1. Étapes de préparation
<ol><li>Préparer le bouillon Muller-Hinton (MHB) en ajoutant 25 g de bouillon MH à 1 L d’eau distillée et mélanger. Autoclave à 121 °C pendant 2,5 h. Ensuite, rangez le support autoclavé à température ambiante ou au réfrigérateur.</li>
	<li>Sous-culture des bactéries en question(E. coli ESBL) sur le milieu de la gélose en utilisant la méthode de stries à quatre quadrants et incuber pendant la nuit à 37 °C.<ol>
<li>À l’aide d’une boucle stérile, prenez une colonie et étalez-la dans la première moitié de la plaque de gélose MacConkey en faisant des stries parallèles étroites.</li>
		<li>À l’aide de la boucle, étalez les bactéries dans le deuxième quadrant en la striant à partir du premier quadrant.</li>
		<li>À partir du deuxième quadrant, étendez les stries dans le troisième quadrant à l’aide de stries parallèles étroites.</li>
		<li>Étalez les bactéries au centre du quatrième quadrant en les striant du troisième quadrant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation du groupe spécial
<ol><li>Placez quatre plaques de 96 puits l’une à côté de l’autre pour former un carré. À l’aide d’une bande, collez leur fond ensemble.</li>
	<li>Répétez cette étape pour obtenir quatre panneaux contenant chacun 4 plaques et nommez-les A1, A2, A3 et A4.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de bouillon MH aux puits entre la colonne 2 et la colonne 11 dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de bouillon MH au puits H12 servant de puits témoin négatif dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux.</li>
	<li>Ajouter 150 μL de bouillon MH aux puits A1 et H1 servant de puits témoins positifs dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux.</li>
</ol>3. Médicament 1, Céfotaxime, dilution en série
<ol><li>Dans un tube conique, ajouter 15 mL de dH2O stérile.<ol>
<li>Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 15 mL) /C1. REMARQUE: Dans notre cas, la solution mère de céfotaxime est de 105 μg / mL et C2 est de 256 μg / mL; ainsi,V1 = 38,4 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez le volume calculé des 15 mL de dH2O stérile, puis ajoutez le médicament.</li>
	<li>Pipetter 50 μL de la solution médicamenteuse préparée dans chaque puits des colonnes 11 et 12 sauf H12.</li>
	<li>Commencer la dilution en série en enlevant 50 μL de la colonne 11 et en la plaçant dans les puits correspondants de la colonne 10, puis de 10 jusqu’à atteindre la colonne 2 où les 50 μL prélevés dans la colonne 2 seront éliminés.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.4 et 3.5 pour l’ensemble des 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux.</li>
</ol>4. Médicament 2, Amkacine, dilution en série
<ol><li>Dans un tube conique, ajouter 10 mL de dH2O stérile.</li>
	<li>Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 10 mL) /C1. REMARQUE : Dans notre cas, la solution mère d’amikacine est de 103 μg/mL etC2 est de 64 μg/mL; ainsi,V1 = 64 μL.</li>
	<li>Retirez le volume calculé des 10 mL de dH2O stérile, puis ajoutez le médicament.</li>
	<li>Prenez huit plaques distinctes de 96 puits.</li>
	<li>À chaque plaque, ajouter 100 μL de MHB aux puits entre les rangées G et B.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de la solution de médicament 2 préalablement préparée dans les puits de la rangée G.</li>
	<li>Diluer en série de la rangée G à la rangée B en prenant 100 μL de chaque puits et finalement jeter les 100 μL des puits de la rangée B.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.5, 4.6 et 4.7 pour préparer huit assiettes.</li>
</ol>5. Transfert de la drogue 2 aux quatre panels
<ol><li>Pipetter 50 μL de médicament 2 des puits entre les rangées G et B dans les puits correspondants dans chaque plaque des quatre panneaux. Une plaque préparée de 96 puits contient 100 μL de médicament 2, ce qui est suffisant pour deux plaques dans un panneau.</li>
</ol>6. Médicament 3, Lévofloxacine, addition
<ol><li>À quatre tubes coniques différents, ajouter 14 mL de dH2O stérile.</li>
	<li>Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 14 mL) /C1. REMARQUE: Dans notre cas, la lévofloxacine est préparée en quatre concentrations différentes à partir d’une solution mère de 5 x 103 μg /mL. C1 = 2 μg/mL, V1 = 5,6 μL C2 = 4 μg/mL, V1 = 11,2 μL C3 = 8 μg/mL, V1 = 22,4 μL C4 = 16 μg/mL, V1 = 44,8 μL</li>
	<li>Retirez le volume calculé des 14 mL de dH2O stériles de chaque tube, puis ajoutez le médicament.</li>
	<li>Après avoir préparé les concentrations requises du troisième médicament, prendre 50 μL et l’ajouter aux puits correspondants entre les rangées B et G et les colonnes 2 et 12 dans la plaque correspondante dans chaque panneau où C1 correspond aux quatre plaques P1 dans les quatre panneaux, C2 correspond aux quatre plaques P2 dans les quatre panneaux , C3 correspond aux quatre plaques P3 dans les quatre panneaux, et C4 correspond aux quatre plaques P4 dans les quatre panneaux.</li>
</ol>7. Médicament 4, Triméthoprime-sulfaméthoxazole, addition
<ol><li>A un tube conique, ajouter 14 mL de dH2O stérile.</li>
	<li>Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 14 mL) /C1. NOTA : Dans notre cas, le triméthoprime-sulfaméthoxazole est préparé à quatre concentrations différentes à partir d’une solution mère de 48 x 103 μg/mL. C1 = 512 μg/mL, V1 = 149,33 μL C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298,66 μL C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597,33 μL C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194,66 μL</li>
	<li>Retirez le volume calculé des 14 mL de dH2O stériles de chaque tube, puis ajoutez le médicament.</li>
	<li>Après avoir préparé les concentrations requises du quatrième médicament, prendre 50 μL et l’ajouter aux puits correspondants entre les rangées B et G et les colonnes 2 et 12 dans les quatre plaques du panneau correspondant où C1 correspond au panneau 1, C2 correspond au panneau 2, C3 correspond au panneau 3, et C4 correspond au panneau 4.</li>
</ol>8. Préparation et ajout de l’inoculum bactérien E. coli ESBL
<ol><li>À l’aide d’une boucle stérile, transférer une colonie de l’isolat bactérien E. coli ESBL précédemment cultivé sur une plaque dans 2 mL de MHB et de vortex stériles.</li>
	<li>Vérifiez la turbidité où il devrait être de 0,5 McFarland à l’aide d’un densitomètre.</li>
	<li>Ajouter 80 mL de bouillon MH stérile à une tasse d’urine stérile.</li>
	<li>Ajouter l’inoculum bactérien de l’inoculum 0,5 McFarland à la tasse d’urine suivantC1V1 =C2V2, oùV1 = (106 x 80 mL) / 108 = 800 μL.</li>
	<li>Pipetter 50 μL de la solution d’inoculum 106 UFC/mL dans chaque puits sauf H12, qui est le puits témoin de stérilité.</li>
	<li>Incuber les panneaux à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Après incubation, ajouter 50 μL d’iodotétrazolium pour enregistrer la croissance dans les puits.</li>
</ol>9. Protocole pour le modèle FIC (dossier supplémentaire)
<ol><li>Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 1 (céfotaxime) dans la cellule jaune du panneau A.</li>
	<li>Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 2 (Amikacine) dans la cellule jaune du panneau B.</li>
	<li>Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 3 (Lévofloxacine) dans la cellule jaune du panneau C.</li>
	<li>Inscrire la concentration la plus élevée de médicament 4 (triméthoprime-sulfaméthoxazole) dans le panneau D.</li>
	<li>Tracez la ligne rouge (interface Croissance/pas de croissance) en mettant en évidence les puits ayant une croissance en rouge.</li>
	<li>Écrivez le MIC du médicament 1 dans le tableau du médicament 1 (ATB1).</li>
	<li>Écrivez le MIC du médicament 2 dans le tableau du médicament 2 (ATB2).</li>
	<li>Écrivez le MIC du médicament 3 dans le tableau du médicament 3 (ATB3).</li>
	<li>Écrivez le MIC de la drogue 4 dans le tableau de la drogue 4 (ATB4).</li>
	<li>Pour calculer FIC pour ATB1<ol>
<li>Déterminez les puits sur l’interface Croissance/Pas de croissance.</li>
		<li>Dans le tableau ATB1, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau A vers le premier puits sélectionné.</li>
		<li>Répétez l’étape 9.10.2 pour chaque puits sélectionné où le puits 1 correspond à FIC1, le puits 2 correspond à FIC2, et ainsi de suite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour calculer le FIC pour ATB2<ol>
<li>Dans le tableau ATB2, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau B vers le premier puits présélectionn.</li>
		<li>Répétez l’étape 9.11.1 pour chaque puits présélectionn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour calculer le FIC pour ATB3<ol>
<li>Dans le tableau ATB3, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau C vers le premier puits présélectionn.</li>
		<li>Répétez l’étape 9.12.1 pour chaque puits présélectioné.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour calculer le FIC pour ATB4<ol>
<li>Dans le tableau ATB4, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau D vers le premier puits présélectionn.</li>
		<li>Répétez l’étape 9.13.1 pour chaque puits présélectionn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dans le tableau intitulé ATB1+2+3+4, additionnez automatiquement le FIC1 de chaque ATB. Il en ira de même pour les autres FIC (FIC2, FIC3, etc.).<ol>
<li>Dans la cellule contenant FIC et surlignée en jaune, double-cliquez dessus et sélectionnez les ΣFICs additionnés dans le tableau ATB1+2+3+4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez ces étapes pour chacune des neuf feuilles représentant les neuf plaques. REMARQUE: Dans la feuille FIC all, le tableau montrera le FIC final additionné avec l’interprétation de la valeur obtenue.</li>
</ol>10. Détermination de la CMI à l’aide du test de microdilution pour les quatre médicaments
<ol><li>Étiquetez quatre rangées différentes avec l’abréviation de chaque médicament testé. Par exemple, CTX pour le céfotaxime, AMK pour l’amikacine, LEVO pour la lévofloxacine et SXT pour le triméthoprime-sulfaméthoxazole.</li>
	<li>Pipetter 200 μL de bouillon Muller Hinton stérile dans le puits numéro 1 et le puits numéro 12 dans chaque rangée utilisée. Le puits numéro 12 servira de puits de contrôle négatif.</li>
	<li>Pipette 100 μL de bouillon Muller Hinton stérile vers les puits 2 à 11 dans chaque rangée utilisée.</li>
	<li>Calculer le volume de chaque médicament à ajouter à l’aide de la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 4 xV2)/C1. V2 est le volume final dans les puits qui est de 200 μL,C1 est la concentration de la solution mère, etC2 est la concentration initiale que nous devons avoir dans le premier puits. REMARQUE: Ici, nous utilisons ce qui suit: Céfotaxime :C1 = 105 μg/mL, où l’on dilue à 104 μg/mL,C2 = 256 μg/mL ; ainsi, V1 = 20,48 μL Amikacine : C1 = 103 μg/mL,C2 = 64 μg/mL; ainsi, V1 = 51,2 μL Lévofloxacine :C1 = 5 x 103 μg/mL, où l’on dilue à 5 x 102 μg/mL,C2 = 16 μg/mL ; ainsi, V1 = 25,6 μL Triméthoprime-sulfaméthoxazole : C1 = 48 x 103 μg/mL,C2 = 4096 μg/mL; ainsi, V1 = 68,26 μL</li>
	<li>Pipetter le volume requis pour chaque médicament dans le premier puits de la rangée correspondante après avoir retiré le même volume du bouillon de 200 μL pour obtenir un volume total de 200 μL après l’ajout du médicament.</li>
	<li>Diluer en série en enlevant 100 μL du puits 1 au puits 2 et ainsi de suite jusqu’à atteindre le puits 10 où les 100 μL retirés du puits 10 seront jetés. Notez que le puits 11 sert de puits de contrôle positif.</li>
	<li>Pipette 100 μL de 106 inoculum bactérien préparé dans chaque puits de chaque rangée utilisée, à l’exception du puits numéro 12 servant de témoin négatif.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant la nuit.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. 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A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

La méthode quadruple damier ressemble au damier et au damier tridimensionnel dans son protocole. Cependant, certaines étapes cruciales doivent être prises en considération pour éviter les erreurs au cours de l’expérience.
Assurez-vous de tester le MIC de chaque médicament contre l’isolat testé avant de commencer le protocole pour savoir quelles sont les concentrations qui sont nécessaires pour commencer les dilutions avec pour le médicament 1 et le médicament 2 qui doivent être...

Avec l’augmentation de la résistance due à la surutilisation et à la mauvaise utilisation des antibiotiques1,2, la nécessité de développer de nouveaux médicaments et agents pour traiter les infections bactériennes est devenue cruciale. De nouvelles approches telles que le développement de nouveaux médicaments sont très importantes pour surmonter la crise de résistance. Cependant, l’industrie pharmaceutique n’est pas intéressée par le développement de nouveaux agents antimicrobiens. De plus, si de nouveaux médicaments sont développés, les bactéries continueront d’évoluer et de développer une résistance contre ces nouveaux médicaments3,4. Ainsi, le problème de la résistance ne sera pas résolu, ce qui rend la nécessité d’une autre approche indispensable qui devrait être considérée et étudiée pour surmonter la résistance bactérienne.
La combinaison de médicaments est un concept très important pour le traitement des infections bactériennes, principalement celles causées par des agents pathogènes multirésistants5,6. Il diminue le cours du traitement, diminue la dose donnée; ainsi, diminuer la toxicité du médicament donné, aide à diminuer le taux de développement de la résistance et, d’une certaine manière, sensibilise les bactéries aux médicaments donnés comme décrit dans le concept de sensibilité collatérale5,7,8,9.
Le développement d’une résistance à un médicament nécessite une seule mutation; cependant, le développement d’une résistance à une combinaison de médicaments ciblant plusieurs voies nécessite plusieurs mutations indépendantes qui sont ralenties par cette combinaison. Un exemple de diminution de la résistance lors de l’utilisation de la polythérapie est la diminution du taux de résistance à la rifampicine dans Mycobacterium Tuberculosis10. Un autre exemple est une étude réalisée par Gribble et al. qui a montré que le taux d’émergence de souches résistantes chez les patients prenant de la pipéracilline seule était plus élevé que chez ceux prenant une combinaison de carboxypénicilline et d’aminoglycoside10. Des études ont montré que le développement d’une résistance aux aminoglycosides chez les bactéries en évolution rendait ces souches sensibles à divers autres médicaments5. La combinaison entre le médicament de classe bêta-lactamine amoxicilline et l’inhibiteur de lactamase acide clavulanique a montré le succès dans le traitement des souches bactériennes résistantes8.
La diminution du temps de traitement est un bon avantage résultant des combinaisons de médicaments. Par exemple, un traitement de pénicilline ou de ceftriaxone combinée avec de la gentamicine pendant 2 semaines donnera la même efficacité que la pénicilline ou la ceftriaxone seule lorsqu’elle est administrée pendant 4 semaines11. La combinaison de médicaments permet l’utilisation de doses plus faibles de médicaments qui ne sont pas efficaces lorsqu’ils sont administrés seuls, comme les sous-CMI. L’exemple des sulfamides peut être donné lorsque l’utilisation de triples sulfamides minimise, à des doses plus faibles, la toxicité produite qui est la formation de cristaux ou la cristallurie lors de l’utilisation de sulfamides insolubles à pleines doses12.
Ainsi, la diminution de la dose donnée et du temps de traitement finira par diminuer la toxicité des médicaments sur le corps. L’idée de développer des méthodes pour évaluer l’interaction entre les médicaments combinés est très importante. Dans une étude, les résultats ont montré que la thérapie combinée est plus efficace pour le traitement des espèces résistantes d’Acinetobacter et de P. aeruginosa8.
Donner des médicaments en combinaison Il existe différentes méthodes par lesquelles nous pouvons étudier les combinaisons de médicaments, telles que la méthode en damier, la méthode de la courbe de temps mort et la méthode E-test13. La méthode du damier peut étudier toutes les combinaisons possibles entre les deux médicaments en question dans une seule expérience elle-même. En outre, il a été développé pour étudier une combinaison de trois médicaments14. Maintenant, nous étendons cela pour étudier une combinaison de quatre médicaments principalement pour le traitement des agents pathogènes multirésistants.
Le test de la courbe time-kill est généralement effectué pour tester l’effet bactéricide d’un certain médicament. Il a également été utilisé pour tester l’effet des combinaisons de médicaments où plusieurs médicaments sont combinés à des concentrations spécifiques. Ce protocole nécessite la préparation de plusieurs tubes ou tasses stériles où dans chaque tasse nous ajoutons le bouillon, la combinaison de médicaments et la souche bactérienne requise. Après incubation et enregistrement de la densité optique à plusieurs points de temps, les résultats sont comparés au taux de croissance normal de la souche utilisée pour voir si le taux de croissance a augmenté, diminué ou n’a pas changé13.
La méthode de test électronique est habituellement effectuée pour tester la concentration minimale inhibitrice (CMI) où une bandelette contenant une concentration en gradient du médicament en question est posée sur une plaque inoculée. Il a également été utilisé pour tester la combinaison entre deux médicaments où deux bandes sont ajoutées à la plaque de manière perpendiculaire se croisant à leurs CMI13.
Selon la littérature, il n’y a pas d’étalon-or pour définir et étudier la synergie; ainsi, il est difficile d’évaluer laquelle des méthodes utilisées pour étudier la combinaison est la meilleure et laquelle produit des résultats meilleurs et plus fiables principalement13. Cependant, le test Time-kill est laborieux, long et coûteux15,16,tandis que la méthode E-test est développée pour étudier une combinaison entre deux médicaments seulement. Damier peut étudier toutes les combinaisons possibles entre les deux médicaments testés et c’est pourquoi cette technique a été choisie pour être développée.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

Le concept de polythérapie devient très important, principalement avec l’augmentation drastique de la résistance aux médicaments. Le quadruple damier, également appelé q-damier, vise à maximiser le nombre de combinaisons possibles qui peuvent être obtenues entre quatre médicaments dans une expérience pour minimiser le temps et le travail nécessaires pour obtenir les mêmes résultats avec d’autres protocoles. Ce protocole est basé sur la technique simple de micro dilution où les médicaments sont dilués et combinés ensemble dans plusieurs plaques de 96 puits.
Dans la première série de plaques de 96 puits, le bouillon Muller-Hinton est ajouté suivi du premier médicament requis (par exemple, le céfotaxime ici) pour le diluer en série. Une fois la première étape terminée, un autre ensemble de plaques de 96 puits est utilisé pour diluer le deuxième médicament (par exemple, Amikaci), qui sera transféré en enlevant un volume spécifique de médicament 2 et mis dans les puits correspondants dans le premier ensemble de plaques de 96 puits qui contient le médicament un. La troisième étape consiste à ajouter les concentrations requises du troisième médicament (p. ex. lévofloxacine) aux plaques appropriées de l’ensemble initial contenant la combinaison des médicaments 1 et 2. La quatrième étape consiste à ajouter les concentrations requises du quatrième médicament (p. ex. triméthoprime-sulfaméthoxazol) dans les plaques appropriées de la première série. Ensuite, l’inoculum bactérien E. coli ESBL sera préparé et ajouté.
Cette méthode est importante pour évaluer toutes les combinaisons possibles et offre un plus large éventail de possibilités à tester en outre pour les tests in vivo. Bien qu’il s’agisse d’une technique fatigante nécessitant beaucoup de concentration, les résultats sont remarquables et permettent de gagner du temps où de nombreuses combinaisons peuvent être testées dans une seule expérience.

La figure 2A représente les résultats obtenus en combinant le céfotaxime et l’amikacine avec des concentrations spécifiques de lévofloxacine et de triméthoprime-sulfaméthoxazole. Nous pouvons voir dans la partie gauche de la figure les quatre plaques qui sont schématiquement présentées avec les concentrations des médicaments dans la partie droite de la figure. Les flèches représentent les puits de l’interface Croissance/pas de croissance. Les puits colorés sont les puits qu...

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Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Ce protocole décrit comment étudier toutes les combinaisons possibles qui peuvent être obtenues entre quatre médicaments dans une seule expérience. Cette méthode est basée sur l’essai standard de micro dilution sur plaque de 96 puits et sur le calcul des concentrations inhibitrices fractionnaires (FICs) pour évaluer les résultats.

Quadruple-Damier : Une modification du Damier tridimensionnel pour l’étude des combinaisons de médicaments

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Chip à base de culture cellulaire tridimensionnelle dans perfusé micro-bioréacteurs

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

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Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

La microfabrication de Chip entreprises Échafaudages pour la culture cellulaire en trois dimensions

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Salut-C: une méthode d&#39;étude de l&#39;architecture tridimensionnelle des génomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Utilisation à haute résolution tomodensitométrie pour visualiser la structure tridimensionnelle et la fonction des vaisseaux sanguins des végétaux

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Reconstruction tridimensionnelle de l’Architecture vasculaire de l’ovaire de souris de clarté affranchis Passive

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

Modification génétique des cyanobactéries par conjugaison à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire CyanoGate

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...