Cette méthode peut aider à répondre à certaines des questions importantes dans le domaine de la fabrication de procédés bio concernant les aspects de la caractérisation des lignées cellulaires et la médiation et l’optimisation des processus. Les avantages de cette technique sont qu’elle offre un meilleur contrôle dans les flacons de secousse et permet l’automatisation et la performance d’un grand nombre d’études à petite échelle pour la génération rapide de données. Sai Rashmika Velugula et Casey Kohnhorst, chercheurs dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Commencez par immerser un stock vile de trois fois 10 à la septième montrent des cellules par millilitre de milieu de congélation dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Lorsqu’il ne reste qu’un petit morceau de glace, pipet doucement la suspension cellulaire rapidement décongelée à quelques reprises et transférer un millilitre de cellules dans un flacon stérile de secousse ventilée de 125 millilitres contenant 29 millilitres de milieu OptiCHO. Placez le flacon dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 8 % de CO2 en le secouant à 130 RPM.
Subcultation des cellules après 72 heures dans 100 millilitres de milieu frais de 37 degrés Celsius dans un flacon d’essoreuse de 125 millilitres pour une autre incubation de 72 heures à 37 degrés Celsius et 8% de CO2 avec agitation à 70 RPM. Le troisième jour de sous-culture, ajouter un milieu frais préchauffé au flacon de filature pour maintenir les cellules à une viabilité d’au moins 90 % pendant les 24 dernières heures de culture. Le lendemain matin, cliquez sur l’icône de bureau distante et cliquez sur connectez-vous.
Lorsque le bureau distant est connecté, ouvrez le logiciel de compteur cellulaire et installez un nouveau Reagent Pak. Ensuite, videz les déchets Trypan Blue et amorcez le système. Ensuite, réduisez au minimum la connexion à distance et ouvrez le logiciel de micro réacteur bio en utilisant une expérience existante comme modèle pour créer une nouvelle expérience.
Avant de commencer une course, définissez les plaques utilisées pendant la course dans la section imiter du logiciel et placez 12 récipients de culture stériles dans chaque station culturelle. Placez les plaques de pince autoclavées sur les récipients et placez les plaques de remue-pièce sur les plaques de pince en s’assurant que chaque broche est solidement insérée. Ensuite, fixez les plaques de pince avec les vis et les nobs fournis.
Pour démarrer le système, numérisez le code à barres fourni avec chaque récipient de culture. Le système initialisera et vérifiera la présence des navires appropriés. Réglez le contrôle de la température à 37 degrés Celsius et l’agitation à 1000 RPM et allumez le moniteur PH d’oxygène dissous.
Ensuite, exécutez le programme de charge moyenne. Lorsque tout le milieu aura été chargé, 35 microlitres d’antifoam EX-CELL seront ajoutés de la plaque d’antifoam aux récipients de culture. Après 30 minutes commencer à enregistrer l’oxygène dissous et PH dans le milieu de la culture, permettant à l’oxygène dissous d’atteindre un point fixe de 50%Après l’équilibrage de l’oxygène dissous, allumez les ajouts de base de fond pour atteindre un point de terminaison PH de 7,1 pour tous les vaisseaux de culture.
Le lendemain matin, exécutez l’étape ph en pause et transférez tout le contenu du flacon de filature dans un tube conique stérile de 250 millilitres pour centrifugation. Resuspendez la pastille dans un milieu suffisamment frais pour que la densité finale soit une fois de 10 à la sixième cellule CHO par millilitre après avoir ajouté l’inoculum aux vaisseaux de culture et ajoutez les cellules suspendues dans les puits appropriés d’une plaque de puits lidded stérile de 24 puits. Ajouter trois millilitres d’inoculum à chaque puits et placer la plaque d’inoculum sur le bureau désigné à l’intérieur du capot.
Ensuite, laissez les navires de culture s’équilibrer pendant au moins une heure et lancez l’étape du nombre de cinq EX-CELL dans le programme. Pour l’analyse quotidienne des éléments nutritifs et des métabolites le deuxième jour, placez les plaques de support de tube d’échantillon sur leurs plate-formes désignées et chargez les tubes ouverts de microcentrifugeuse dans les supports appropriés. Ensuite, placez les échantillons dans le plateau de l’analyseur, pour effectuer l’analyse des nutriments.
Pour terminer la course, éteignez d’abord le contrôle de température suivi de l’agitation. Arrêtez le contrôle ph d’oxygène dissous et les ajouts de base d’arrière-plan, tous les autres contrôles, et le moniteur du système. Dévissez la pince et remuer les plaques, retirez les récipients de culture et vissez les plaques de séchage dans la station de culture.
Ensuite, exécutez le cycle de séchage de deux heures sur le programme; en cliquant sur l’arrêt dans le logiciel bioréacteur une fois le cycle de séchage terminé. Pour récolter les cellules transférer le fluide de culture cellulaire des récipients du réacteur dans les tubes coniques correspondants pour centrifugation et filtrer les supernatants à travers stériles 0,22 micromètre filtres PVDH. Ensuite, transférez un millilitre de chaque supernatant de culture cellulaire stérile dans des tubes de microcentrifugeuses individuels de 1,5 millilitre pour un stockage négatif de 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse du litre.
Pour mesurer les titres IgG des échantillons, allumez d’abord le système de biocapteur d’aide protéique. Une fois que la lampe s’est réchauffée pendant au moins une heure, laissez les échantillons s’équilibrer à température ambiante et présoakez une pointe d’aide protéique par échantillon dans le milieu des cellules fraîches pendant au moins 30 minutes. Ensuite, réglez la température de la plaque à 26 degrés Celsius.
Chargez les échantillons dans le système, et exécutez l’analyse à l’aide de l’analyse de sensibilité élevée par défaut avec régénération dans le logiciel d’acquisition de données. À l’aide du compteur cellulaire intégré, les densités et viabilités cellulaires viables moyennes peuvent être obtenues quotidiennement pour toutes les conditions de culture. À l’aide de l’analyseur des éléments nutritifs, nous pouvons également obtenir les profils des éléments nutritifs et des sous-produits démontrant la faisabilité de la surveillance de ces attributs dans le système des réacteurs microbio.
En outre, la productivité totale des cultures cellulaires dans les diverses conditions de culture d’intérêt peut être quantifiée à l’aide du système de biocapteur d’aide protéique tel que démontré. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le protocole ne fonctionne que si la programmation est effectuée correctement; Suivant cette procédure, d’autres méthodes comme : chromatographie liquide, spectrométrie de masse et diffusion de la lumière multi-angles peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions concernant les propriétés physiques et chimiques du produit fabriqué.
