La blessure par arme blanche est une méthode de blessure mécanique qui induit une ablation cellulaire non spécifique. Cette méthode facilite l’évaluation de la prolifération et de la différenciation du CGR après une lésion cérébrale. Les blessures par arme blanche médiées par une aiguille sont une méthode simple et efficacement mise en œuvre pour induire une lésion cérébrale.
Cette méthode peut être appliquée à de nombreux échantillons expérimentaux à l’aide d’un ensemble standard d’outils. La capacité de régénération du poisson zèbre a été illustrée à l’aide du modèle des blessures par arme blanche. De nouvelles connaissances sur le mécanisme moléculaire régulant la régénération neuronale contribuent à la thérapie régénérative dans le système nerveux central.
Commencez par placer un poisson-zèbre adulte anesthésié ou un medaka sur un plateau en polystyrène. Fixez le poisson à la verticale entre deux aiguilles de calibre 30 insérées verticalement dans la mousse de polystyrène. Tenez le corps du poisson pour empêcher la tête du poisson de bouger, puis insérez verticalement une aiguille de calibre 30 à travers le crâne dans la région médiale de l’une des sphères du tectum optique.
Ensuite, transférez le poisson blessé dans un aquarium avec de l’eau fraîche de l’installation de poisson. Une fois que les poissons se sont complètement remis de l’anesthésie, déplacez le réservoir vers le système de reproduction. Mettez des serviettes en papier sur le plateau en polystyrène expansé pour placer le poisson anesthésié.
Ensuite, maintenez le corps du poisson en place en insérant verticalement deux aiguilles de calibre 30 de chaque côté de la nageoire anale. Une fois le poisson placé, faites une incision ventrale de l’anus au cœur. Gardez le cœur visible en insérant deux aiguilles de calibre 30 de chaque côté.
Utilisez ensuite la pointe de la pince pour enlever la couche épithéliale argentée. Insérez l’aiguille de calibre 30 dans le ventricule, en maintenant le biseau, et faites une incision dans l’oreillette à l’aide de la pince. Ensuite, poussez le PBS dans l’oreillette en appuyant sur la seringue pour évacuer le sang de l’oreillette.
Lorsque le sang est drainé et que les branchies deviennent blanches, arrêtez la perfusion PBS. Plus tard, retirez les aiguilles fixant le corps du poisson en place et fixez le côté ventral du poisson vers le bas. Après avoir coupé la moelle épinière et retiré le crâne du tectum optique et du télencéphale, coupez les nerfs optiques et disséquez le cerveau.
Ensuite, transférez les cerveaux dans des tubes de 1,5 millilitre avec un millilitre de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pour fixer pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les cerveaux fixes trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacun, transférez les cerveaux dans des tubes de 1,5 millilitre avec un millilitre de saccharose à 30% en poids en volume dans du PBS comme cryoprotecteur, et incuberez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Préparez le composé d’enrobage en combinant 30% de saccharose avec 30 millilitres de composé à température de coupe optimale, ou OCT, et stockez le composé à quatre degrés Celsius.
Pour refroidir le cryomoule une fois, incuber un bloc d’aluminium pendant la nuit à moins 80 degrés Celsius, et mettre le bloc pré-refroidi dans une boîte en polystyrène avec un couvercle pour éviter le réchauffement. Pour les coupes coronales, intégrez le cerveau disséqué dans un cryomoule en ajustant l’orientation à l’aide d’une pince au microscope. Ensuite, placez le cryomoule sur le bloc d’aluminium prérefroidi dans la boîte en polystyrène expansé et laissez le composé OCT geler et devenir blanc.
Lorsque le composé gèle, appliquez un petit cercle de composé OCT sur un disque d’échantillon avant de monter le cryobloc sur le disque de l’échantillon. En plaçant le disque de l’échantillon dans le cryostat, congeler le composé OCT. Placez ensuite le disque de l’échantillon sur la tête de l’échantillon dans le cryostat.
Après avoir défini l’orientation du cryobloc, coupez l’OCT pour supprimer toutes les régions supplémentaires. Découpez des sections en série de 14 micromètres d’épaisseur à travers tout le tectum optique à l’aide d’un cryostat et stockez les lames à moins 25 degrés Celsius. La prolifération des cellules gliales radiales, ou RGC, dans le tissu cérébral du poisson zèbre a été évaluée.
La plupart des CGR proliféraient de l’antigène cellulaire négatif dans l’hémisphère controlatéral non blessé. Deux jours après la blessure, la prolifération du CGR a été induite du côté blessé du tectum medaka. Après la lésion cérébrale, la lignée cellulaire et la différenciation du CGR ont été évaluées avec le marquage de la bromodésoxyuridine, ou BrdU.
L’analyse représentative montre les neurones nouveau-nés sept jours après la blessure chez le poisson-zèbre blessé et le medaka. L’une des étapes critiques des blessures par arme blanche est l’insertion manuelle de l’aiguille. Une blessure constante est nécessaire pour créer des résultats reproductibles.
Les colorants fluorescents sont efficaces comme marqueurs de plaie. L’étendue de la diffusion du colorant fluorescent indique l’emplacement et la profondeur de la blessure par arme blanche. Cette technique est potentiellement adaptée à d’autres espèces de petits poissons, et l’adaptation au medaka permet de comparer la capacité de régénération.
