Ce projet a été financé par la Fondation Samuel Roberts Noble. Les auteurs remercient Mss. Janie Gallaway et Colleen Elles excellente pour l&#39;entretien des plantes, et Mme Katie Brown pour les illustrations. Nous tenons également à remercier Mss. Trina Cottrell, Pooja Uppalapati, Moumita Saha, Swetha Vinukonda et M. Isaac Greenhut de l&#39;aide technique lors de l&#39;établissement de ce protocole.

1. croissance des plantes et Gene Silencing cible <ol><li> conditions de croissance des plantes: <ol><li> Semez N. benthamiana graines sur le sol moins mélange rempotage, Metro-Mix 350 et germer les graines dans une chambre de croissance. Toute autre sol ou hors-sol moyenne peuvent également être utilisés à la place de Metro-Mix. </li><li> Transplantés trois semaines vieux plants dans des pots individuels et les cultiver dans une serre maintenue à 21 ± 2 ° C ainsi que d&#39;autres conditions de croissance tels que détaillés dans la littérature précédente 12. Deux à trois jours après la transplantation, les plantes peuvent être utilisées pour TRV inoculation. </li></ol></li><li> Grandir TRV2 clones: TRV est un virus bipartite et son génome est constitué d&#39;ARN 1 et RNA2. ARN 1 code pour une ARN polymérase dépendante de l&#39;ARN et une protéine de mouvement 20,21. RNA2 code pour une protéine d&#39;enveloppe (CP) et deux protéines non-structurales partir des ARN sous-génomique 21. Les deux ARN1 et RNA2 sont nécessaires pour la formation de vir mûriNous particules et leur propagation 20,21. construction d&#39;une banque d&#39;ADNc dans TRV2 vecteur est décrit dans la littérature précédente 22,23. En bref, bibliothèque VIGS utilisé dans cette étude a été construit à partir de l&#39;ARN extrait à partir de tissus foliaires exposées à divers éliciteurs biotiques et abiotiques. <ol><li> Sortez Agrobacterium (souche GV2260) contenant les clones d&#39;ADNc dans TRV2 vecteur (une plaque de 96 puits) du congélateur. Peu à peu, les décongeler et après les cultures atteignent la température ambiante, inoculer la culture Agrobacterium individu sur Luria-Bertani (LB) de plaque de gélose avec la rifampicine (10 mg / ml) et à la kanamycine (50 pg / ml) en utilisant un réplicateur de 96 broches. </li><li> Incuber les plaques à 28 ° C pendant deux jours. Nous cultivons habituellement quatre colonies identiques pour chaque clone de sorte que inoculum Agrobacterium adéquat est disponible pour piquer inoculation de deux usines. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles. </li></ol></li><li> VIGS: <ol><li> CroîtreAgrobacterium (GV2260) portant TRV1 à 28 ° C en milieu liquide LB avec des antibiotiques mentionnés ci-dessus. Récolte des cellules par centrifugation des cultures cultivées pendant une nuit, remettre en suspension dans le tampon d&#39;inoculation (10 mM MES, pH 5,5, 200 uM acétosyringone), et incuber pendant 3 heures à température ambiante sur un agitateur à 50 tours par minute. </li><li> Récolter les cellules par centrifugation et remettre en suspension dans du tampon MES 5 mM (pH 5,5) et inoculer (DO600 = 0,3) dans le côté abaxial de 3-4 N. benthamiana feuilles à l&#39;aide d&#39;une seringue sans aiguille. Procédure d&#39;inoculation détaillée est démontré dans la littérature précédente 24. Plus tard, sur le site de TRV1 inoculation, inoculer TRV2 colonies respectives en piquant les feuilles avec un cure-dent. </li><li> Maintenir les plantes avec une nutrition adéquate, la croissance vigoureuse est important pour VIGS efficaces 12. Environ deux semaines après l&#39;inoculation, les transcriptions des gènes ciblés vont commencer à diminuer et les plantes sont prêtes pour le CONI pathogènelation à trois semaines après inoculation VRT. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des cultures non hôtes pathogènes et l&#39;inoculation des plantes <ol><li> Détails de pathogènes utilisés dans cette étude: Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea et Xanthomonas campestris pv. vesicatoria sont utilisés dans cette étude. Cultivez P. souches syringae dans B King (KB) milieu liquide supplémenté avec la rifampicine (10 mg / ml), à la kanamycine (50 pg / ml) à 28 ° C pendant 12 heures. Cultivez X. campestris pv. vesicatoria en milieu liquide LB pendant 16 heures. Tous les agents pathogènes hébergent un plasmide qui peut exprimer GFPuv comme décrit dans la littérature précédente 19. </li><li> Préparation des cultures pathogènes pour l&#39;inoculation de la plante: <ol><li> Récolter les cellules bactériennes par centrifugation et confirmer la présence de fluorescence verte à l&#39;aide de CapelongueLampe UV velength dans l&#39;obscurité. Laver les cellules deux fois avec de l&#39;eau stérile et remettre en suspension à la concentration voulue avec de l&#39;eau stérile. </li><li> Inoculer le pathogène respectif (s) sur le côté abaxial de gène cible feuilles réduites au silence (5 e à 8 e) que les taches (environ 1,5 cm diamètre). Plusieurs agents pathogènes non hôtes peuvent être testés simultanément pour leur croissance dans les gènes des plantes silencieux cibles. Simultanément inoculer le hôte-pathogène, car cela peut être utilisé comme un contrôle positif pour la visualisation de la croissance bactérienne planta. Aussi inoculer le contrôle de vecteur (TRV :: 00) plantes. </li></ol></li></ol> 3. Observation des in planta croissance des bactéries pathogènes <ol><li> Exposer les feuilles inoculées à une lumière UV de grande longueur d&#39;onde dans l&#39;obscurité. Les colonies bactériennes peuvent être considérés comme points fluorescents verts dans le côté abaxial de la feuille dans le fond de la fluorescence rouge émise par la surface de la feuille. </li><li> Observer la croissance des pathogènesde 2 jours après l&#39;inoculation (ppp) à 5 dpi. L&#39;observation de tous les jours pendant cet intervalle de temps est nécessaire. </li><li> Après le premier écran, la sélection des clones dont les silencing entraîne la croissance d&#39;un ou plusieurs agent pathogène non hôte (s). </li><li> Répétez VIGS pour les clones sélectionnés et encore tester la réponse des gènes des plantes silencieux à des agents pathogènes non hôte (s). Ce deuxième niveau de contrôle est fait pour éliminer les faux positifs obtenus au cours du premier écran. </li></ol> 4. Confirmation des plantes présélectionnés pour Résistance non hôte compromise <ol><li> Taire les clones d&#39;ADNc sélectionnées sur l&#39;écran, comme décrit ci-dessus. Inoculer toute la plante avec pathogène non hôte (s) en immergeant les plantes avec des cultures pathogènes respectifs avec 0,01% (v / v) Silwet L-77 et en soumettant les plantes submergées à vide pendant 3 - 5 min. Quantifier la croissance bactérienne par dosage de croissance conventionnel 6,18,19 comme décrit ci-dessous. </li><li> À 0 h après inoculation (HPI),3 et 5 dpi dpi, recueillir deux échantillons de feuilles de cinq répétitions biologique pour chaque agent pathogène non hôte (s) de feuilles inoculées à l&#39;aide d&#39;un poinçon feuille (0,5 cm 2). Broyer les échantillons de feuilles, de série diluée et la plaque de la sève sur gélose KB complété avec des antibiotiques appropriés et incuber à 28 ° C pendant 2 jours. Comptez le nombre de colonies bactériennes en utilisant un compteur de colonies et calculer la croissance bactérienne dans les feuilles telles que décrites dans la littérature précédente 6. </li><li> Plantes sensibles aux agents pathogènes de non hôte (s) devraient montrer un nombre plus élevé de la croissance des pathogènes par rapport à la lutte antivectorielle. </li></ol> 5. Le séquençage de l&#39;insert et identification de gène cible <ol><li> Effectuer colonie PCR pour le clone sélectionné à l&#39;aide attB1 et attB2 amorces ou en utilisant les amorces flanquant le site de clonage dans le vecteur TRV2. Exécutez le produit PCR sur le gel et vérifier pour l&#39;amplification de la bande unique. </li><li> insertion de gènes des plantes dans le vecteur TRV2 peut être séquencé à l&#39;aide attBamorces ou amorces flanquant le site de clonage. </li><li> Effectuer BLAST en utilisant la séquence et identifier les détails de gènes. </li><li> Obtenir séquence du gène pleine longueur avec les régions non traduites (UTR). </li><li> Sélectionnez 300-400 pb fragments de trois régions différentes de la séquence et de les cloner dans TRV2 vecteur. Effectuer indépendamment VIGS en utilisant tous les trois constructions de VIGS et confirmer le compromis de résistance non hôte dans les trois usines réduits au silence des gènes. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonhost+resistance:+how+much+do+we+know.">Nonhost resistance: how much do we know.</a> Trends in Plant Science. 9, 97-104 (2004).</li><li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+nonhost+disease+resistance:+can+they+assist+disease+control+in+agriculture.">Insights into nonhost disease resistance: can they assist disease control in agriculture.</a> The Plant Cell. 18, 523-528 (2006).</li><li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolate+oxidase+plays+a+major+role+during+nonhost+resistance+responses+by+modulating+reactive+oxygen+species+mediated+signal+transduction+pathways.">Glycolate oxidase plays a major role during nonhost resistance responses by modulating reactive oxygen species mediated signal transduction pathways.</a> The Plant Cell. 24, 336-352 (2012).</li><li>Daurelio, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+novel+genes+involved+in+nonhost+response+to+bacterial+infection+in+tobacco.">Transcriptome analysis reveals novel genes involved in nonhost response to bacterial infection in tobacco.</a> Journal of Plant Physiology. 168, 382-391 (2011).</li><li>Moreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDS1+contributes+to+nonhost+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+against+Erwinia+amylovora.">EDS1 contributes to nonhost resistance of Arabidopsis thaliana against Erwinia amylovora.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 421-430 (2012).</li><li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+can+persist+for+more+than+2+years+and+also+be+transmitted+to+progeny+seedlings+in+Nicotiana+benthamiana+and+tomato.">Virus-induced gene silencing can persist for more than 2 years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 797-806 (2011).</li><li>Bombarely, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Nicotiana+benthamiana+to+enhance+molecular+plant-microbe+biology+research.">A draft genome sequence of Nicotiana benthamiana to enhance molecular plant-microbe biology research.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 1523-1530 (2012).</li><li>Sharma, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+silencing+of+WIPK+and+SIPK+genes+reduces+resistance+to+a+bacterial+pathogen,+but+has+no+effect+on+the+INF1-induced+hypersensitive+response+(HR)+in+Nicotiana+benthamiana.">Virus-induced silencing of WIPK and SIPK genes reduces resistance to a bacterial pathogen, but has no effect on the INF1-induced hypersensitive response (HR) in Nicotiana benthamiana.</a> Mol Gen Genomics. 269, 583-591 (2003).</li><li>Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+forward+genetics+based+on+virus-induced+gene+silencing.">Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing.</a> Current Opinion in Plant Biology. 2, 109-113 (1999).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO Journal. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPKKK[alpha]+is+a+positive+regulator+of+cell+death+associated+with+both+plant+immunity+and+disease.">MAPKKK[alpha] is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease.</a> EMBO Journal. 23, 3072-3082 (2004).</li><li>Wang, K., Senthil-Kumar, M., Ryu, C. -. M., Kang, L., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytosterols+play+a+key+role+in+plant+innate+immunity+against+bacterial+pathogens+by+regulating+nutrient+efflux+into+the+apoplast.">Phytosterols play a key role in plant innate immunity against bacterial pathogens by regulating nutrient efflux into the apoplast.</a> Plant Physiology. 158, 1789-1802 (2012).</li><li>Wang, K., Kang, L., Anand, A., Lazarovits, G., Mysore, K. 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C., Chakravarthy, S., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+(VIGS)+in+Nicotiana+benthamiana+and+tomato.">Virus-induced gene silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and tomato.</a> J. Vis. Exp. (28), e1292 (2009).</li><li>Peart, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligase-associated+protein+SGT1+is+required+for+host+and+nonhost+disease+resistance+in+plants.">Ubiquitin ligase-associated protein SGT1 is required for host and nonhost disease resistance in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99. , 99-10869 (2002).</li><li>Oh, S. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+Types+I+and+II+nonhost+resistance+using+expression+patterns+of+defense-related+genes+in+tobacco.">Insight into Types I and II nonhost resistance using expression patterns of defense-related genes in tobacco.</a> Planta. 223, 1101-1107 (2006).</li><li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K., Kodama, H., Komamine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+and+Plant+Gene+Function+Analysis.">RNAi and Plant Gene Function Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 744, 13-25 (2011).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

l&#39;immunité des plantes limite la croissance des agents pathogènes non hôtes et, par conséquent, peu ou pas de fluorescence verte est émise à partir de plantes de lutte antivectorielle feuilles inoculées avec des agents pathogènes non hôte sous une lumière UV de grande longueur d&#39;onde (figure 3D). Cependant, quand un gène impliqué dans la résistance non hôte est réduit au silence, le gène silencieux plantes favorisent la croissance des agents pathogènes et de fluorescence verte n...

résistance non hôte est la résistance de toutes les espèces végétales contre les courses d&#39;un 1,2 pathogène particulier. Ceci confère à large spectre et une résistance durable aux maladies dans les plantes 2,3. Cependant, son mécanisme, en particulier contre les bactéries pathogènes, n&#39;est pas bien comprise 4. Dépistage des mutants ou des plantes silencieux que la résistance non hôte de compromis et de haute profilage de transcription d&#39;débit pour l&#39;identification de gènes exprimés de manière différentielle au cours de la résistance non hôte 5-9 sont deux grandes approches utilisées auparavant pour disséquer résistance non hôte bactérien. Parce que la résistance de non hôte est contrôlé par un mécanisme complexe (s) 4, avec la participation de nombreux gènes, une approche de génomique fonctionnelle à haut débit pour l&#39;identification des gènes est essentielle pour mieux comprendre le mécanisme de résistance non hôte (s). Induite par le virus gene silencing (VIGS) a été utilisée avec succès pour réduire au silence végétal endogènegènes dans de nombreuses espèces végétales. 10,11 Nicotiana benthamiana est l&#39;une des meilleures plantes adaptées pour VIGS 10,12 et sa séquence du génome du projet est maintenant disponible 13. virus rattle du tabac (TRV) à base VIGS a été largement utilisé comme outil génétique inverse pour caractériser les gènes impliqués dans la résistance non hôte 2,4,14. Cette VIGS vecteurs et les dérivés sont maintenant disponibles à travers Arabidopsis Centre de Ressources Biologiques (CARL, <a href="http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html</a> ). VIGS a également été utilisé comme un outil génétique en avant pour l&#39;identification des gènes impliqués dans l&#39;immunité des plantes 15-17, la résistance non hôte particulier 6,18. Évaluation de la réponse hypersensible (HR) médiée par la mort cellulaire induite par les plantes contre un agent pathogène non hôte spécifique et l&#39;évaluation de la mort cellulaire induite par la maladie sont deux grands essais principalement utilisés pour IDENTIFIERg gène susceptible plantes silence. Cependant, la mort cellulaire HR est induite seulement contre de type II non hôtes pathogènes et non contre du type I non hôtes pathogènes 2. Par conséquent, les tests RH ne peuvent pas être universellement utilisés pour identifier les stratégies de résistance non hôtes utilisés par les plantes, en particulier contre vaste gamme de type I non hôtes pathogènes. En outre, la perte partielle de la résistance non hôte dans une usine taire des gènes ne conduit pas toujours à des symptômes de la maladie 6 et donc la notation de la maladie ne peut pas être utilisé pour l&#39;identification des plantes compromettre la résistance non hôte. En revanche, l&#39;évaluation de la croissance des agents pathogènes non hôtes dans les gènes des plantes silencieux est une meilleure méthode pour étudier la perte de résistance non hôte dans le gène plantes silencieux. Par rapport aux test de croissance conventionnel 6,19, une méthode plus rapide pour évaluer la croissance bactérienne non hôte sur les gènes des plantes silencieux peut raccourcir le temps nécessaire pour avancer génétique dépistage. Nous avons déjà signalé une méthode pour observer les bactériesL lumière de la croissance des pathogènes sur des feuilles à l&#39;oeil nu sous ultraviolet (UV) en utilisant des bactéries exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) 19. Dans ce manuscrit, nous démontrons l&#39;utilité de GFPuv exprimer pathogènes bactériens non hôte pour faciliter l&#39;identification des gènes des plantes silencieuses qui sont compromises pour la résistance non hôte. Cette méthode est précise pour l&#39;identification des plantes sensibles et prête pour le criblage à haut débit.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well U-bottom plates</td>
 <td> Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
 <td> 35-3077</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-pin replicator stainless steel</td>
 <td> Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)</td>
 <td> 250520</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap</td>
 <td> Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)</td>
 <td> 6283K50</td>
 <td> Manufacturer ID 95-0127-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Stuart SC6 colony counter</td>
 <td> Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK</td>
 <td> SC6PLUS</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350</td>
 <td> SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Primers: 
 attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) 
 attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)</td>
 <td> Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)</td>
 <td> Custom synthesized</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> MES, Monohydrate</td>
 <td> VWR international (Radnor, PA, USA)</td>
 <td> CAS No. 145224-94-8</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetosyringone (Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone)</td>
 <td> Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
 <td> D134406</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Vac-In-Stuff (Silwet L-77)</td>
 <td> Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)</td>
 <td> VIS-30</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

vigs-mediated forward genetics screening for identification of genes involved in nonhost resistance

la résistance aux maladies non hôte des plantes contre les pathogènes bactériens est contrôlé par des voies de défense complexes. La compréhension de ce mécanisme est important pour le développement de plantes résistantes aux maladies durables contre la large gamme d&#39;agents pathogènes. Induite par le virus gene silencing (VIGS) basée en avant génétique dépistage est une approche utile pour l&#39;identification de gènes de défense des plantes conférer une résistance non hôte. Virus rattle du tabac (TRV) à base de vecteur VIGS est vecteur de VIGS la plus efficace à ce jour et a été utilisé efficacement pour faire taire des gènes cibles endogènes dans Nicotiana benthamiana. Dans ce manuscrit, nous démontrons une approche de dépistage génétique avant pour réduire au silence des clones individuels à partir d&#39;une banque d&#39;ADNc dans N. benthamiana et évaluer la réponse des gènes des plantes silencieux pour compromis résistance non hôte contre les agents pathogènes non hôtes, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. GlycINEA et X. campestris pv. vesicatoria. Ces bactéries pathogènes sont conçus pour expriment la protéine GFPuv et leurs colonies fluorescents verts peuvent être vus à l&#39;oeil nu sous la lumière UV dans les non hôte d&#39;agents pathogènes des plantes inoculées si le gène cible silence est impliqué dans la transmission de la résistance aux non hôte. Cela facilite l&#39;identification fiable et rapide des gènes des plantes silencieux sensibles aux pathogènes non hôtes. En outre, les informations de gène candidat prometteur peut être connu par séquençage de l&#39;insert de gène de plante dans TRV vecteur. Ici, nous démontrons la capacité haut débit de la génétique avant VIGS-médiation pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte. Environ 100 ADNc peuvent être réduits au silence individuellement dans environ deux à trois semaines et leur pertinence dans la résistance non hôte contre plusieurs pathogènes bactériens non hôte peut être étudiée en une semaine par la suite. Dans ce manuscrit, nous énumérons les étapes détaillées impliqués dans ce dépistage. Avant VIGS à médiation génétique screening approche peut être étendue non seulement à l&#39;identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte, mais aussi à l&#39;étude des gènes conférant plusieurs tolérances de stress biotiques et abiotiques dans diverses espèces végétales.

L&#39;objectif majeur de cette étude est de démontrer une méthode pour l&#39;identification facile et précise d&#39;un gène silencieux N. benthamiana qui sont compromises pour la résistance non hôte. Il ya quatre grandes étapes de cette méthodologie. La première étape est de faire taire individuellement grand nombre de gènes en utilisant TRV-VIGS. Nous avions fait taire environ 5.000 gènes 6,18 sur une période d&#39;environ 1,5 ans en utilisant le protocole décrit à la figure ...

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VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Induite par le virus gene silencing est un outil utile pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte des plantes. Nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;agents pathogènes bactériens exprimant GFPuv dans l&#39;identification des gènes des plantes silencieux sensibles aux pathogènes non hôtes. Cette approche est simple, rapide et facilite le dépistage à grande échelle et un protocole similaire peut être appliquée à l&#39;étude de divers autres interactions plantes-microorganismes.

VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l&#39;identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K vues.  The Samuel Roberts Noble Foundation.  Induite par le virus gene silencing est un outil utile pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte des plantes. Nous démontrons l'utilisation d'agents pathogènes bactériens exprimant GFPuv dans l'identification des gènes des plantes silencieux sensibles aux pathogènes non hôtes. Cette approche est simple, rapide et facilite le dépistage à grande échelle et un protocole similaire peut être appliquée à l'étude de divers ...

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

Dépistage ARNi pour les facteurs de l&#39;hôte impliqués dans Vaccine</emVirus Infection> aide Drosophile Cellules

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Recherche

Immunologie et infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Génétique inverse de récupération des norovirus murin médiation infectieuses

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Approches avant génétiques dans<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identification de nouveaux gènes associés à la production d&#39;alginate dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilisation de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenèse Mariner Transposon médiation

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Génétique écrans à l&#39;aide pour identifier les macrophages<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; gènes importants pour la résistance à l&#39;IFN-γ-cellulaire dépendant immunité autonome

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.