L’objectif global de la vidéo suivante est de démontrer l’utilisation de la bibliothèque épigénétique d’ARNh regroupée pour effectuer un dépistage par sélection négative. Ce dépistage permet d’identifier des cibles épigénétiques spécifiques par séquençage. Cette procédure pourrait aider à identifier les facteurs épigénétiques responsables de la médiation de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM Les étapes sont les suivantes.
Sélection du promoteur le plus puissant pour obtenir une expression persistante et prolongée des shRNA. Le protocole actuel se concentre sur le dépistage de l’ARNi à l’aide de la bibliothèque d’ARNh du facteur épigénétique dans la lignée cellulaire MV4-11 résistante à la cytarabine. Les promoteurs utilisés à cette fin sont l’EF-1 alpha humain, le CMV humain et le SFFV, promoteurs qui expriment la protéine de fluorescence verte.
Prenez le nombre de cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan. Suspendre les cellules dans un milieu à 10 % RPMI contenant 8 microgrammes par mL de polybrene. Ensemencez 1 million de cellules dans 1,5 ml de milieu par puits d’une plaque de six puits en triples.
Ajouter différents volumes de lentivirus concentrés. Par exemple, les lentivirus, par exemple, 10, 20 et 40 microlitres, en fonction du titre des lentivirus à chaque puits. Faites tourbillonner doucement la plaque pour mélanger le contenu.
Effectuer une spinfection par centrifugation à 920 g à 37 degrés centigrades pendant 90 minutes. Incuber immédiatement les plaques dans un incubateur à dioxyde de carbone. Observez le GFP au bout de 48 heures et quantifiez-le au bout de 72 heures.
Ensuite, suivez les étapes décrites dans l’organigramme pour choisir le promoteur affichant une expression GFP cohérente dans toute la culture. Préparation de la bibliothèque d’ARNh du facteur épigénétique humain lentiviral regroupé. Cultiver des cellules 293T à un faible nombre de passage avec un bon taux de prolifération dans trois boîtes de culture cellulaire de 10 centimètres avec 8 ml de milieu DMFM à 10% dans chaque plaque.
Une fois que les cellules atteignent 60% de confluence, remplacez-les complètement par un milieu frais. Préparer le mélange de transfection tel que décrit qui contient un milieu sans sérum, un plasmide PAX2 d’emballage lentiviral, un plasmide d’enveloppe pMD2. G, les plasmides de bibliothèque regroupés, et enfin le réactif de transfection.
Tapotez le mélange pour bien le mélanger et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter le mélange de transfection aux cellules 293T et mélanger doucement en faisant tourbillonner les plaques. Incuber les plaques dans un incubateur à dioxyde de carbone.
Changez le support après 24 heures. Après 48 heures, vérifiez l’expression de GFP sous un microscope à fluorescence pour assurer une efficacité de transfection élevée dans les cellules 293T. Recueillir les surnageants du virus après 48, 60 et 72 heures et les stocker à 4 degrés, et ajouter un milieu frais, 8 ml, à chaque point temporel après la collecte du virus.
Filtrez les virus regroupés avec un filtre de 0,4 micron. Pour obtenir un titre élevé de virus, concentrez les virus regroupés par ultracentrifugation. Transférer les surnageants du virus filtrés dans des tubes de 70 Ti et centrifuger à 18 000 g pendant 2 heures.
Utilisez un rotor prérefroidi et une centrifugeuse à 4 degrés. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse et retirez complètement le surnageant. Remettre en suspension la pastille doucement dans 400 microlitres de DMEM sans FBS et antibiotiques à l’aide d’une micropipette, incuber sur de la glace pendant 1 heure.
Aliquote les virus et congeler à moins 80 degrés. Calculez la concentration du virus comme indiqué. Estimation de l’efficacité de transduction des lentivirus.
Transduire les cellules 293T avec un virus concentré dans différents volumes, 2, 4 et 8, pour confirmer la préparation réussie du lentivirus. Valeur du virus concentré à 100X pour effectuer une expérience de titrage dans la lignée cellulaire cible. Ensemencez 1 million de lignées cellulaires cibles dans 1,5 ml de milieu à 10 % RPMI contenant 8 microgrammes par ml de polybrene dans un puits d’une plaque de six puits.
Ajoutez quatre volumes différents, 1, 1.5, 2, 2.5 microlitres de virus 100X. Effectuer une spinfection par centrifugation de la plaque à 920 g pendant 90 minutes à 37 degrés centigrades. Après 72 heures, mesurez le pourcentage de cellules GFP positives par cytométrie en flux.
Déterminez le volume des virus pour obtenir une efficacité de transduction de 30 %. Cette faible efficacité de transduction permet d’assurer une intégration unique de shRNA par cellule. Transduction de la bibliothèque d’ARNh épigénétique regroupée dans la lignée cellulaire résistante aux médicaments.
Calculez le nombre de cellules à prélever pour l’expérience comme ci-dessous en fonction du nombre d’intégrants viraux. Remettre en service 11 millions de cellules dans 16 ML de milieu 10% RPMI. Ajouter le polybrene, huit microgrammes par ml et bien mélanger, puis ajouter le volume requis de virus pour obtenir une efficacité de transduction de 30% calculée précédemment.
Ensemencez toutes les cellules sur une plaque de six puits à une densité de 1 million de cellules par 1,5 ml par puits. Centrifuger la plaque pendant 90 minutes à 920 g à 37 degrés centigrades. Incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur à dioxyde de carbone.
Après 24 heures, changez le milieu et transférez les cellules transduites dans une fiole T-75. Après 48 heures, vérifiez le GFP sous un microscope à fluorescence pour assurer une transduction réussie. Après 72 heures, quantifier la GFP par cytométrie en flux.
Enrichissement des cellules GFP positives. Développez les cellules transduites en les cultivant à une densité de 0,5 million par ml pendant 5 à 7 jours, et effectuez un tri de flux avec le réglage de tri de flux défini comme haute pureté et faible rendement. Cultivez les cellules triées dans un milieu à 10 % RPMI.
Après 72 heures, effectuez l’estimation post-tri du pourcentage de cellules GFP positives pour assurer une efficacité de tri de plus de 95%. Dépistage de l’abandon pour identifier les facteurs épigénétiques médiant la résistance aux médicaments. Cultivez les cellules transduites par la bibliothèque shRNA dans 10% RPMI pendant 5 jours.
Centrifuger 10 millions de cellules en doublons. Jetez le surnageant et conservez les granulés à moins 80 degrés. Ces échantillons serviront de référence pour la bibliothèque épigénétique d’ARNh.
Cultivez les cellules transduites restantes sous forme de doublons, R1 et R2, chacune maintenue à un nombre de cellules qui fournit une représentation 500X de la bibliothèque. Traitez l’un des doublons avec le médicament, 10 cytarabine micromolaires, et l’autre sans le traitement médicamenteux. Changez le milieu des flacons avec et sans le médicament toutes les 72 heures.
Répétez le changement de milieu trois fois pour une exposition cumulative au médicament de 9 jours. Après le 9ème jour de traitement médicamenteux, vérifiez la viabilité des cellules par la méthode d’exclusion du bleu de trypan. Faites tourner les cellules viables restantes, lavez-les avec du PBS stérile et centrifugez à 280 g pendant 5 minutes à température ambiante.
Jetez le surnageant et stockez les granulés à moins 80 pour l’extraction de l’ADN. Amplification des shRNA intégrés par PCR. Extraire l’ADN des cellules de base transduites, des cellules traitées et non traitées, puis vérifier la concentration à l’aide d’un fluoromètre, calculer la quantité d’ADN requise comme indiqué et soumettre les échantillons à la première série de PCR.
Le mélange réactionnel PCR est représenté dans le tableau 2 avec les conditions du cycleur thermique. Mettre en place plusieurs réactions contenant 850 nanogrammes d’ADN par tube pour un total de 43 réactions. Mettez en commun les produits PCR et purifiez-les.
Éluez les produits dans un tampon de 50 microlitres et quantifiez-les, et enfin, stockez-les à moins 20. Pour la PCR de deuxième tour, utilisez des amorces d’index inverse et les réactifs sont présentés dans le tableau 4. Mettre en place quatre réactions avec 500 nanogrammes du produit PCR primaire dans un volume de réaction total de 50 microlitres pour chaque échantillon avec le contrôle négatif.
Chargez l’ensemble du produit pour l’électrophorèse à l’aide d’un gel d’agarose à 2% TBE et confirmez la taille de la bande avec une échelle de molécule KB. Visualisez les produits PCR sur le système de documentation du gel. Retirez la bande spécifique et purifiez-la à l’aide d’un kit de purification en gel.
Les calculs pour la purification avec le kit sont fournis dans le tableau 3. Éluter dans un volume final de 30 microlitres de tampon d’élution avec la concentration approximative de chaque éluant autour de 80 à 90 nanogrammes par microlitre. Séquençage et analyse de données de nouvelle génération.
Les produits purifiés en gel sont soumis à un séquençage de nouvelle génération pour obtenir des comptes de lecture pour les besoins en shRNA épuisés. Découpez les séquences d’adaptateurs, alignez les lectures filtrées sur les séquences de référence, chargez les fichiers à l’aide de SAMtools pour obtenir un résumé de l’alignement. Chargez les fichiers fastQ découpés dans CRISPRCloud2 et effectuez l’analyse conformément aux instructions.
Cliquez sur le lien fourni pour le CRISPRCloud2. Sélectionnez le type d’écran comme écrans Survie et Abandon. Définissez le nombre de groupes et tapez le nom de chaque groupe.
Téléchargez la bibliothèque de référence au format de fichier FASTA. Les données téléchargées sont traitées et les résultats sont disponibles dans l’URL donnée. Données représentatives.
Cette figure montre les cellules parentales et résistantes MV4-11 traitées avec une concentration croissante de cytarabine, de 0,1 micromolaire à 1 000 micromolaires, et une évaluation de la viabilité par test MTT. Cette figure montre des diagrammes de flux représentatifs de la GFP quantifiés par cytométrie en flux au bout de 72 heures pour les promoteurs humains EF-1 alpha, CMV humain et SFFV. Le CMV humain montre notre pic hétérogène tandis que l’EF-1 alpha humain et le SFFV montrent un seul pic homogène.
Cette figure montre le graphique à barres pour les trois différentes efficacités des promoteurs dans MV4-11. La GFP pilotée par le SFFV a montré un silence du GFP dans une culture prolongée. Les cellules GFP à entraînement alpha hEF-1 ont montré une expression soutenue après le tri de ces cellules.
Le panneau de gauche montre l’efficacité de transfection de la bibliothèque d’ARNh regroupée transfectée en 293T au bout de 48 heures en microscopie à fluorescence. Le panneau de droite montre l’efficacité de transduction du virus du pool dans des cellules 293T avec des volumes de virus variables, 2, 4 et 8 microlitres. Cette figure représente l’efficacité de transduction dans la lignée cellulaire résistante MV4-11 avec des volumes variables de virus, comme 1, 1,5, 2, 2,5 microlitres pour atteindre une efficacité de transduction de 30%.
Cette figure montre le tri des cellules GFP positives avec une efficacité de transduction de 30% avec une pureté élevée et un réglage de tri à faible rendement. La figure montre une illustration schématique du traitement médicamenteux des cellules triées GFP positives pour une exposition prolongée à la cytarabine de 9 jours, suivie d’une vérification de la viabilité et de la collecte des cellules pour l’ADN. Cette figure montre les régions de liaison de l’amorce utilisée dans la première et la deuxième série de PCR.
Cette figure illustre la taille de bande du produit PCR à la fin de la première paire de bases de la PCR ronde, 397, et de la paire de bases de la deuxième paire de bases de produits pcR ronde 399, qui a été éluée au gel, purifiée et administrée pour le NGS. Cette figure illustre la représentation des ARNS enrichis ou épuisés ciblant les facteurs épigénétiques qui pourraient servir de médiateur à la résistance à la cytarabine dans la LAM. Conclusion. Ce protocole souligne l’importance du dépistage ciblé pour interroger systématiquement les gènes essentiels et non essentiels et démontre l’utilisation de cette approche en tant que plate-forme fonctionnelle, permettant d’identifier les cibles responsables de la résistance aux médicaments.
