Cette méthode vous permet de cultiver des bactéries dans un environnement qui déclenche une physiologie cellulaire et une morphologie de biofilm similaires à celles que vous voyez dans les infections pulmonaires à fibrose kystique. Les poumons sont un déchet dans l’industrie de la viande, il n’y a donc pas de préoccupations éthiques. Le modèle offre une plate-forme pour imiter l’infection humaine sans avoir besoin d’un modèle animal vivant.
Cette technique donne aux chercheurs une nouvelle façon d’examiner les médicaments candidats pour le potentiel d’entrer et de détruire les biofilms qui se forment dans les poumons de la fibrose kystique. Avec un développement et une validation ultérieurs, nous pensons que le modèle EVPR pourrait être utilisé pour des tests spécialisés et individualisés de sensibilité aux antibiotiques. Procurez-vous des poumons immédiatement après l’abattage et transportez-les au laboratoire dans une glacière domestique.
Travailler sur une surface stérilisée et sous une flamme. Placez les poumons sur une planche à découper en plastique propre recouverte de papier d’aluminium autoclavé et vérifiez que les bronchioles restent intactes. Les poumons ne conviennent pas à une utilisation s’il y a eu des dommages à l’abattoir ou pendant le transport.
Chauffer un couteau à palettes sous une flamme et toucher très brièvement le couteau à la zone du poumon entourant la bronchiole pour stériliser la surface du tissu. Coupez le tissu de surface entourant la bronchiole à l’aide d’une lame de rasoir montée sur stérile, en faisant des incisions parallèles à la bronchiole pour éviter tout dommage. Une fois que la bronchiole a été exposée, faites une incision transversale à travers la bronchiole au point le plus élevé visible.
À l’aide d’une pince stérile, tenez légèrement l’extrémité libre de la bronchiole et coupez tout tissu indésirable restant à l’aide d’une lame de rasoir montée sur stérile. Faites une incision transversale finale à travers la bronchiole avant toute ramification visible pour enlever la bronchiole des poumons. Placez la bronchiole dans le premier lavage DMEM RPMI 1640.
Laissez-le dans le lavage et récoltez des sections supplémentaires de bronchiole du même poumon pour donner suffisamment de sections de tissu pour l’expérience prévue. Placez toutes les sections bronchiolaires supplémentaires du même poumon dans le lavage et laissez-les dans le lavage pendant au moins deux minutes. Retirez les bronchioles du premier lavage et placez les échantillons dans une boîte de Pétri stérile.
Tenez légèrement chaque bronchiole avec une pince stérile, en prenant soin de ne pas endommager le tissu. Enlevez autant de tissus mous restants que possible et coupez le tissu en bandes de cinq millimètres de large à l’aide de ciseaux de dissection stériles. Placez toutes les bandes de tissu bronchiolaire dans le deuxième lavage DMEM RPMI 1640.
Laissez-les au lavage pendant au moins deux minutes, puis retirez les bandes de tissu du deuxième lavage à l’aide d’une pince stérile et placez-les dans une boîte de Petri propre et stérile. Retirez tout tissu mou restant attaché à la bronchiole et coupez les bandes en carrés à l’aide de ciseaux de dissection stériles. Ajoutez le troisième lavage DMEM RPMI 1640 dans la boîte de Petri et mélangez légèrement les morceaux de tissu dans le lavage en faisant tourbillonner la boîte.
Versez le troisième lavage de la boîte de Pétri sans enlever les morceaux de tissu. Ajoutez ensuite le lavage SCFM final, en vous assurant que tous les morceaux de tissu sont recouverts. Stériliser le tissu dans SCFM sous lumière UV pendant cinq minutes.
Utilisez une pince stérile pour transférer chaque morceau de tissu bronchiolaire stérilisé dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant des tampons d’agarose SCFM. Pour infecter chaque morceau de tissu avec la souche bactérienne souhaitée, touchez une colonie cultivée sur une plaque de gélose avec la pointe d’une aiguille de calibre 29 attachée à une seringue à insuline stérile de 0,5 millilitre, puis touchez la colonie sur la pièce de tissu, en piquant doucement la surface. Pour les témoins non infectés, piquez doucement la surface de la pièce de tissu avec la pointe de l’aiguille, puis utilisez une pipette pour ajouter 500 microlitres de SCFM à chaque puits.
Stérilisez une membrane d’étanchéité respirante pour chaque plaque de 24 puits sous lumière ultraviolette pendant 10 minutes. Retirez le couvercle de la plaque de 24 puits et remplacez-le par la membrane respirante, puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius sans trembler. Mettre en place des ensembles de répliques de morceaux pulmonaires à partir d’au moins deux poumons indépendants, en utilisant un ensemble pour un contrôle négatif et un ensemble pour chaque concentration d’antibiotique à tester.
Après 48 heures d’incubation, inspecter visuellement les morceaux de tissu non infectés pour la croissance de bactéries endogènes, ce qui provoquerait le milieu autour de ces sections à être turbide. Si une croissance typique de l’espèce d’étude sélectionnée est observée, redémarrez l’expérience avec des poumons frais. Si les sections de tissus non infectées ne montrent aucune croissance bactérienne ou une croissance bactérienne minimale, préparez une plaque de lavage de 24 puits et une plaque de traitement de 24 puits.
Chaque puits de la plaque de traitement doit contenir 500 microlitres de SCFM frais sans antibiotiques, ou avec l’antibiotique d’intérêt. Retirez chaque morceau de tissu infecté de la plaque d’incubation avec une pince stérilisée à la flamme. Faites-le tourbillonner brièvement dans un puits frais de la plaque de lavage pour éliminer toutes les cellules bactériennes non associées au biofilm et le transférer dans le puits approprié de la plaque de traitement.
Scellez la plaque de traitement avec une membrane respirante fraîche, puis incuber à 37 degrés Celsius sans trembler pendant 18 à 24 heures. Utilisez une pince stérilisée à la flamme pour retirer chaque morceau de poumon de la plaque de 24 puits et mettez-la dans un tube d’homogénéisation stérile de deux millilitres contenant un millilitre de PBS et un gramme de perles métalliques. Perle battu pendant 40 secondes à quatre mètres par seconde.
Diluez en série l’homogénat de poumon utilisant le PBS, et plaquez-le sur la gélose de LB pour déterminer les unités formant des colonies dans les morceaux individuels, non traités, et antibiotiques-traités de tissu. Lorsqu’ils sont cultivés dans le poumon de porc ex vivo ou l’EVPL, les biofilms de P.aeruginosa et de S. aureus démontrent une tolérance accrue aux antibiotiques par rapport à la sensibilité dans les essais standard de CMI et de disque de bouillon approuvés par l’industrie à l’aide de milieux standard. Les divers effets de différents antibiotiques sur un biofilm établi par l’EVPL sont distinguables.
Par exemple, la mise à mort de P.aeruginosa est réalisée dans l’EVPL avec de la ciprofloxacine 4 à 16X MIC, mais pas avec du chloramphénicol 4 à 8X MIC. Les populations de S. aureus qui sont sensibles au linézolide dans le test disque sont capables de survivre à des concentrations sériques cibles et plus élevées dans l’EVPL. Même un test in vitro optimisé ne peut pas prédire avec précision la susceptibilité de P.aeruginosa à la colistine dans l’EVPL.
La quantité d’antibiotique requise pour obtenir trois destructions log 10 des bactéries cultivées par EVPL est souvent significativement plus élevée que le MIC ou le MBEC calculé à partir d’essais in vitro standard. En plus de distinguer les différences entre les agents antimicrobiens, ce modèle peut mettre en évidence des changements de sensibilité à différents stades de croissance bactérienne et pour différents intervalles de dosage des antibiotiques. La tolérance croissante des biofilms de P.aeruginosa au meropenem à mesure qu’ils mûrissent est montrée ici.
La survie de S. aureus a été mesurée 4 et 24 heures après l’exposition à la flucloxacilline, ce qui a permis d’observer des différences dans la réduction du nombre de cellules bactériennes au fil du temps et entre les isolats. Les variations de la charge bactérienne augmentent souvent avec les temps de culture prolongés. Ceci peut être vu dans le contrôle non traité suivant le développement de biofilm de 48 heures et une exposition supplémentaire de 24 heures pour tenir compte de l’intervalle de dosage antibiotique.
Il est crucial de maintenir une excellente technique stérile tout au long de la dissection, nous vous recommandons donc de faire la dissection dans un laboratoire ou dans une zone de votre laboratoire que vous n’utilisez jamais pour le travail de microbiologie. Nous avons récemment utilisé le modèle pour explorer l’entrée de la colistine dans le biofilm, et le modèle a un bon potentiel d’utilisation dans la recherche pour améliorer l’administration de médicaments dans les biofilms.
