Joseph W. Ndieyira a été soutenue par le Conseil ingénierie et sciences physiques Research (EPRSC), Centre interdisciplinaire de recherche en nanotechnologie (IRC), la Royal Society (RS) et Biano conseil (BNC). Nous remercions, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment et Gabriel Aeppli pour des discussions utiles.

1. Préparation de Cantilevers <ol><li> Utilisation de Téflon pincettes immerger le numéro sélectionné de puces en porte à faux (chaque cantilever de mesure 500 um de long, 100 m de large et une épaisseur de 0,9 um) dans une solution piranha fraîchement préparée (à un rapport de 1:1 H 2 SO 4 et H 2 O 2) pendant 20 min . </li><li> Après environ 20 min enlever les copeaux en porte à faux à partir de la solution de piranha et les rincer à l&#39;eau déminéralisée et transférer immédiatement dans une solution piranha fraîchement préparé. Répétez l&#39;étape 1.1 ci-dessus si les puces contiennent des taches de saleté Sinon, passez à l&#39;étape suivante. </li><li> Après un nettoyage en profondeur dans l&#39;eau déminéralisée, rincez avec de l&#39;éthanol pur et sécher les copeaux de cantilever sur une plaque chauffante à 75 ° C pour éliminer toute trace d&#39;eau. Inspecter l&#39;aide d&#39;un microscope optique de confirmer leur propreté. </li><li> Transférer les puces en porte-à nettoyer une chambre d&#39;évaporation et de la pompe vers le bas, de ciblage pour atteindre un videpression de 10 -7 mbar. </li><li> Une fois que la pression de vide souhaitée est atteinte, le manteau d&#39;un côté de chaque réseau en porte à faux avec un titane de 2 nm au premier agit comme une couche d&#39;adhérence avant une couche supplémentaire de 20 nm d&#39;épaisseur d&#39;or. Pour confirmer leur épaisseur, utiliser le moniteur à cristaux de quartz placée directement au-dessus de la source cible. </li><li> Laisser puces de capteurs en porte à faux revêtus d&#39;or dans la chambre pendant 1-2 heures pour refroidir sous vide avant l&#39;ouverture. </li><li> Transférez les frites fraîchement évaporé à une cuve de stockage de vide rempli d&#39;argon pour éviter toute forme de contamination. </li></ol> 2. Cantilever Chip fonctionnalisation <ol><li> Tout d&#39;abord, disposer les tubes capillaires microscopiques sur une étape de fonctionnalisation 2 en fonction de la taille de pas en porte à faux de 250 um. </li><li> Puis injecter 2 mM de solutions éthanoliques thiol de molécules cibles à la surface, c&#39;est à dire mucopeptides bactériennes (D-Ala et D-Lac), et une «inert &#39;alcanethiol terminant en triéthylèneglycol (PEG) connu pour résister biomoléculaire adsorption. 16 Chacune des tubes capillaires doit contenir un assortiment de molécules de capture de surface déterminés aléatoirement pour éviter les biais de l&#39;utilisateur. </li><li> Incuber pendant 20 min Suivant les encorbellements dans le microcapillaires rempli de solutions thiol contenant des molécules de capture de surface. Veiller à ce que les solutions de molécules de capture de surface sont confinés sur chaque capteur cantilever individuelle pour éviter ou minimiser les contaminations croisées. Si ce procédé est utilisé correctement, il faut systématiquement modifier les cantilevers revêtus d&#39;or fraîchement préparés en capteurs chimiquement actifs formés en permettant SAM de cibles bactériennes mucopeptide à se former sur les surfaces peintes d&#39;or comme récepteurs. </li></ol> 3. Préparation de la solution <ol><li> Dissoudre 0,1 M sels mono-et di-phosphate de sodium de base dans de l&#39;eau ultra-pure (18,2 MQ · cm résistivité) et mélanger to obtenir une valeur de pH de 7,4. </li><li> Ajouter 0,002% du PS80 aux solutions tampon pour minimiser les effets d&#39;agrégation causées par des interactions non spécifiques de molécules médicamenteuses à la verrerie. </li><li> Diluer la drogue avec des solutions fraîchement tamponné à différentes concentrations désirées qui permettront le calcul de K d. </li><li> Filtrer les solutions médicamenteuses fraîchement préparés en utilisant des filtres de 0,2 um et soniquer pendant 5 min à température ambiante avant de purge à l&#39;argon. </li><li> Répétez la procédure avec la drogue dans le sérum tamponné à l&#39;aide de sérum entier. Doucement vortex pendant 15 minutes avec 5 minutes supplémentaires pour assurer une solubilité complète. </li></ol> 4. Détection de contrainte de surface <ol><li> Charger une puce de détecteur en porte-fonctionnalisé dans une chambre de la cellule d&#39;écoulement de liquide. </li><li> Aligner le point laser sur l&#39;extrémité libre de chaque capteur et de confirmer l&#39;alignement en chauffant jusqu&#39;à la chambre de liquide pour 1 ° C. Les huit or revêtues réseaux de capteurs en porte à faux doivent subir Comprehensivessive flexion en raison de l&#39;effet bimétallique causé par les différences dans les taux d&#39;expansion de silicium et d&#39;or à la baisse. </li><li> Après chauffage pendant environ 10 min, permettent aux cantilevers refroidir pendant encore 10 min. </li><li> Calcul de la variation de courbure au niveau des signaux de flexion maximales entre les capteurs individuels en porte à faux, et si l&#39;écart type relatif des signaux de flexion est ≤ 5% puis accepter l&#39;alignement comme souhaitable sinon répéter le processus. </li><li> Ensuite, mesurer les fréquences de résonance de l&#39;ensemble des huit leviers de calculer leurs constantes élastiques. Si la variation de la constante entre chaque sonde en porte à faux à l&#39;intérieur d&#39;une puce ressort est ≤ 1%, puis accepte la puce comme ayant des propriétés mécaniques compatibles sinon remplacer le capteur de puce en porte à faux. </li><li> Ensuite, utilisez un système fluidique (Modèle Genie Plus) via une vanne à six voies pour réaliser l&#39;échange de liquide à l&#39;intérieur de la cellule d&#39;écoulement tandis que l&#39;acquisition de données doit être réalisé en utilisant un LabView automatisé afinftware. </li><li> Pour surveiller le cantilever flexion des données, utiliser les protocoles de mesure suivantes: i) soit injecter la solution tampon ou du sérum sans médicament pour la mesure de contrôle durable pour 5-30 min à établir une base de référence; ii) injecter la solution de drogue pendant 30-60 min; iii) injecter du HCl 10 mM lavage pour 10 à 60 min à dissocier complexe médicamenteux lié; iv) enfin injecter une étape de lavage supplémentaire en utilisant une solution tampon pour un autre 5-30 min pour régénérer les peptides de surface et pour restaurer le signal de référence. Toujours s&#39;assurer que tous les signaux sont acquises sous débit constant de liquide de 30 à 180 pl / min et à température fixe de 25 ° C dans une enceinte à température contrôlée. </li><li> Les signaux de flexion absolues de tous les huit leviers doivent être surveillés en utilisant le temps de série multiplexée méthode du faisceau optique avec un seul détecteur sensible à la position. </li><li> Pour analyser les signaux de flexion de chaque concentration de médicament, les flexions différentielles qui en résultent sont convertis en un différentiel stress entre les faces supérieure et inférieure de la poutre à l&#39;aide de l&#39;équation de cailloux. </li></ol>

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	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li><li>Fritz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+biomolecular+recognition+into+nanomechanics.">Translating biomolecular recognition into nanomechanics.</a> Science. 288, 316-318 (2000).</li><li>Dwyer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+bacterial+cell+death+exhibits+physiological+and+biochemical+hallmarks+of+apoptosis.">Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis.</a> Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistranslation+of+membrane+proteins+and+two-component+system+activation+trigger+antibiotic-mediated+cell+death.">Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death.</a> Cell. 135, 679-690 (2008).</li><li>Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycopeptide+and+lipoglycopeptide+antibiotics.">Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics.</a> Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).</li><li>Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+origins+of+a+cooperative+binding+energy+of+dimerization.">An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization.</a> Science. 280, 711-714 (1998).</li><li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA.">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li><li>Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crisis+in+antibiotic+resistance.">The crisis in antibiotic resistance.</a> Science. 257, 1064-1073 (1992).</li><li>Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+confer+antibacterial+drug+resistance.">Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance.</a> Nature. 406, 775-781 (2000).</li><li>Xu, J., Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+self-assembled+long-chain+alkanethiol+monolayers+on+gold.">The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold.</a> J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).</li><li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+for+biosensors.">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43-50 (1997).</li><li>Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cell-wall+analogues+of+vancomycin-resistant+enterococci+using+solid+phase+peptide+synthesis.">Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis.</a> Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+organic+monolayers+-+model+systems+for+studying+adsorption+of+proteins+at+surfaces.">Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces.</a> Science. 252, 1164-1167 (1991).</li><li>Rotschafer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Vancomycin:+Observations+in+28+Patients+and+Dosage+Recommendations.">Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).</li><li>Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination.">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cantilever+array-based+artificial+nose.">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li><li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighing+of+biomolecules,+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid.">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li><li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate:+A+surface+plasmon+resonance+study.">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêts est déclaré

Les moléculaires sous-tend la reconnaissance paradigme de larges pans de la biologie et de la médecine. En pharmacologie, par exemple, le but est d&#39;interférer avec une voie pathologique en ciblant un acteur clé d&#39;un processus biochimique comme transglycoslyation ou transpeptidation qui catalyse la réticulation des peptides de la paroi cellulaire bactérienne. La conception de médicaments se réduit donc à la définition d&#39;une molécule apte à cibler un site d&#39;amarrage bactérienne spécifique pour induire un ajustement parfait. Un exemple classique émuler le succès de cette approche est la vancomycine (Van), qui vise la paroi cellulaire peptidoglycane, une caractéristique structurelle conservé d&#39;une bactérie. Dans une bactérie Gram-positive naissante, la matrice se compose de peptides peptidoglycane de terminaison dans la séquence Lysine-D-alanine-D-alanine, attaché par l&#39;intermédiaire d&#39;un C55 lipidiques 8-10 de liaison appelé ici D-Ala. Ces peptides exposés sur les précurseurs du peptidoglycane sont fondamentales pour laprotection mécanique des cellules bactériennes contre les forces environnementales difficiles, et surtout, on ne trouve pas dans les cellules humaines, faisant d&#39;eux des cibles idéales pour les antibiotiques. Van lie spécifiquement à l&#39;extrémité C-terminale des peptides de la paroi cellulaire bactérienne formant une assez forte Van-peptide complexe comme le montre la figure 1. Cette interaction entre Van et les peptides blocs exposés les actions de transpeptidases et transglycosylases, qui catalysent la réticulation des parois cellulaires 1, ce qui les empêche de réticulation et donc affaiblit nanomechanically la cellule bactérienne conduisant à sa mort par rupture 1,6, 7. L&#39;émergence de résistants à la vancomycine Enterococcus (ERV) est un problème croissant de santé 11 et parce que la résistance bactérienne chez les entérocoques se pose en raison du changement subtil d&#39;un amide linkage à une liaison ester 8, ce changement structurel d&#39;une simplicité trompeuse à la surface de la bactérie supprime une seule liaison hydrogène à partir du site d&#39;accueil de Van avec modification ultérieure de la poche de liaison. Il est important de ce processus modifie le pentapeptide terminale alanine présent dans vancomycine sensibles Enterococcus (VSE) à un Lysine-D-alanine-D-lactate 10,12, ici appelé D-Lac, ce qui donne une réduction significative de Van-D-Lac affinité de liaison par trois ordres de grandeur rendu Van thérapeutique inefficace contre les infections à entérocoques 1, la croissance alarmante de bactéries résistantes aux antibiotiques est donc de conduire le développement d&#39;approches novatrices afin d&#39;accélérer et de restaurer l&#39;activité antibactérienne des agents antibactériens ou la découverte de médicaments plus puissants contre les bactéries multirésistantes les infections. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Nos expériences utilisant des cantilevers autoportants est inspiré par des systèmes tels que les cellules qui exploitent l&#39;énergie chimique en mouvement. La capacité des capteurs en porte à faux de traduire l&#39;énergie chimique en mouvement mécanique rend sondes uniques avec des avantages considérables pour surveiller les perturbations mécaniques de cibles de la paroi cellulaire bactérienne en temps réel. Les capteurs de porte à faux exigent des «balises» pas journaliste et biomolécules sont détectées rapidement dans une réaction en une seule étape. Ils peuvent dépister plusieurs médicaments en parallèle dans des environnements physiologiques tels que des solutions tamponnées et le sérum ensemble. En outre, la technologie de cantilever utilise en référencement situ pour des mesures différentielles leur permettant de détecter spécifiquement les interactions médicament-cible et, en vertu de leur fabrication par des voies de traitement de semi-conducteurs standards, ils se prêtent à la production de masse et parallélisation pour le criblage à haut débit de milliers de médicaments par heure. En particument ses multiples réseaux de capteurs en porte à faux sont des outils utiles pour l&#39;étude de la résistance aux antibiotiques à la vancomycine - parce que la résistance à la vancomycine est essentiellement un problème mécanique 1,6,7. Les réactions entre un modèle cible bactérienne de la paroi cellulaire et Van en solution peuvent être détectés en surveillant les variations de tension induites cliniquement significative de l&#39;interaction de liaison médicament-cibles. La contrainte générée par des réactions de surface qui se manifeste par un signal de flexion en porte à faux est analysée optiquement par des détecteurs d&#39;éclairage avec un faisceau laser. Par ailleurs, en adaptant le revêtement réceptif de molécules cibles de surface bactériennes sur le dessus du capteur cantilever, proches d&#39;un nombre illimité d&#39;analytes (Van), les interactions biochimiques spécifiques et la biomécanique du modèle bactérien matrice de la paroi cellulaire est suivie en temps réel. Mis à part le cas de la reconnaissance moléculaire, il ya plusieurs facteurs qui peuvent causer des capteurs en porte à faux à deflect, qui comprennent - des variations de température, de liaison non spécifiques ou des changements d&#39;indice de réfraction de la solution. Pour tenir compte des signaux non spécifiques, à des mesures différentielles situ sont effectuées lorsque la courbure de fois la mesure et consoles de référence sont surveillés en permanence pour analyser les interactions spécifiques. En outre, la sensibilité de détection des capteurs de porte à faux qui dépendent des chimies de surface et de la géométrie peut être améliorée en réglant la densité de surface p (où p est défini comme le rapport de la surface occupée par les molécules de capture pour la totalité de la surface supérieure de la porte à faux couvert par la population totale de molécules telles que déterminées par rayons X spectroscopie photoélectronique (XPS) 1. Voici ce protocole de détails comment la vancomycine ou tout autre antibiotique liaison à bactériennes mur analogues de précurseurs cellulaires (mucopeptides) à des concentrations cliniquement pertinentes dans une solution tamponnéesérum sanguin e peut être détectée à l&#39;aide de la technologie de cantilever sans étiquette. Surfaces d&#39;or frais sont utilisés parce monocouches auto-assemblées (SAM) ont tendance à former facilement des couches stables sur l&#39;or propre 13,14. SAM est typiquement constitué de molécules courtes avec une fraction thiol lié de manière covalente à la surface de l&#39;or, tandis que l&#39;unité de capture désiré sur l&#39;autre extrémité est autorisé à interagir librement avec les cibles de l&#39;analyte en solution. Thiols forment un système souple d&#39;autant plus que de nombreux composés thiols avec différents groupes terminaux chimiques sont disponibles dans le commerce ou sont facilement synthétisés en laboratoire. Cependant, des précautions doivent être prises pour s&#39;assurer que les molécules avec un groupement thiol doivent avoir des groupes terminaux appropriés, par exemple dans une protéine ou conjugaison peptide, le groupe amino doit faire face vers l&#39;intérieur pour la réaction avec le groupe carboxylique du groupement thiol attaché sur le surface pour se produire. Ici, les thiols sont directement conjugué par des composés mimétiques tripeptidiques d&#39;origine bactérienne lipide II de la bparoi cellulaire acterial objectifs synthétisé par la méthode en phase solide à l&#39;aide disponible dans le commerce préchargé Wang-D-Ala et résines Wang-D-Lac et le niveau protecteur Fmoc groupe chimie 15. Bien que cette description se concentre à la vancomycine, clairement il peut être étendu à d&#39;autres antibiotiques et bien d&#39;autres études sont invités par des chercheurs de différents domaines notamment en biochimie, la pharmacologie et la science des matériaux à adopter facilement ce protocole pour leurs propres expériences.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

La sonde en porte à faux, qui agit comme un transducteur de réactions entre le modèle bactérienne matrice paroi cellulaire immobilisé sur sa surface et des antibiotiques en solution, a montré un potentiel considérable dans les applications biochimiques de détection avec la sensibilité et la spécificité sans précédent 5.1. Les interactions médicament-cible génèrent des contraintes de surface, ce qui provoque le cantilever à plier, et le signal peut être analysé optiquement quand il est éclairé par un laser. La variation de la tension de surface mesurée avec une précision nanométrique permet de perturbations de la biomécanique de la paroi cellulaire bactérienne modèle Cibles à être suivis en temps réel. Malgré offrant des avantages considérables, de multiples réseaux de capteurs en porte à faux n&#39;ont jamais été utilisées pour quantifier les interactions de liaison médicament-cible. Ici, nous rapportons sur l&#39;utilisation de silicium plusieurs tableaux en porte à faux avec enduit alcanethiol monocouches auto-assemblées mimant bactérienne matrice de la paroi cellulaire Stu quantitativementinteractions de liaison dy antibiotiques. Pour comprendre l&#39;impact de la vancomycine sur la mécanique des structures de la paroi cellulaire bactérienne 1,6,7. Nous avons développé un nouveau modèle 1, qui propose que cantilever flexion peut être décrit par deux facteurs indépendants: i) soit un facteur chimique, qui est donnée par un Langmuir classique isotherme d&#39;adsorption, à partir duquel nous calculons l&#39;équilibre thermodynamique constante de dissociation (Kd) et ii) un facteur géométrique, essentiellement une mesure de la façon dont les récepteurs de peptides bactériens sont réparties sur la surface du cantilever. La répartition de surface des récepteurs peptidiques (p) est utilisée pour étudier la dépendance de la géométrie et de la charge du ligand. Il est démontré qu&#39;une valeur seuil de p ~ 10% est essentielle pour les applications de détection. En dessous de laquelle il n&#39;y a pas de signal détectable flexion tandis qu&#39;au-dessus de cette valeur, le signal de fléchissement augmente presque linéairement, révélant que le stress est un produit d&#39;un produit chimique locale contraignant facteur et un facteur géométrique combiné par la connectivité mécanique des régions réagi et propose un nouveau paradigme pour la conception d&#39;agents puissants pour combattre les infections superbactérie.

Le changement de contrainte mesurée en utilisant une précision nanométrique avec une sensibilité sans précédent pour une seule suppression de liaisons H, est exploité pour suivre les perturbations du modèle bactériennes biomécanique de la paroi cellulaire en temps réel (figures 2a-d). La limite de sensibilité de la détection de la drogue pour Van a été étudiée par dilution en série de ses concentrations dans les étapes à partir de 1000 um à ≤ 10 nm, révélant 10 nm (~ 15 ng / ml) que la concentration détectable la plus basse donnant lieu à une moyenne de ~ -9 ± 2 nm que les signaux différentiels de flexion (figure 2C). La capacité de détecter des antibiotiques dans un environnement physiologique a été étudiée dans le sérum à une concentration cliniquement pertinente de 3-27 uM 17. Lors de l&#39;injection de 7 um Van dans le sérum (90% de sérum de veau foetal, plus 10% tampon phosphate de sodium pH 7,4) à travers tous les leviers dans des conditions identiques, le signal différentiel pourDAla dans le sérum était 105 ± 4 nm tandis que pour les consoles enduits DLAC, aucune flexion a été observée (Figure 3). Les signaux de flexion considérables observées pour DAla couché (vancomycine sensible) cantilevers sont causés par les interactions de liaison médicament-cible forts. Toutefois, pour DLAC couché (résistant à la vancomycine) cantilevers, la présence de l&#39;état fondamental répulsion de l&#39;oxygène seule paire et la réduction liaison NH dans la poche de liaison vancomycine 10,12 contribue à l&#39;affaiblissement des interactions de liaison médicament-cible qui se traduit par moins ou pas cantilever flexion, en particulier pour des concentrations inférieures à la vancomycine (Figure 3). Cependant, pour une forte concentration de vancomycine, nous observons des signaux de flexion mesurables pour DLAC. Par ailleurs, notre modèle expérimental est important dans le référencement situ où tous cantilevers enduits à la fois DAla et DLAC sont simultanément exposés à cette même substance en temps réel. Pour comprendre le rôle précis de la chimie et de la géométrie, nous avons conçu un modèle 1 décrivant la corrélation entre les interactions solvant et de la mécanique de surface. Cela produit la contrainte de surface: <img alt="Équation 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> pour p&gt; pc et zéro autrement (1) Le premier terme de l&#39;équation (1) est l&#39;isotherme d&#39;adsorption de Langmuir, ce qui représente événements de liaison médicament-cible et le second terme est la forme de la loi de puissance décrivant les conséquences mécaniques de grande envergure de la formation du réseau stressé. La constante correspond à une contrainte de surface maximale lorsque tous les sites de liaison accessibles sont occupés et Kd est la surface dissociation à l&#39;équilibre contreTant sur le cantilever. L&#39;analyse comme le montre la figure 4 est le résultat de l&#39;ajustement global de l&#39;équation (1) superpose les signaux de stress différentielles mesurées révèlent, une ~ 29,7 ± 1,0 ou 14,1 ± 3,0 mN / m et K d ~ 1,0 ± 0,3 et 800 ± 310 iM pour D-Ala ou peptides DLAC, où A correspond à une mesure de contrainte de surface lorsque tous les sites de liaison accessibles sont occupés. La sensibilité accrue du cantilever a été réglé en faisant varier systématiquement les densités peptide p tout en surveillant les données de contrainte en fonction de p alors que les concentrations d&#39;antibiotiques fixé à 10, 100 et 250 pM, respectivement (figure 5). Le processus a été répété avec la contrainte en fonction de Van concentrations tandis que les densités de peptides fixés à la p ~ 100%. &lt;img alt = &quot;Figure 1&quot; fo: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1. détection de luge d&#39;interactions de liaison de surface antibiotiques. a) Représentation schématique d&#39;un réseau de capteurs en porte à faux et le mode par lequel les interactions médicament-cibles sont détectées nanomechanically. b) une interaction de liaison chimique entre une molécule de médicament (Van) et l&#39;analogue de mucopeptide bactérienne (D-Ala ou D-Lac). c) Le mécanisme par lequel une des bactéries sensibles à la vancomycine mutés (VSE) acquiert une résistance à la vancomycine par la suppression d&#39;une liaison hydrogène unique dans la poche de liaison. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Figure 2. Suivi des perturbations du modèle bactériennes biomécanique de la paroi cellulaire en temps réel. a) des signaux de flexion absolues de D-Ala, D-Lac et PEG cantilevers enrobés dans du tampon phosphate et de 250 pM vancomycine. Les signaux de référence de PEG différentielles sont indiqués dans les lignes noires. B) des signaux de flexion différentielle de D-Ala et D-Lac cantilevers enrobés dans du tampon phosphate et 250 vancomycine pM. C) Le cantilever flexion différentielle d&#39;un signal dépendant de la dose en fonction du temps en présence de concentrations de vancomycine dans l&#39;ordre de 10 nM (ligne jaune), 100 nm (ligne rouge) et 1000 nM (ligne rouge foncé) respectivement. d) les signaux de déviation du cantilever différentiels pour les trois D-Ala capteurs cantilever enrobées sous forme de fonction du temps, en présence de 10vancomycine nM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Figure 3. Suivi des perturbations du modèle bactériennes biomécanique de la paroi cellulaire en temps réel pour un D-Ala et D-Lac cantilevers enduits en présence de 7 pm vancomycine dans le sérum de veau foetal. <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Figure 4. Étudier les nanomechanics d&#39;interactions médicament-cible. Graphique montrant la réponse au stress de surface différentielle mesurée pour D-Ala (cercles noirs) et D-Lac (cercles rouges) Les cantilevers enduits en fonction de la vancomycinela concentration en solution [Van]. Les données sont décrites par l&#39;équation (1) (traits pleins). 1 <img alt="Figure 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;optimisation de la sensibilité de détection nanomécanique d&#39;interactions récepteur-ligand par instruction la dépendance de la charge du récepteur et de la géométrie par des monocouches mixtes. Différentielles surface réactions de stress mesurées des capteurs de porte à faux, en fonction de D-Ala couverture de surface, p, en présence de concentrations de vancomycine fixes en solution à 10 uM (ligne noire), 100 um (ligne rouge) et 250 um (ligne verte).

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Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

La résistance acquise aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique et est actuellement classé par l&#39;OMS comme l&#39;une des plus grandes menaces à la vie humaine. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la technologie de cantilever pour quantifier la résistance antibactérienne, essentielle à la découverte de nouveaux et puissants agents contre les bactéries multirésistantes.

Nanomechanics des interactions médicaments-cibles et la détection de la résistance aux antibactériens

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K vues.  University College London. La résistance acquise aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique et est actuellement classé par l'OMS comme l'une des plus grandes menaces à la vie humaine. Nous décrivons ici l'utilisation de la technologie de cantilever pour quantifier la résistance antibactérienne, essentielle à la découverte de nouveaux et puissants agents contre les bactéries multirésistantes.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Recherche

Immunologie et infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplifier et quantifier l&#39;ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

Déplication d'antibiotiques à l'aide de la plate-forme de résistance aux antibiotiques

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.