Ce travail a été financé par des subventions AI064184 et AI76322 des National Institutes of Health (NIH) et par Grant 61789-MA-MUR de l&#39;Army Research Office de MST de recherche a également été soutenue par Welch Foundation Grant F1155 et NIH accorder R01GM103655 à ACC

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans ce protocole, nous avons détaillé l&#39;isolement des lipides Une espèce de cellules entières de bactéries, et décrit les méthodes d&#39;analyse TLC ou MS pour caractériser chimiquement ce matériel isolé. Spectrométrie de masse tandem est une stratégie puissante pour de novo caractérisation structurale des composés biologiques, et est inestimable pour la caractérisation chimique de la panoplie de molécules lipidiques A observés dans la nature. CID et UVPD existe deux méthodes d&#39;activa...

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface extérieure de presque tous les organismes gram-négatif et est constituée de trois domaines moléculaires: un antigène O polysaccharidiques distale, un oligosaccharide de noyau et le lipide associé à la membrane Un domaine déposé sur le feuillet externe de la membrane bicouche externe 1,2. Le lipide Un domaine se compose de 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) les résidus et un lipide une espèce moléculaire, où le lipide A peut être définie comme la fraction soluble dans le chloroforme de LPS lors de l&#39;hydrolyse légère acide 1, 2. Le lipide A de la molécule de type peut être défini chimiquement comme une épine dorsale qui est diglucosamine hexa-acylé et le bis-phosphorylé, en accord avec les principales espèces de lipide A observées dans l&#39;organisme modèle Escherichia coli (E. coli) 1,2. Neuf gènes exprimés de manière constitutive, conservés tout au long de bactéries gram-négatives, sont responsables de la production du domaine de lipide A (Figure 1) 1,2. La plupart des bactéries ont un jeu supplémentaire de gènes, qui varient en degré de conservation phylogénétique, qui participent à une autre modification chimique du lipide A 3. La déphosphorylation, l&#39;élimination des chaînes acyle, et l&#39;addition de groupements chimiques, tels que des amino-sucres (par exemple aminoarabinose) et / ou de la phosphoéthanolamine sont les activités les plus fréquemment observés (Figure 1). Beaucoup des enzymes responsables de lipides Une modification sont directement activés par des signaux environnementaux, tels que des cations bivalents ou leur expression est régulée par deux systèmes de réponse-régulateur composants 3. Reconnaissance d&#39;espèces lipidiques A par le système immunitaire inné hôte est médiée par le récepteur de type Toll-like facteur de différenciation 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-récepteur 4. Forces hydrophobes entre MD2 et le lipide A des chaînes acyle, ainsi qu&#39;entre TLR4 et les 1 et 4 &#39;groupes phosphates de lipide A promouvoir la forte association de la lèvreid avec TLR4/MD2 4,5. Les modifications qui modifient l&#39;état d&#39;acylation ou la charge négative du lipide A à base de lipide A TLR4/MD2 incidence reconnaissance et en aval de la stimulation de la réponse immunitaire innée activateurs de NF-kB et de médiateurs de l&#39;inflammation tels que TNFa et IL1-β 6,7. Modifications qui masquent la charge négative de lipide A éviter également des peptides antimicrobiens cationiques bactéricides de se lier à Gram négatif surfaces cellulaires 3,8. De nombreuses modifications de lipide A sont émis l&#39;hypothèse d&#39;améliorer la condition physique des bactéries dans des conditions environnementales spécifiques, tels que l&#39;intérieur de l&#39;hôte humain ou dans une niche écologique. Pour cette raison, de nombreuses enzymes de modification sont des cibles intéressantes dans le développement rationnel de composés antimicrobiens. La diversité chimique des structures lipidiques A, par rapport à l&#39;organisme et / ou de l&#39;environnement, et les implications biologiques de ces diverses structures rendre la caractérisation structurale de lipide A un effort important dans de til étudier des bactéries gram-négatives. L&#39;isolement des molécules de lipide A de bactéries entières implique l&#39;extraction de LPS à partir de la surface de la cellule bactérienne, une étape d&#39;hydrolyse pour libérer le lipide A, suivie par une procédure de purification finale 9-11. Le LPS procédure la plus fréquemment citée d&#39;extraction est le chaud phénol procédure d&#39;extraction de l&#39;eau, d&#39;abord introduit par Westphal et Jann 10. Après extraction LPS ensemble est soumis à une hydrolyse douce-acide, qui sépare chimiquement Kdo de la 6&#39;-hydroxy du sucre de glucosamine distale du lipide A (figure 1). De nombreux écueils existent pour la procédure de l&#39;eau chaude-phénol y compris l&#39;utilisation d&#39;un réactif de risque élevé, la nécessité de dégrader les acides co-extraits nucléiques et des protéines, et plusieurs jours sont nécessaires pour compléter le protocole 10. Notre laboratoire a développé l&#39;extraction et l&#39;isolement du lipide A comme premier développé par Caroff et Raetz 12,13. Par rapport aux procédés de l&#39;eau chaude-phénol, le procédé présenté ici est plus rapide et efficace et s&#39;adapte à une large gamme de volumes de culture de 5 ml à plusieurs litres. En outre, contrairement à l&#39;extraction de l&#39;eau chaude-phénol, notre méthode ne sélectionne pas pour rugueuses ou lisses-types de LPS, en fournissant une récupération optimale des espèces lipidiques A. Dans notre protocole, la lyse chimique des cellules bactériennes entières est effectuée en utilisant un mélange de chloroforme, de méthanol et d&#39;eau, où LPS peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation. Une combinaison d&#39;une hydrolyse douce-acide et extractions par solvant (Bligh-Dyer) sont utilisés pour libérer le lipide A de polysaccharide lié de manière covalente. La méthode de Bligh et Dyer a été appliqué d&#39;abord à l&#39;extraction d&#39;espèces lipidiques à partir d&#39;une variété d&#39;animaux et des végétaux tissus 14, modifié ici pour séparer le polysaccharide hydrolysé de lipide A. Dans cette étape de séparation finale, le chloroforme lipides solubles partitionner de manière sélective dans la phase organique inférieure phase. Pour purifier davantage le lipide A, en phase inverse ouChromatographie sur colonne d&#39;échange anionique peut être utilisé 12. Après isolement des espèces lipidiques A partir de cellules entières, un certain nombre de méthodes d&#39;analyse peut être utilisée pour caractériser la structure chimique de la matière d&#39;isolement telles que la RMN, chromatographie sur couche mince, et l&#39;analyse MS. RMN permet élucidation de la structure non-destructive, et fournit des détails structurel lié à des liaisons glycosidiques, l&#39;attribution sans équivoque des positions de la chaîne acyle, et cession de sites de fixation pour le lipide A modifications comme aminoarabinose ou phosphoethanolamine 15-17. analyse par RMN du lipide A n&#39;est pas discutée au sein de notre protocole, mais a été correctement décrit ailleurs 15,16. Pour une analyse rapide TLC basées méthodes sont fréquemment utilisées, mais ne parviennent pas à fournir des informations directes sur la structure de la chimie fine. Protocoles MS sont la méthode la plus fréquemment utilisée pour caractériser les structures lipidiques A 18,19. Matrice associée ionisation par désorption laser (MALDI)-MS est souvent utilisé pour sonder initialement espèce de lipide A intactes. Ions à charge sont générés à partir analyte préparée selon nos procédures d&#39;extraction. Comme l&#39;analyse structurale plus fine est nécessaire, des méthodes basées MS / MS s&#39;avèrent plus informatif que MALDI-MS. Couplé à ionisation électrospray (ESI) de lipides seuls ou à plusieurs charges A ions précurseurs sont encore fragmenté par dissociation induite par collision (CID) ou photodissociation ultraviolet (UVPD), pour générer des ions structurellement information sur les produits 18,20,21. Produits de perte de neutre lipide A ions précurseurs sont également fréquemment générés pendant ESI-MS à fournir une couche supplémentaire d&#39;information structurale. Spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) s&#39;est avérée être une méthode indispensable et polyvalent pour l&#39;élucidation des structures lipidiques A. Au cours de MS / MS, les ions sont activés pour obtenir un schéma de fragmentation de diagnostic qui peut être utilisée pour élucider la structure de l&#39;ion précurseur. Le plus largement available méthode MS / MS est CID. Cette méthode produit des ions fragmentés par collision de l&#39;ion précurseur choisi avec un gaz inerte cible, ce qui entraîne le dépôt d&#39;énergie qui conduit à la dissociation. CID s&#39;est avéré un outil essentiel dans l&#39;attribution des lipides Une structure pour un large éventail d&#39;espèces bactériennes 22-33. Bien que le procédé est CID MS / MS plus universellement mis en oeuvre, il génère un éventail limité d&#39;ions sur les produits. 193 nm UVPD est une alternative et complémentaire méthode MS / MS. Cette méthode utilise un laser pour irradier des ions, et l&#39;absorption de photons se traduit par excitation des ions et la dissociation subséquente. Cette énergie technique MS / MS plus élevée produit un éventail plus diversifié d&#39;ions produits que CID et fournit des modèles de fragmentation plus informatifs ainsi. En particulier, UVPD donne des informations sur les changements subtils dans les espèces lipidiques A sur la base de clivages au glycosidique, amine, acyle et CC obligations indexées 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface cellulaire des bactéries gram-négatives, déposée sur le feuillet externe de la bicouche de la membrane externe. LPS peuvent être subdivisés en trois domaines: le O-polysaccharide distale, un oligosaccharide de noyau, et le lipide A domaine constitué d&#39;un lipide A des espèces moléculaires et des résidus d&#39;acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo). Le lipide A est le seul domaine composant essentiel pour la survie de la cellule bactérienne. Suite à la synthèse, le lipide A est chimiquement modifiée en réponse à des stress environnementaux tels que le pH ou la température, de favoriser la résistance aux composés antibiotiques, et d&#39;échapper à la reconnaissance par les médiateurs de la réponse immunitaire innée hôte. Le protocole suivant détaille l&#39;isolement à petite et grande échelle de lipide A partir de bactéries gram-négatives. Matériau isolé chimiquement est alors caractérisé par chromatographie sur couche mince (TLC) ou la spectrométrie de masse (MS). En plus de laser assistée par matrice de désorption / ionisation à temps de flumière (MALDI-TOF) MS, nous décrivons également les protocoles MS en tandem pour l&#39;analyse des lipides Une espèce moléculaire en utilisant l&#39;ionisation électrospray (ESI) couplée à dissociation induite par collision (CID) et nouvellement employés photodissociation ultraviolet (UVPD) des méthodes. Nos protocoles de MS permettent une détermination sans faille de la structure chimique, primordiale pour la caractérisation de molécules lipidiques A qui contiennent des modifications uniques ou de nouveaux produits chimiques. Nous décrivons également l&#39;étiquetage radio-isotopique, et isolement subséquent, de lipide A partir de cellules bactériennes pour l&#39;analyse par CCM. Par rapport à des protocoles MS, CCM fournit une méthode de caractérisation plus économique et plus rapide, mais ne peut pas être utilisé pour attribuer sans ambiguïté lipide A structures chimiques sans l&#39;utilisation des normes de la structure chimique connue. Au cours des deux dernières décennies isolement et la caractérisation de lipide A a conduit à de nombreuses découvertes passionnantes qui ont amélioré notre compréhension de la physiologie des bactéries, des mécanismes de résistance aux antibiotiques à Gram négatiftance, la réponse immunitaire innée humaine, et ont fourni de nombreuses nouvelles cibles pour le développement de composés antibactériens.

Canonical lipide A de E. coli et Salmonella enterica sérotype Typhimurium est un disaccharide hexa-acylés de la glucosamine avec des groupes de phosphate à 1 - et 4 &#39;positions. Au cours de la croissance dans des milieux riches (par exemple Luria Broth) une partie du lipide A contient un groupe pyrophosphate en position 1 qui donne une espèce de tris-phosphorylée 36 (figure 1). Kdo (3-désoxy-D-manno-octulosonique acide), est fixé à la 6&...

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolement et caractérisation des lipides Un domaine de lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à Gram négatif donne un aperçu des mécanismes de surface cellulaire sur la base de la résistance aux antibiotiques, la survie des bactéries et de remise en forme, et comment chimiquement lipidique diversifié A espèces moléculaires moduler différemment les réponses immunitaires innées de l&#39;hôte.

Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

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31.5K vues.  The University of Texas at Austin.  Isolement et caractérisation des lipides Un domaine de lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à Gram négatif donne un aperçu des mécanismes de surface cellulaire sur la base de la résistance aux antibiotiques, la survie des bactéries et de remise en forme, et comment chimiquement lipidique diversifié A espèces moléculaires moduler différemment les réponses immunitaires innées de l'hôte. 

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

Radicaux libres en biologie chimique: de Comportement chimique au développement de biomarqueurs

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Recherche

Chimie

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Pliant et caractérisation d&#39;un Robot Bio-sensible de l&#39;ADN Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Une approche d&#39;analyse inverse à la caractérisation des Transports chimique dans les peintures

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Cadres de synthèse et la caractérisation de fonctionnalisé métal-organique

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Préparation cellules adhérentes pour fluorescence X-ray Imaging par fixation chimique

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Synthèse et caractérisation de supramoléculaires Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Microfluidique sec-spinning et caractérisation des fibres régénérées fibroïne de soie

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of this compound commences from [Ru(NH3)5Cl]Cl2 in 1 M NH4OH in a closed container, yielding a green solution. Purification is accomplished with cation-exchange chromatography. This compound is characterized and verified to be pure by UV-vis and IR spectroscopy. The mitochondrial calcium uptake inhibitory properties are assessed in permeabilized HeLa cells by fluorescence spectroscopy.

A protocol for the synthesis, purification, and characterization of a ruthenium-based inhibitor of mitochondrial calcium uptake is presented. A procedure to evaluate its efficacy in permeabilized mammalian cells is demonstrated.

Synthèse et évaluation d’un inhibiteur de l’absorption de Calcium mitochondrique axée sur le ruthénium

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.