Ce protocole maximise considérablement la puissance de la microscopie en tant que méthode pour suivre la dynamique mitochondriale dans les cellules individuelles sur de longues périodes d’acquisition. Contrairement au time-lapse sur un groupe fixe de cellules, ou sur une cellule à la fois, la normalisation à une ligne de base pour chaque critère mesuré dans chaque cellule contrôle l’hétérogénéité entre les cellules. Avec un microscope équipé d’une plateforme automatisée et d’un vecteur viral adapté, nous pouvons utiliser ce protocole pour tous les types de cellules.
Commencez par plaquer 20 000 à 25 000 cellules par centimètre carré dans des plats multi-puits et stockez-les à 37 degrés Celsius sous une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone pour le reste de l’expérience. À huit jours in vitro, ajouter 0,6 pico grammes d’antigène P24 par cellule de vecteur lentiviral codant pour le biocapteur mitochondrial MitoTimer dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate. À 11 jours in vitro, effectuez deux lavages avec du PBS stérile préchauffé et ajoutez un milieu astrocytaire frais sans rouge phénolique.
Évaluez le système mitochondrial astrocytaire au moins trois à cinq jours après les infections lentivirales par LV-G1 MitoTimer. Sélectionnez cinq astrocytes par puits avec un réseau mitochondrial exprimant des niveaux suffisants de LV-G1 MitoTimer en utilisant un grossissement de 40 fois. Prendre soin de sélectionner les astrocytes plats et grands autant que possible et non situés dans des grappes de cellules.
Capturez ensuite des images de fluorescence en utilisant une excitation séquentielle à 490 nanomètres pour le canal vert et 550 nanomètres pour le canal rouge avec des signaux fluorescents verts et rouges et en utilisant un grossissement de 150 fois pour chaque coordonnée. Sélectionnez la première image pour les couches rouges et vertes pour chaque séquence d’images en cliquant sur Traitement ND et sélectionnez l’image. Fusionnez ensuite les canaux rouge et vert en sélectionnant les conversions et le canal de fusion.
Pour corriger l’ombrage de l’image, sélectionnez prétraitement, puis correction automatique de l’ombrage. Appliquez l’algorithme de la boule roulante en sélectionnant le prétraitement et la balle roulante. Pour générer des masques binaires pour chaque mitochondrie, sélectionnez segmentation et seuil.
Supprimez tous les objets tronqués par la bordure en sélectionnant le traitement binaire et en touchant la bordure. Sélectionnez la mesure, puis la zone de l’objet, le diamètre EEQ, la longueur, la largeur, la rugosité, la circularité ou l’allongement pour mesurer respectivement la surface, le diamètre, la longueur, la largeur, la rugosité, la circularité ou l’allongement. Composez un groupe avec ces mesures et renommez-le en données MOFO.
Sélectionnez ensuite la mesure, puis sélectionnez l’intensité moyenne pour mesurer les intensités vertes et rouges moyennes. Et ratio pour mesurer le rapport rouge par vert. Maintenant, le compositeur regroupe ces mesures et renomme-le en tant que données de ratio.
Enfin, exportez la table dans un fichier CSV en sélectionnant référence et table au format CSV, puis enregistrez le script d’analyse GA 3 en sélectionnant Enregistrer sous.Commencez par ouvrir le module de suivi dans NIS et sélectionnez affichage, analyse et suivi. Cliquez sur définir un nouveau roi. Avec l’outil de détection automatique, sélectionnez 25 à 50 mitochondries sur la première image de la séquence d’images, puis cliquez sur suivre l’analyse des rois de retour sur investissement détectés automatiquement.
Si nécessaire, supprimez les pistes de retour sur investissement incorrectes et exportez la table dans un fichier CSV. Enregistrez manuellement la transformation des mesures avant le traitement. Pour chaque analyse et chaque période, normalisez manuellement les données résultantes par la moyenne obtenue dans l’acquisition de référence.
Effectuez ensuite une analyse statistique à l’aide d’un Nova apparié bidirectionnel. La culture primaire d’astrocytes infectés par LV-G1 MitoTimer a montré une réduction des réseaux mitochondriaux équilibrés et oxydés avec différents niveaux de fragmentation. Avant le traitement au peroxyde d’hydrogène, les astrocytes exprimant LV-G1 MitoTimer présentaient une taille mitochondriale hétérogène dans diverses intensités de fluorescence verte et rouge.
La morphologie mitochondriale des cultures d’astrocytes a été fragmentée après six heures d’incubation avec du peroxyde d’hydrogène. C’était encore plus apparent 12 heures après le traitement sans leurs diamètres avec depuis la réduction de la sphéricité. En ce qui concerne l’état redox et le renouvellement, trois heures après un traitement au peroxyde d’hydrogène, la proportion de mitochondries vertes a augmenté dans les astrocytes.
Concernant la dynamique et la mobilité trois heures après le traitement. Tous les critères ont été augmentés de façon transitoire. Cette technique convient à de nombreuses questions différentes.
Par exemple, dans le contexte des maladies neurodégénératives, nous étudions la toxicité œstrocytaire de différentes molécules sécrétées dans le cerveau.
