Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Heping Cheng, Huiliang Zhang et Stephen Kolwicz pour leurs commentaires utiles et un soutien technique à l&#39;élaboration de cette méthode. Cette étude a été financée par des subventions du NIH et la subvention de développement scientifique de l&#39;American Heart Association à WW.

Une. Expérience Préparation <ol><li> Préparer la solution isotonique équilibrée de sel (50 ml) contenant: 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2 et 10 mM de HEPES (pH 7,2) pour l&#39;imagerie du muscle squelettique in vivo. </li><li> Préparer 1 L de tampon Krebs-Henseleit (KHB) contenant: 118 mM de NaCl, KCl 5,3, 1,2 mM MgSO 4, EDTA 0,5 mM et 25 mM NaHCO 3. </li><li> La bulle KHB avec un gaz contenant 95% d&#39;O 2/5% de CO2 pendant 10 à 15 min avant l&#39;addition de 2 mM de CaCl2. Ajouter substrats métaboliques (glucose par exemple 10 mM et de pyruvate 0,5). </li><li> Préparer les instruments chirurgicaux en stérilisant la pince, ciseaux, pinces et dans 70% d&#39;éthanol et de rinçage dans le trou DDH 2 O. stérilisé </li><li> Mettre en marche le système de perfusion cardiaque, régler la température sur le bain d&#39;eau et de circulateur, régler la vitesse de la pompe péristaltique à 6 ml / min. </li><li> La bulle KHB avec 95% O 2/ 5% de CO 2 gazeux, et surveiller la vitesse d&#39;écoulement et de la température (37 ° C, par une sonde de température à fibre optique) de l&#39;effluent. Le système a besoin d&#39;environ 20 min pour le gaz et la température équilibrage. </li></ol> 2. Imagerie confocale de muscles squelettiques in vivo <ol><li> Anesthésier souris avec du pentobarbital (80 mg / kg, ip). L&#39;animal va atteindre une anesthésie chirurgicale (pas de réponse au pincement de l&#39;orteil) dans les 10 à 15 min et de rester dans cet état ​​pendant 1 à 1,5 heures, suffisante pour que l&#39;imagerie in vivo des muscles squelettiques. </li><li> Enlever les poils sur l&#39;un des membres postérieurs et stériliser la peau avec de l&#39;éthanol 70%. </li><li> Faire une incision sur la peau le long de la face extérieure de la branche d&#39;exposer les muscles gastrocnémiens. </li><li> Décrochez le épimysium doucement avec une forte pince et faire une incision à travers avec des ciseaux. Disséquer pour enlever la épimysium et exposer les fibres musculaires en dessous. </li><li> Pour le chargement de TMRM in vivo dans le squelettemuscle, comprennent TMRM (500 nM) dans la solution saline équilibrée isotonique à plonger muscle pendant 30 minutes et puis laver par une solution sans indicateur. </li><li> Mettre la souris sur le côté, sur le microscope confocal (Zeiss LSM 510) de phase et de retenir la patte arrière dans une position qui le muscle squelettique est exposée face contre la lamelle qui forme le fond de la chambre. La lamelle couvre-objet est entre le tissu musculaire et l&#39;objectif inversée (à l&#39;huile de 40X). </li><li> Appuyez sur la jambe doucement à prendre contact serré entre le tissu et la lamelle. Plonger les muscles exposés dans une solution isotonique de sel équilibrée. </li><li> Enregistrer deux dimensions (2D, xy) images confocales à un taux de une seconde par base de sondage. L&#39;intensité de chaque pixel est numérisé à une profondeur de 8 bits. Habituellement, un balayage en série contient 100 images. </li><li> Recueillir des images séquentielles de première excitant à 405 nm et la collecte à&gt; 505 nm à 488 nm, puis lors de la collecte à&gt; 505 nm pour une longueur d&#39;onde double excitation imagerie de mt-cpYFP. Utilisez excitation séquentielle à 405, 488 et 543 nm, et de recueillir émission à 505-545, 505-545 et&gt; 560 nm, respectivement, pour le triple longueur d&#39;onde d&#39;excitation de l&#39;imagerie mt-cpYFP et TMRM. </li></ol> 3. Imagerie confocale de coeur perfusé de souris <ol><li> Immédiatement après l&#39;imagerie in vivo des muscles squelettiques, injecter la souris avec 200 unités d&#39;héparine (ip). Dix minutes plus tard, euthanasier la souris par thoracotomie et rapidement retirer le cœur avec les poumons et le thymus qui s&#39;y rattachent. </li><li> Enlever rapidement le poumon dans un tampon glacée. Identifier les lobes du thymus et retirez délicatement pour exposer l&#39;aorte ascendante. </li><li> Retirez le thymus et isoler l&#39;aorte en enlevant soigneusement toute les tissus environnants. </li><li> Faites une entaille à l&#39;extrémité supérieure de l&#39;aorte ascendante avant la première branche de l&#39;arc aortique. </li><li> Maintenez la paroi de l&#39;aorte doucement avec deux micro pince de suture pour exposer la lumière et placer soigneusement l&#39;aorte sur le cannula (PE50 tube). L&#39;aorte est maintenu en place par un navire micro pince tandis que les sutures sont rapidement attachés autour de l&#39;aorte. </li><li> Retirez la bride, vérifier soigneusement la canule avec une pince pour s&#39;assurer que la pointe de la canule est au-dessus racine aortique. Liens supplémentaires sont ajoutés si nécessaire pour maintenir le coeur en place. </li><li> Tournez sur la pompe péristaltique et perfuser le coeur à 1 ml / min. Le cœur battant reprendra à perfusion. </li><li> Ajustez la position du système de perfusion et de mettre le coeur sur la platine du microscope. Le stade dispose d&#39;un adaptateur qui permet le chauffage de la chambre qui tient au cœur. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de perfusion dans la chambre de KHB à immerger partiellement le coeur. Surveiller la température de la chambre à 37 ° C. Retirer effluent provenant de la chambre à l&#39;aide d&#39;une pompe péristaltique. </li><li> Augmenter la vitesse de la pompe péristaltique progressivement pour assurer un écoulement suffisant (environ 2 ml / min) vers le coeur. </li><li> Après 10 minutes de stabilisation, perfuser la HEArt avec 10 uM et de 100 à 500 nM blebbistatin TMRM. Battement de coeur va ralentir après 10 min. </li><li> Appliquer une légère pression sur le coeur pour assurer un contact étanche avec le coeur de la lamelle au fond de la chambre et de supprimer davantage le rythme cardiaque. </li><li> Suivez la même procédure pour l&#39;imagerie confocale de myocarde intact, comme décrit dans l&#39;étape 2.8 ci-dessus. Réglez soigneusement le plan focal pour révéler l&#39;image la plus claire possible. </li></ol> 4. Traitement de l&#39;image et l&#39;analyse des données <ol><li> Utilisez les outils fournis par le module «Analyse physiologique&quot; du logiciel confocal à analyser clignote et la membrane mitochondriale changements potentiels simples. Ce module est souvent inclus dans le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image du système à foyer commun et permet la détermination de certaines zones de l&#39;image ainsi que la sortie de l&#39;intensité de fluorescence avec des étiquettes temporelles. </li><li> Ouvrez la base de données et le fichier d&#39;image 2D série à analyser. </li><li> Cliquez sur le &quot;Régiond&#39;intérêt (ROI) signifie &quot;pour basculer sur la&quot; moyenne des ROI mode &quot;. Cliquez sur le&quot; région d&#39;intérêt (ROI) signifie &quot;pour passer en mode&quot; moyenne de ROI &quot;. </li><li> Désactiver l&#39;affichage des autres canaux sauf le canal de cpYFP 488 nm pour sélectionner les éclairs. </li><li> Zoom dans l&#39;image et déplacer manuellement barre de défilement pour lire les images 2D en série. </li><li> Identifiez simples mitochondriales superoxyde clignote en localisant le site où signal augmente transitoirement fluorescentes. Utilisez l&#39;outil de ROI approprié pour marquer les éclairs. La trace montrant en fonction du temps de changement de fluorescence de chaque ROI sera affiché à côté de l&#39;image. </li><li> Après avoir sélectionné tous les flashs, activer l&#39;affichage des autres canaux. Sélectionner un retour sur investissement de l&#39;image à l&#39;extérieur de la cellule pour le fond de signal soustraction. La sortie de fluorescence moyenne de chaque ROI avec les étiquettes de temps. </li><li> Notez le nombre de bouffées dans chaque fichier image de balayage de série avec le temps de cycle et de la zone dela cellule. Utiliser Excel pour calculer la fréquence de flash comme nombre d&#39;éclairs par 100 sec 1000 pm 2 / zone de cellule. </li><li> Utilisez un programme développé sur mesure écrite en langue Interactive Data (IDL, ResearchSystems) pour calculer les paramètres de chaque flash (amplitude, temps au pic et de temps de décroissance). Logiciel IDL est disponible dans le commerce et le programme développé sur mesure pour l&#39;analyse des paramètres du flash peut être obtenu à partir de l&#39;auteur sur demande. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Imagerie des événements mitochondriaux simples dans l&#39;animal vivant ou organes perfusés a avantage significatif par rapport aux méthodes traditionnelles pour évaluation de la fonction mitochondriale 17,19,21,22,24,25. La technique décrite ici peut obtenir en temps réel la détermination in situ de la fonction mitochondriale dans un véritable état ​​physiologique à la résolution subcellulaire dans. Ceci est particulièrement utile, lorsque combinés à d&#39;autres mesures,...

Les mitochondries jouent un rôle central dans la bioénergétique cellulaire, la signalisation des radicaux libres, homéostasie redox, la régulation ionique, et le destin des cellules détermination 1,2. le dysfonctionnement des mitochondries et accompagne souvent la base de la pathogenèse des maladies 6.3. En particulier dans les systèmes musculaires tels que le cœur et les muscles squelettiques, la respiration mitochondriale fournit la majorité de l&#39;ATP pour soutenir la réglementation en temps opportun de calcium intracellulaire et robuste 7,8 de développement des forces. Ces muscles possèdent un grand nombre de mitochondries qui occupent souvent jusqu&#39;à 20 à 40% du volume total de la pile et qui sont &quot;fixées&quot; entre deux myofilaments. Malgré de nombreuses études, notre compréhension de la régulation de la fonction mitochondriale, notamment in vivo et dans des conditions physiologiquement pertinents, est limitée. Une des raisons est que la majorité des méthodes développées pour évaluer la fonction mitochondriale forte dans vitro ou ex approches in vivo, tels que la surveillance de la consommation d&#39;oxygène des mitochondries isolées supplémentées avec des substrats artificiels, et la détermination indirecte de la fonction mitochondriale par l&#39;intermédiaire morphologie (microscopie par exemple électrons), l&#39;activité enzymatique (par exemple, l&#39;activité aconitase), ou les taux d&#39;ATP intracellulaire 11.9 . Récemment, de petites molécules fluorescentes indicateurs avec enrichissement mitochondrial rapport ont été appliquées à fournir un aperçu des signaux mitochondriaux, y compris le potentiel de membrane, de calcium et d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS), dans des cellules intactes 11-13. En outre, plusieurs protéine fluorescente verte (GFP) et les indicateurs redox à base de ROS ont été développés pour réaliser une évaluation plus précise de l&#39;redox intracellulaire ou compartimentée signaux ROS 14-16. Parmi cela, nous avons développé un indicateur codé génétiquement superoxyde, la protéine fluorescente jaune permuté circulaire, et Targeted dans les mitochondries (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP peut être excité à 405 ou 488 nm avec deux pics d&#39;émission à 515 nm. L&#39;émission à 488 nm excitation est particulièrement sensible à la superoxyde comme le montre précédente in vitro et in vivo étalonnages 17,18. L&#39;émission à 405 nm excitation est utilisé comme contrôle interne (s&#39;il vous plaît se référer à la figure 1 de la référence 17 pour des informations détaillées sur les spectres d&#39;émission et d&#39;excitation de mt-cpYFP dans diverses conditions). Avec time-lapse imagerie confocale, cet indicateur détecte l&#39;éclatement des événements de production de superoxyde dismutase, nommés clignote, dans les mitochondries de simples cellules intactes. Superoxyde éclair sert une fonction composite de la respiration mitochondriale, d&#39;accompagnement transitoire dépolarisation de la membrane mitochondriale et la production de ROS 17-20. Récemment, nous avons généré les pan-tissus mt-cpYFP souris transgéniques en utilisant le vecteur pUC-CAGGS-mt-cpYFP 17,19 sur C57/BL6 fond et vérifié les expres fortssion de cet indicateur dans le cœur, les muscles du squelette et d&#39;autres tissus (figure 2). Les souris transgéniques sera disponible pour des chercheurs universitaires intéressés sur demande et d&#39;approbation MTA par l&#39;Université de Washington. Dans cette étude, nous décrivons l&#39;imagerie in situ des superoxydes clignote dans Langendorff perfusé coeur ainsi que l&#39;imagerie in vivo des événements flash dans les muscles squelettiques de mt-cpYFP souris transgéniques anesthésiés 17,19 en. Cette technologie permet la surveillance en temps réel de simples événements mitochondriaux de production de ROS dans un état ​​physiologiquement pertinent ou in vivo 21,22. Il est également possible d&#39;utiliser le système pour surveiller d&#39;autres paramètres mitochondriaux simples tels que le potentiel de membrane et de calcium avec des indicateurs fluorescents appropriés. Évaluation plus, simultanément ou en parallèle de la fonction mitochondriale des événements intracellulaires (par exemple, les transitoires de calcium) ou la fonction cardiaque (par exemple,. Fraction d&#39;éjection) peut être obtenue. Perturbations pathologiques tels que l&#39;ischémie et de la reperfusion, peuvent être appliquées au cœur perfusé à évaluer l&#39;impact du stress sur la fonction mitochondriale unique dans le myocarde intact.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitochondrie est un organite intracellulaire critique responsable de la production d&#39;énergie et la signalisation intracellulaire dans les systèmes eucaryotes. Dysfonction mitochondriale accompagne souvent et contribue à la maladie humaine. La majorité des approches qui ont été développées pour évaluer la fonction mitochondriale et le dysfonctionnement sont basées sur in vitro ou ex vivo mesures. Les résultats de ces expériences ont la capacité à déterminer la fonction mitochondriale in vivo est limitée. Ici, nous décrivons une nouvelle approche qui utilise la microscopie à balayage confocal pour l&#39;imagerie de tissus intacts en aminals vivants, ce qui permet l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale unique d&#39;une manière en temps réel in vivo. Tout d&#39;abord, on génère des souris transgéniques exprimant la cible mitochondriale indicateur de superoxyde, la protéine fluorescente jaune circulairement permuté (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anesthésiés souris est fixé sur un adaptateur de platine sur mesure et images de time-lapse sont prises felon les muscles squelettiques exposées de la patte arrière. La souris est ensuite sacrifiée et le coeur est mis en place pour la perfusion de Langendorff avec des solutions physiologiques à 37 ° C. Le cœur perfusé est placé dans une chambre spéciale sur la platine du microscope confocal et une légère pression est appliquée pour immobiliser le cœur et supprimer rythme cardiaque induite par l&#39;artefact de mouvement. Superoxydes sont détectés par les bouffées de 2D en temps réel imagerie confocale à une fréquence d&#39;une image par seconde. La solution de perfusion peut être modifié pour contenir des substrats différents de respiration ou d&#39;autres indicateurs fluorescents. La perfusion peut également être ajustée pour produire des modèles de maladies telles que l&#39;ischémie et la reperfusion. Cette technique est une approche unique pour déterminer la fonction de mitochondrie unique dans les tissus intacts et in vivo.

Selon ce protocole, l&#39;imagerie in vivo des événements mitochondriaux simples peut être fait dans les muscles squelettiques de souris anesthésiées suivie par imagerie in situ coeur perfusé (figure 1) en. Le réglage optimal des conditions d&#39;imagerie permettra d&#39;assurer des images claires des tissus musculaires intactes et à la résolution de mitochondrie unique (figure 2). TMRM est souvent utilisé pour vérifier l&#39;emplacement du mt-cpYFP...

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Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Microscopie confocale à balayage est appliqué pour l&#39;imagerie des événements mitochondriaux simples dans le cœur perfusé ou les muscles squelettiques dans les animaux vivants. Surveillance en temps réel des processus mitochondriaux simples tels que les bouffées de superoxydes et les fluctuations potentielles membrane permet l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale dans un contexte physiologiquement pertinente et pendant perturbations pathologiques.

Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

14.5K vues.  University of Washington.  Microscopie confocale à balayage est appliqué pour l'imagerie des événements mitochondriaux simples dans le cœur perfusé ou les muscles squelettiques dans les animaux vivants. Surveillance en temps réel des processus mitochondriaux simples tels que les bouffées de superoxydes et les fluctuations potentielles membrane permet l'évaluation de la fonction mitochondriale dans un contexte physiologiquement pertinente et pendant perturbations pathologiques. 

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

L&#39;électroporation cellule unique in vivo dans le cerveau intact développement

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Recherche

Biologie

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

L&#39;imagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Évaluation de calcium Sparks dans intactes les fibres musculaires squelettiques

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En détection de visage de l&#39;oxyde nitrique et de superoxyde dans la couche endothéliale des artères intactes

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

Confocale, imagerie du Neuropeptide Y-pHluorin : une Technique pour visualiser l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots murins et humains intacts

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Quantification du potentiel de la membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

Pleins feux sur l’auteur : Quantification par fluorescence du potentiel de la membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde à l’aide de l’imagerie en direct dans les cellules HeLa  

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

Quantification basée sur la fluorescence du potentiel de membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde à l’aide de l’imagerie en direct dans les cellules HeLa

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...