel de lidocaïne à 2,5% sur le cuir chevelu. </li><li> Utilisez des ciseaux pour couper le lambeau de peau recouvrant le crâne des deux hémisphères </li><li> Laver l&#39;os exposé avec une solution saline et retirez délicatement le périoste avec une pince. Cela permettra une meilleure base pour la colle et ciment dentaire à adhérer avec. </li><li> Appliquer un acier poste de chef fait sur mesure avec une chambre d&#39;imagerie centrale et coller avec cyanoacrylate dans un plan sensiblement parallèle avec le crâne sur la région corticale de intérêt et le fixer en place avec du ciment dentaire blanc (Paladur). </li><li> Fixez la tête de la souris pour effectuer une craniotomie de 2-3 mm de diamètre foré sur la région d&#39;intérêt. </li><li> Essayez de minimiser l&#39;échauffement du cortex pendant la chirurgie, les larmes dural, ou des saignements. </li><li> Maintenir le cortex superfusées avec ACSF stérile (NaCl 126 mM, KCl 3, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM de CaCl2, glucose 15 mM, HEPES 1,2 dans H2O distillée , pH = 7,4). </li></ol> 6. imagerie de pH dans le cerveau de souris <ol><li> Au cours de la respiration des animaux de l&#39;aide de l&#39;expérience fournissant O 2 de l&#39;air enrichi. L&#39;oxygène est enrichi jusqu&#39;à 80%. O 2 pression partielle et la circulation est fréquemment ajustés pour obtenir une aide à la respiration adéquate. Maintenir constante la température du corps à 37 ° C avec une couverture chauffante contrôlée rétroaction. </li><li> Fixer l&#39;animal par la poste en acier sous l&#39;objectif d&#39;un deux-photoconfiguration n d&#39;imagerie. </li><li> Afin d&#39;injecter la sonde dans le cortex cérébral charger une pipette en verre contenant une électrode AgCl (diamètre de pointe de 4 mm) avec la solution de dendrimère (1 uM). L&#39;électrode permet d&#39;enregistrer les potentiels de champ extracellulaires. </li><li> Avec une installation de micro-injection insérer la pipette dans le cortex à environ 150 um de profondeur. Injecter pendant 1-2 min à une pression de 0,5 psi. </li><li> Optimiser le montage optique pour l&#39;imagerie. Puissance du laser doit être ajustée pour minimiser photoblanchiment et le photovieillissement. Typiquement, la puissance du laser utilisé est de l&#39;ordre de 20 mW et le gain PMT a été maintenue constante à 667 V depuis les étalonnages précédents ont montré que cette tension donne le meilleur rapport signal / bruit. </li><li> Pour l&#39;imagerie exciter le capteur à 820 nm et de détecter simultanément la fluorescéine et la fluorescence de la rhodamine à travers des filtres FITC et TRITC standard. </li><li> Pour le temps des mesures résolues acquérir série laps de temps de 2 Hz. </li><li> Pour la correction de fond acquérir un cadre noir avec le laser obturateur fermé pour mesurer le bruit thermique moyenne survenant dans les PMT et le piédestal généralement ajoutées par l&#39;électronique. </li><li> Pour l&#39;analyse des données selon la même procédure indiqué à la section 4. </li></ol>

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Par défaut: les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les étapes essentielles pour l&#39;imagerie de pH réussie avec des capteurs à base de dendrimères sont: i) la sélection de l&#39;échafaudage dendritique correct et le nombre d&#39;indicateurs conjugués à elle et ii) l&#39;optimisation du protocole de distribution de capteur dans des cellules ou in vivo. Le mode opératoire de synthèse est relativement simple et peut être appliquée à pratiquement tous polymère hyperbranché amine portant. Les capteurs peuvent être obten...

L&#39;utilisation de molécules fluorescentes pour marquer des molécules biologiquement pertinentes spécifiques a complètement changé la façon dont nous étudions les systèmes biologiques. Widefield et la microscopie confocale a permis un temps réel à haute résolution de visualisation de processus biologiques et sont aujourd&#39;hui parmi les techniques les plus populaires pour étudier les événements biologiques in vitro, dans des cellules et in vivo. 1 Une amélioration pertinente a été représentée par l&#39;élaboration d&#39;indicateurs de fluorescence , c&#39;est à dire des colorants dont la fluorescence dépend de la concentration d&#39;une entité moléculaire spécifique. pH et de calcium indicateurs en particulier ont eu un impact dramatique sur l&#39;étude de la physiologie de la cellule en raison de l&#39;énorme importance de H + et Ca 2 + dans la biologie. 2,3 Cependant, la plupart des colorants de détection présentent plusieurs limites intrinsèques liés à leur petite molécule comportements tels que: i) des difficultés à targeti subcellulaireng, ii) une faible solubilité dans l&#39;eau et par conséquent une mauvaise biocompatibilité,., et iii) des fuites de cellules et donc un manque de capacité à long imagerie time-lapse 4 En outre, le signal de plusieurs sondes ne peut pas être corrigée en fonction de la dépendance de la concentration de colorant (non Imagerie ratiométrique) et, par conséquent, une mesure absolue dans des cellules ou in vivo n&#39;est pas possible. Nous avons récemment décrit une méthode simple et efficace pour surmonter ces limitations, en fonction de la conjugaison de colorants de détection sur un échafaudage de dendrimère. 5 Les dendrimères sont des polymères hyper-ramifiés monodispersés avec des propriétés très attrayantes pour des applications biologiques. 6 en particulier plusieurs architectures dendritiques ont été mis au point et utilisé pour le médicament 7 et la livraison de gènes. 8 n&#39;est que très récemment plusieurs groupes ont commencé à explorer le potentiel de ces molécules comme échafaudage pour dispositifs de détection. 9,10,11 Nous avons déjàdécrit une voie de synthèse facile vers la fonctionnalisation différente de polyamidoamine (PAMAM) des échafaudages à base d&#39;esters de NHS-activées. conjugués peuvent 12 être obtenus en une seule étape au moyen d&#39;une dialyse en tant que purification. Fait intéressant, cette approche peut facilement être appliquée à une variété d&#39;échafaudages dendritiques ou polymères. 13,14 Pour atteindre les dendrimères d&#39;imagerie ratiométrique étaient doublement marquée avec deux ensembles de colorants: i) un indicateur de pH (par exemple la fluorescéine) et ii) un fragment fluorescent indépendante du pH (par exemple la rhodamine). Cela nous a permis d&#39;effectuer une imagerie précise du pH comme le rapport entre la fluorescéine et la rhodamine est seulement dépendante du pH et de pas plus de la concentration de la sonde. Une autre approche intéressante à ce sujet est représenté par l&#39;utilisation de sondes à base de vie. 15 Comme la durée de vie ne dépend pas de la concentration de la sonde ces mesures n&#39;ont pas besoin d&#39;une correction de quotient. Cependant, lifmesures de etime nécessitent une configuration instrumentale plus complexe et leur résolution temporelle est sous-optimale pour les processus physiologiques rapides, limitant ainsi leurs applications potentielles. Dans le but d&#39;effectuer une imagerie intracellulaire, la sonde doit être délivré à travers la membrane plasmique dans le cytosol. Comme les dendrimères sont pas perméable en raison de leur taille et leur caractère hydrophile, la délivrance intracellulaire pourrait être réalisé par électroporation. Au moyen de cette technique, largement utilisé en biologie pour la transfection, les macromolécules marquées peuvent être exécutés de manière efficace dans des cellules d&#39;effectuer une imagerie de haute qualité. En outre, l&#39;électroporation avec les complications liées à dendrimère endocytose peuvent être évités en tant que les macromolécules sont directement remis au cytoplasme. Intéressant après électroporation différents dendrimères montre localisations distinctes à l&#39;intérieur des cellules, même en l&#39;absence de toute séquence de ciblage spécifique. 5 Ce passife ciblage, seulement en raison des propriétés physico-chimiques du dendrimère, pourrait être exploitée pour obtenir un pH d&#39;imagerie spécifiques à des organites. Imagerie ratiométrique peut être effectuée en utilisant la microscopie confocale. La fluorescéine et la rhodamine, conjugué de manière covalente à l&#39;échafaud dendritique, ont été séparément imagées et un rapport carte pixel par pixel a été créé. Plusieurs procédures de contrôle le pH intracellulaire dans les cellules vivantes au moyen d&#39;ionophores ont été signalés. Ionophores sont de petites molécules hydrophobes capables de transporter des ions à travers la membrane plasmique; ionophores pour ion H +, comme nigéricine, sont disponibles et peuvent être utilisés pour étalonner les capteurs à base de dendrimères 16 Ces mesures ont révélé une réponse linéaire de pH similaire à ce qui est observé. in vitro. Sur la base de l&#39;étalonnage du pH intracellulaire peut être mesurée avec précision. Ces mesures ont démontré que le capteur à base de dendrimères peut être un outil précieux dans l&#39;étude H + homeostasis dans les cellules vivantes et les processus pathologiques qui impliquent pH dysfonctionnements de régulation. Nous avons récemment démontré que les capteurs de pH à base de dendrimères peuvent également être appliqués in vivo, effectuer une imagerie de pH dans le cerveau de souris anesthésiées. 17 En raison de l&#39;environnement complexe des tissus vivants de haute qualité dans la détection in vivo est techniquement difficile. Ici, nous montrons une description détaillée de la procédure expérimentale in vivo pour pH imagerie avec un accent des questions cruciales à traiter pour effectuer une imagerie précise du pH dans le cerveau. Microscopie à deux photons a été utilisé pour deux raisons principales: i) l&#39;utilisation de la lumière infrarouge permet de pallier le manque de pénétration tissulaire de la microscopie confocale norme; ii) la large absorption à deux photons de la fluorescéine et de la rhodamine permettre leur excitation simultanée d&#39;éviter la les complications liées à l&#39;utilisation de deux longueurs d&#39;onde pour l&#39;excitation. des mesures de pH dans le cerveau de la souris étaientmenées à bien; capteurs répondent que difficilement à l&#39;hypoxie induire des changements de pH dans l&#39;espace extracellulaire du cerveau. Ces mesures montrent que les indicateurs à base de dendrimères peuvent être utilisés avec succès pour mettre en évidence les changements physiologiques et pathologiques de pH in vivo dans un modèle animal.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
		 <td>Company</td>
		 <td>Catalogue number</td>
		 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
	 <tr>
	 <td>PAMAM G4</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>412449</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Carboxyfluorescein NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1311</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>TMR NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1171</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>DMSO</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>D8418</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Dyalsis bags</td>
		 <td>Spectrum Labs</td>
		 <td>132117</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>WillCo Dishes</td>
		 <td>WillCo Wells</td>
		 <td>GWSt-3512</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Urethane</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>U2500</td>
		 <td></td>
	 </tr>
 </tbody>
</table>

synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors

Le développement d&#39;indicateurs fluorescents représenté une révolution pour les sciences de la vie. Codées génétiquement et fluorophores synthétiques avec des capacités de détection permis la visualisation d&#39;espèces biologiquement pertinentes avec une résolution spatiale et temporelle. Colorants synthétiques sont particulièrement intéressants grâce à leur grande accordabilité et la vaste gamme d&#39;analytes mesurables. Cependant, ces molécules souffrent de plusieurs limitations liées à petite molécule comportement (faible solubilité, les difficultés de ciblage, souvent sans imagerie quotientométrique autorisé). Dans ce travail, nous introduisons le développement des capteurs à base de dendrimères et de présenter un mode opératoire pour la mesure du pH in vitro, dans des cellules vivantes et in vivo. Nous choisissons dendrimères comme plate-forme idéale pour nos capteurs pour leurs nombreuses propriétés souhaitables (de monodispersité, propriétés accordables, polyvalence) qui en font un échafaudage largement utilisé pour plusieurs dispositifs biomédicaux faites. La conjugaison de pH fluorescentindicateurs à l&#39;échafaud des dendrimères ont conduit à une amélioration de leurs performances de détection. En particulier dendrimères exposition réduite fuite de cellule, un meilleur ciblage intracellulaire et permettre des mesures ratiométriques. Ces nouveaux capteurs ont été utilisés avec succès pour mesurer le pH dans la vie des cellules HeLa et in vivo dans le cerveau de la souris.

La figure 1 montre une représentation schématique de la détection de la conjugaison de colorants différents échafaudages dendritiques. Les indicateurs qui en résultent peuvent être obtenues dans une étape de synthèse simple à partir de produits disponibles dans le commerce. Dendrimères amine portant sont mis à réagir avec des colorants NHS activés dans le DMSO et purifiés par dialyse. Ce mode opératoire général a déjà été utilisé avec succès pour le marquage de plusieurs dendrim?...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

capteurs de fluorescence sont des outils puissants en sciences de la vie. Nous décrivons ici une méthode pour synthétiser et utiliser des capteurs fluorescents à base de dendrimères pour mesurer le pH dans les cellules vivantes et in vivo. L&#39;échafaudage dendritique améliore les propriétés de colorants fluorescents conjugués conduisant à des propriétés de détection améliorées.

Synthèse, Livraison cellulaire et<em&gt; In vivo</em&gt; Utilisation de capteurs de pH à base de dendrimères

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Unit 1

Acid–Base Titration

Acid-base and Solubility Equilibria

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11.6K vues.  Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR.  capteurs de fluorescence sont des outils puissants en sciences de la vie. Nous décrivons ici une méthode pour synthétiser et utiliser des capteurs fluorescents à base de dendrimères pour mesurer le pH dans les cellules vivantes et in vivo. L'échafaudage dendritique améliore les propriétés de colorants fluorescents conjugués conduisant à des propriétés de détection améliorées. 

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Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. The synthesis of hypervalent iodonium alkynyl triflates can be facile, but difficulties stem from their isolation and reactivity. In particular, the necessity to use filtration under inert atmosphere at -45 &deg;C for some HIATs requires special care and equipment. Once isolated, the compounds can be stored and used in reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. 
The evidence for cyanocarbene generation is shown by visible extrusion of dinitrogen as well as the characterization of products that occur from O-H insertion, sulfoxide complexation, and cyclopropanation. A side reaction of the cyanocarbene formation is the generation of a vinylidene-carbene and the conditions to control this process are discussed. There is also potential to form a hypervalent iodonium alkenyl triflate and the means of isolation and control of its generation are provided. The O-H insertion reaction involves using a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and methanol as solvent/substrate. The sulfoxide complexation reaction uses a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and dimethyl sulfoxide as solvent. The cyclopropanations can be performed with or without the use of solvent. The azide source must be tetrabutylammonium azide and the substrate shown is styrene.

Herein is described the synthesis, isolation, and reactions of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) with azides to generate cyanocarbenes. The procedures will involve air-sensitive and cryogen techniques, including cold filtration under an inert atmosphere. Handling and safety of the synthesized compounds will also be discussed.

Synthèse des hypervalent iodonium Alcynyle triflates pour l&#39;application de Génération Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

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Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Évaluation des dopé au bore Diamant électrode qualité et l&#39;application de<em&gt; In Situ</em&gt; Modification du pH local par électrolyse de l&#39;eau

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

Synthèse et exfoliation de discotique Zirconium Phosphates pour obtenir des cristaux liquides colloïdal

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarquage et la quantification des niveaux cellulaires de phosphoinositides par chromatographie liquide haute performance couplée flux scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthèse des bioconjugués protéiques<em&gt; via</em&gt; Cystéine-maléimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

Préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation des agents de contraste à base de dendrimères pour imagerie par résonance magnétique

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical properties, which allow for the absorption of near-infrared (NIR) light and can subsequently convert it into multiplexed emissions that span over a broad range of regions from the UV to the visible to the NIR. This article presents detailed experimental procedures for high-temperature co-precipitation synthesis of core-shell UCNs that incorporate different lanthanide ions into nanocrystals for efficiently converting deep-tissue penetrable NIR excitation (808 nm) into a strong blue emission at 480 nm. By controlling the surface modification with biocompatible polymer (polyacrylic acid, PAA), the as-prepared UCNs acquires great solubility in buffer solutions. The hydrophilic nanocrystals are further functionalized with specific ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for localization on the cell membrane. Upon NIR light (808 nm) irradiation, the upconverted blue emission can effectively activate the light-gated channel protein on the cell membrane and specifically regulate the cation (e.g., Ca2+) influx in the cytoplasm. This protocol provides a feasible methodology for the synthesis of core-shell lanthanide-doped UCNs and subsequent biocompatible surface modification for further cellular applications.

A protocol is presented for the synthesis of core-shell lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) and their cellular applications for channel protein regulation upon near-infrared (NIR) light illumination.

Synthèse de noyau-enveloppe dopé Lanthanide Upconversion nanocristaux pour des Applications cellulaires

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Une méthode de synthèse rapide Au, Pd et Pt aérogels par réduction directe axée sur la Solution

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

Synthèse des élastomères souples Polysiloxane-urée pour Application de lentille intraoculaire

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Synthèse de nanoparticules d’or modifiées Aptamer-PEI-g-PEG chargées de doxorubicine pour l’administration ciblée de médicaments

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...