Nous tenons à remercier Anand Swaroop pour avoir fourni des souris Nrl-GFP, Jochen Haas pour son soutien technique et Sindy Böhme et Emely Lessmann pour l’élevage.	
	Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, le CRTD Seed Grant Program, le SFB 655 et le ProRetina e.V. fondation, le programme d’études supérieures DIGS-BB dresde et la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Énoncé sur l’utilisation éthique et les soins des animaux :
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées en stricte conformité avec les lois de l’Union européenne et allemandes (Tierschutzgesetz) et ont adhéré à la déclaration ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la TU Dresde et de la Landesdirektion Dresden (numéro d’approbation : 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Avant de commencer la dissociation des cellules et le tri des cellules
<ol><li>Étiqueter trois tubes réactionnaires de 15 ml avec : Wash (W), Fraction positive (+) et Fraction négative (-).</li>
</ol>2. Dissociation de la rétine
<ol><li>Décapitez les chiots PN 4 à l’aide d’un ciseau.</li>
	<li>Rincer la tête des petits peu de temps après avec de l’éthanol à 70 % et les laver dans du PBS.</li>
	<li>Transférer la tête à HBSS froid et énucléer l’œil (répétez cette étape pour toutes les têtes). Pour énucléer, ouvrez les paupières et fixez l’œil avec une pince incurvée au niveau de la région du nerf optique. Ensuite, tirez l’œil soigneusement hors de l’orbite.</li>
	<li>Après avoir énucléé tous les yeux, isolez la rétine: introduisez un ciseau fermé dans le nerf optique et ouvrez les lames. Peal le RPE / chorid out. Retirez les lentilles et les vaisseaux sanguins à l’aide d’une pince incurvée.</li>
	<li>Transférer les rétines isolées dans un tube réactionnel de 1,5 ml contenant la solution de papaïne (fournie par le kit de dissociation de la papaïne).</li>
	<li>Incuber les rétines dans la solution de papaïne pendant 30-60 min dans un bain-marie ou un shaker (400 rpm) à 37 °C.<ol>
<li>Pendant que les rétines couvent dans la solution de papaïne, pipetter 1 ml de solution d’ovomucoïde dans un tube réactionnel de 15 ml (étiquette « 1 »).</li>
			<li>Ajouter 60 μl de DNase I (10 mg/ml) + 60 μl de solution d’ovomucoïde (fournie par le kit) + 520 μl d’EBSS dans un tube de réaction de 15 ml (étiquette « 2 »).</li>
		</ol>
</li>
	<li>Après incubation de la papaïne, transférer la solution de papaïne contenant les rétines partiellement digérées dans le tube réactionnel « 2 ».</li>
	<li>À l’aide d’une pipette polie au feu, effectuez une dissociation mécanique (10x de haut en bas).</li>
	<li>Pipetter la suspension à cellule unique au tube de réaction « 1 ». Essayez de générer 2 couches en superposant doucement la suspension cellulaire sur la solution ovomucoïde.</li>
	<li>Centrifuger pendant 5 min à 300 x g (environ 1 300 tr/min).</li>
	<li>Jetez le surnageant et ressuscitez les cellules dans 500 μl de tampon MACS.</li>
</ol>3. Tri des cellules à l’aide du tri des cellules associées magnétiques (MACS)
<ol><li>Ajouter x μl d’anticorps anti-CD73 pour le rat aux 500 μl afin d’atteindre une concentration finale de 10 μg/ml.</li>
	<li>Incuber 5 min sur la glace.</li>
	<li>Remplissez le tube de réaction de 15 ml à 10 ml avec un tampon MACS et centrifugez-le pendant 5 min à une vitesse de 300 x g.</li>
	<li>Retirez le surnageant.</li>
	<li>Ressusciter la pastille dans un tampon MACS de 480 μl et ajouter 120 μl de microbilles d’IgG anti-rat de chèvre.</li>
	<li>Incuber 15 min sur la glace; ne pas agiter, secouer ou mélanger.</li>
	<li>Remplissez le tube de réaction de 15 ml à 5 ml avec un tampon MACS et centrifugez-le pendant 5 min à 300 x g.</li>
	<li>Lorsque le tube de réaction est centrifugé:<ol>
<li>Ajustez une colonne LS dans le support magnétique.</li>
			<li>Placez le filtre de préséparation au-dessus de la colonne LS.</li>
			<li>Hydrater le filtre de préséparation et la colonne LS avec un tampon MACS de 3 ml et recueillir le tampon MACS dans le tube de lavage (W).</li>
		</ol>
</li>
	<li>Retirez le surnageant.</li>
	<li>Ressusciter la pastille dans un tampon MACS de 500 μl.</li>
	<li>Chargez la suspension cellulaire de 500 μl dans le filtre, puis ajoutez 1 ml de tampon MACS au filtre et collectez la fraction négative dans le tube de réaction de fraction négative (-).</li>
	<li>Ensuite, ajoutez 3 x 3 ml de tampon MACS à la colonne pour laver les cellules qui ne sont pas liées à la colonne</li>
	<li>Une fois que ces 9 ml sont à travers la colonne LS, retirez la colonne du support magnétique et installez-la sur le dessus du tube de réaction de fraction positive (+).</li>
	<li>Chargez rapidement 5 ml de tampon MACS dans la colonne LS et placez le piston dans la colonne LS et appuyez dessus jusqu’à ce que la mémoire tampon entière soit à travers la colonne.</li>
	<li>Centrifuger le tube réactionnel contenant la fraction positive pendant 5 min à 300 x g.</li>
	<li>Retirer le surnageant, le ressusciter dans 500 μl de tampon MACS et le maintenir à 4 °C.</li>
	<li>Comptez la quantité totale de cellules à l’aide d’un dispositif de comptage de cellules commun.</li>
	<li>Préparer une suspension cellulaire à partir de la fraction triée positive contenant 2 x 105 cellules/μl dans un tampon MACS et la maintenir à 4 °C</li>
</ol>4. Transplantation de cellules précurseurs de photorécepteurs triées par MAC dans la rétine de la souris
<ol><li>Assurez-vous d’avoir toutes les solutions suivantes prêtes : 1 ml de PBS ou d’HBSS stérile, 10 μl de DNAse I, 1-2 ml stérile désioniséH2O,aliquotes des fractions de suspension cellulaire à 4 °C.</li>
	<li>Anesthésier la souris adulte(c.-à-d. âgée de 2 à 4 mois) avec une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de médetomidine (0,01 mg/10 g de poids corporel), de kétamine (0,75 mg/10 g de poids corporel). Ensuite, faites une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) pour soulager la douleur.</li>
	<li>Dilater les pupilles avec une goutte de phényléphrine 2,5%-Tropicamide 0,5%.</li>
	<li>Fixez la souris dans le support de tête de souris et placez-la au microscope stéréoscopique.</li>
	<li>Appliquez une goutte de gel visidique pour éviter le dessèchement de l’œil.</li>
	<li>Faire un petit trou à la frontière entre la sclérotique et la cornée (respectivement ora serrata)à l’aide d’une aiguille stérile de 30 G 1/2.</li>
	<li>Coupez une glissière de couverture commune en petits morceaux (environ 5 mm x 5 mm) à l’aide d’un stylo diamant, placez l’une de ces pièces sur le dessus de la cornée, permettant une visualisation directe de la rétine.</li>
	<li>Rincer la seringue microlitres préstérisée plusieurs fois avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Chargez la seringue microlitre avec 1 μl de suspension cellulaire, dirigez l’aiguille tangentiellement à travers la conjonctive et la sclérotique et placez-la sous contrôle visuel dans la moitié nasale de la rétine.</li>
	<li>Percer doucement un trou dans la rétine jusqu’à atteindre l’espace sous-rétinien, injecter la suspension cellulaire dans l’espace sous-rétinien.</li>
	<li>Observez le décollement bulleux de la rétine, qui doit être uniforme, couvrant environ 1/4 de l’espace rétinien sans aucun saignement.</li>
	<li>Retirez doucement la seringue, le trou rétinien scelle automatiquement.</li>
	<li>Rincer la seringue microlitre plusieurs fois avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Relâchez la souris du porte-tête.</li>
	<li>Réveillez la souris en injectant du chlorhydrate d’atipamozole pour inverser l’effet chlorhydrate de médétomidine.</li>
	<li>Placez la souris pour le temps de réveil dans une chambre sombre et chaude (environ 25 °C).</li>
	<li>Les 2 prochains jours après la transplantation, la buprénorphine (0,05 mg/kg de poids corporel) doit être administrée par injection sous-cutanée le matin et l’après-midi pour soulager la douleur.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice.">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li><li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors.">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li><li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells.">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells.">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li><li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation.">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li><li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors.">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation.">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li><li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina.">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li><li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73,+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells.">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li><li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression.">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors.">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li><li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+&amp;#34;Three-step+MACS&amp;#34;:+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue.">Development of the &amp;#34;Three-step MACS&amp;#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs représente un outil fiable pour réaliser l’intégration de ces cellules sensibles à la lumière dans les rétines de l’hôte en nombres significatifs1,2. Cela pourrait permettre la mise en place d’une thérapie cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine à l’avenir6. La population donneuse de cellules, actuellement isolée des rétines PN 4, est un mélange de différents types de cellules, à parti...

La vision est l’un des principaux sens de l’homme. La dégradation de ce sens et la cécité sont l’une des principales raisons du handicap dans les pays industrialisés. La cause prédominante de déficience visuelle ou de cécité est la dégénérescence rétinienne, caractérisée par une perte de cellules photorécepteurs, comme on peut l’observer dans la dégénérescence maculaire, la rétinite pigmentaire, la dystrophie cononique-tige et d’autres conditions. À ce jour, il n’existe pas de thérapie efficace pour restaurer la vision perdue. En 2006 et 2008, deux laboratoires différents ont signalé, indépendamment l’un de l’autre, une transplantation réussie de cellules précurseurs de photorécepteurs de tiges dans des rétines adultes de souris de type sauvage1,2. Ainsi, surgissant la possibilité de transplantation de cellules de précurseur de photorécepteur également dans une rétine dégénérée, pour remplacer les photorécepteurs dégénérés et restaurer la vision. En effet, il a été démontré récemment, que de telles cellules précurseurs photoréceptrices transplantées suscitent des critères morphologiques de photorécepteurs matures de type sauvage, tels que des segments externes correctement développés3, desbornes synaptiques à proximité immédiate de cellules bipolaires endogènes et d’un corps cellulaire rond situé dans la couche nucléaire externe2-4,ainsi que la capacité à s’intégrer fonctionnellement dans les circuits neuronaux de l’hôte5-7. L’un des grands principes de cette stratégie est l’utilisation des rétines de jeunes souris du jour postnatal 4 (PN 4, PN0 est défini comme le jour de la naissance), ce qui entraîne un mélange de différents types de cellules pour la transplantation. Sur le fond d’une future application thérapeutique, ce mélange doit être purifié pour les cellules précurseurs de photorécepteurs. CD73 a été décrit comme le premier marqueur de surface cellulaire spécifique pour les jeunes photorécepteurs dans la rétine8-10. Ici, nous démontrons une méthode de purification de cellules précurseurs de photorécepteurs basée sur ce marqueur de surface cellulaire et avec l’utilisation de la technique de tri cellulaire magnétique associé (MACS). Macs pourrait avoir des avantages par rapport aux techniques de tri cellulaire fluorescent-activé, en raison des temps de tri rapides et de l’ajustement plus facile aux conditions GMP. Nous pourrions démontrer un enrichissement d’environ 90% et un taux d’intégration jusqu’à 3 fois plus élevé lors de la transplantation de la population enrichie dans l’espace sous-rétinien chez les rétines adultes de type sauvage. Ainsi, l’enrichissement de cellules précurseurs de photorécepteurs à base de MACS et la transplantation sous-rétinienne sont des techniques fiables et prometteuses pour le développement d’une stratégie thérapeutique régénératrice pour le traitement de la dégénérescence rétinienne.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:111px;">Worthington&#160; Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:103px;">LK003150</td>
			<td style="width:176px;">supplied DNase I is not used in the method</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23</td>
			<td style="width:111px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:103px;">550738</td>
			<td style="width:176px;">Stock concentration 0.5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Goat Anti-Rat IgG MicroBeads</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-048-501</td>
			<td style="width:176px;">Total volume of 2ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">10010-015</td>
			<td style="width:176px;">Used to count the total number of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">DNase I</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D5025-150KU</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">HBSS</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14025050</td>
			<td style="width:176px;">Used for dissociation of the retinas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">Fluka93595</td>
			<td style="width:176px;">Used to count the total number of cells</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:195px;">Vidisic</td>
			<td style="width:111px;">Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td>
			<td style="width:103px;">-</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Domitor</td>
			<td style="width:111px;">Pfizer</td>
			<td style="width:103px;">76579</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Ketamin 10%</td>
			<td style="width:111px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:103px;">7538843</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Antisedan</td>
			<td style="width:111px;">Pfizer</td>
			<td style="width:103px;">76590</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:195px;">Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">University clinics Dresden pharmacy</td>
			<td style="width:103px;">-</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Pre-Separation Filters</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-041-407</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">LS Columns</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-042-401</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-042-303</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-976</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">fire polish glass pasteur pipette</td>
			<td style="width:111px;">Brand</td>
			<td style="width:103px;">74777 20</td>
			<td style="width:176px;">The pipette&#8217;s tips need to be fire-polished and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">MACS 15ml tube rack</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-052</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Cell count chamber</td>
			<td style="width:111px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:103px;">T728.1</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Sterile 15ml tubes</td>
			<td style="width:111px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:103px;">188271</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Leica M651 MSD</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:103px;">M651 MSD</td>
			<td style="width:176px;">can be used instead of Olympus SZX10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Olympus SZX10</td>
			<td style="width:111px;">Olympus</td>
			<td style="width:103px;">SZX10</td>
			<td style="width:176px;">can be used instead of Leica M651 MSD</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Olympus inverted stereo microscope CKX41</td>
			<td style="width:111px;">Olympus</td>
			<td style="width:103px;">CKX41</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance</td>
			<td style="width:111px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:103px;">51025411</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">1.5ml reaction tube</td>
			<td style="width:111px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:103px;">727706400</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">2ml reaction tube</td>
			<td style="width:111px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:103px;">72695</td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Eppendorf Centrifuge 5702</td>
			<td style="width:111px;">VWR (Eppendorf)</td>
			<td style="width:103px;">521-0733</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Mouse head holder</td>
			<td style="width:111px;">myNeurolab</td>
			<td style="width:103px;">471030</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">BD Microlance 3 30G 1/2&#8221;</td>
			<td style="width:111px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:103px;">304000</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Hamilton microliter syringe 5&#181;l, 75RN</td>
			<td style="width:111px;">Hamilton</td>
			<td style="width:103px;">065-7634-01</td>
			<td style="width:176px;">delivered without needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Hamilton RN special needle GA34</td>
			<td style="width:111px;">Hamilton</td>
			<td style="width:103px;">065-207434</td>
			<td style="width:176px;">Blunt, 12mm length</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors - 5mm Blades Straight</td>
			<td style="width:111px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:103px;">15003-08</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie</td>
			<td style="width:111px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:103px;">11272-40</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Diamond pen</td>
			<td style="width:111px;">Tools-tech</td>
			<td style="width:103px;">-</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">15x15mm Cover slips</td>
			<td style="width:111px;">Sparks</td>
			<td style="width:103px;">MIC3366</td>
			<td style="width:176px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subretinal transplantation of macs purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina

La déficience visuelle et la cécité due à la perte des cellules de détection de la lumière de la rétine, c’est-à-dire des photorécepteurs, représentent la principale raison de l’invalidité dans les pays industrialisés. Le remplacement des photorécepteurs dégénérés par la transplantation de cellules représente une option de traitement possible dans de futures applications cliniques. En effet, des études précliniques récentes ont démontré que les photorécepteurs immatures, isolés de la rétine néonatale de souris au jour postnatal 4, ont le potentiel de s’intégrer dans la rétine de souris adulte après une transplantation sous-rétinienne. Les cellules de distributeur ont généré une morphologie mûre de photorécepteur comprenant les segments intérieurs et externes, un corps rond de cellules situé à la couche nucléaire externe, et les bornes synaptiques à proximité des cellules bipolaires endogènes. En effet, des rapports récents ont démontré que les photorécepteurs donneurs s’intègrent fonctionnellement dans les circuits neuronaux des souris hôtes. Pour une future application clinique d’une telle approche de remplacement cellulaire, des suspensions purifiées des cellules de choix doivent être générées et placées à la position correcte pour une intégration appropriée dans l’œil. Pour l’enrichissement des précurseurs de photorécepteurs, le tri doit être basé sur des antigènes de surface cellulaire spécifiques afin d’éviter la modification du rapporteur génétique des cellules donneuses. Ici, nous montrons le tri cellulaire magnétique-associé (MACS) - enrichissement des précurseurs transplantables de photorécepteur de tige isolés de la rétine néonatale des souris rapporteurs photoréceptrices-spécifiques basées sur le marqueur de surface cellulaire CD73. L’incubation avec des anticorps anti-CD73 suivis des anticorps secondaires conjugués de micro-perle a permis l’enrichissement des précurseurs de photorécepteur de tige par MACS à approximativement 90%. Par rapport à la cytométrie en flux, macs a l’avantage qu’il peut être plus facile d’appliquer aux normes GMP et que des quantités élevées de cellules peuvent être triées dans des périodes relativement courtes. L’injection de suspensions cellulaires enrichies dans l’espace sous-rétinien de souris adultes de type sauvage a entraîné un taux d’intégration 3 fois plus élevé par rapport aux suspensions cellulaires non triées.

Afin d’évaluer la capacité des photorécepteurs de tige à s’intégrer dans la rétine de la souris, une ligne de rapporteur de souris a été utilisée, dans laquelle GFP est entraîné par la fermeture à glissière de leucine de la rétine neurale (Nrl, Nrl-GFP) promoteur11. Nrl est le premier marqueur de photorécepteurs de tige commençant son expression à E12.5 tout au long de l’âge adulte, permettant un étiquetage spécifique des cellules photoréceptrices de tige de donneur.
<p class="jo...

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Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénération rétinienne caractérisée par la perte de photorécepteur. Ici nous décrivons une méthode pour l’enrichissement des photorécepteurs transplantables et de leur greffe sous-rétinienne chez les souris adultes.

Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

subretinal-transplantation-macs-purified-photoreceptor-precursor

Research

JoVE Journal

Medicine

10.6K vues.  Technische Universität Dresden. La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénération rétinienne caractérisée par la perte de photorécepteur. Ici nous décrivons une méthode pour l’enrichissement des photorécepteurs transplantables et de leur greffe sous-rétinienne chez les souris adultes.

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Recherche

Médecine

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Décollement de la rétine modèle chez les rongeurs par injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Souris Transplantation rénale: Les modèles de rejet des allogreffes

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Orthotopique Hind Limb transplantation chez la souris

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A l&#39;étape par le protocole de l&#39;étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

Transplantation Dans le tapis de souris ovarien Fat

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Microscopie intravitale et thrombus induction dans le lobe de l&#39;oreille d&#39;une souris sans poils

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Blood Circuit Reconstruction in an Abdominal Mouse Heart Transplantation Model

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the established technique for a modified blood circuit reconstruction in a heterotopic abdominal heart transplantation model is presented. This method uses the intrathoracic inferior vena cava (IIVC) instead of the pulmonary artery of the donor heart for the anastomosis to the inferior vena cava of the recipient. It is facilitating and improving success rates for abdominal heart transplantation in mice.

A novel technique for blood circuit reconstruction in a heterotopic abdominal mouse heart transplantation model is demonstrated.

Reconstruction de circuit sanguin dans un modèle de transplantation de cœur de souris abdominale

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the ...