Ces travaux ont été financés par la subvention discovery project de l’Australian Research Council Federation #1096623.

1. Création du vecteur de recombinaison
<ol><li>Identifier les régions d’homologie flanquantes de 150 pb de long (appelées bras gauche et droit) nécessaires pour étiqueter le gène viral d’intérêt de manière terminale ou C (voir la figure 1b).</li>
	<li>Concevoir une séquence d’oligonucléotides comprenant les bras gauche et droit de 150 points d’ébullition séparés par une paire de sites de restriction de choix. Cette séquence entière doit également être flanquée d’une deuxième paire de sites de restriction (différente de la première paire) pour permettre l’incorporation dans le vecteur TDS une fois synthétisée. Veillez lors de la conception de l’oligonucléotide avec des sites de restriction que les séquences sont dans le cadre avec le site d’insertion souhaité.</li>
	<li>Incorporer des sites de restriction entre les bras gauche et droit lors de la conception de l’oligonucléotide pour la synthèse, qui doit correspondre à ceux flanquant le cadre de lecture ouvert de l’étiquette fluorescente de choix (voir figure 1b). Il est possible d’utiliser un site de restriction NotI comme un linker à trois acides aminés entre le bras gauche et le début de l’étiquette fluorescente.</li>
	<li>Incorporer ces mêmes sites de restriction de part et d’autre de l’étiquette fluorescente par PCR (voir figure 1c).</li>
	<li>Clonez le fragment synthétisé dans le vecteur TDS.</li>
	<li>Cloner l’étiquette fluorescente dans le vecteur de recombinaison résultant à l’aide des sites de restriction entre les régions d’homologie du bras gauche et droit (voir la figure 1d).</li>
</ol>2. Génération de virus recombinants
<ol><li>Conformément à la figure 2,infecter une monocouche de cellules BS-C-1 avec le virus de la vaccine dans des milieux sans sérum à une multiplicité d’infection (MOI) > 1.</li>
	<li>1 heure post-infection, cellules de sauvetage avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et transfect avec un mélange de plasmide vectoriel de recombinaison et de réactif de transfection dans un rapport de 3:1 dans des milieux sans sérum.</li>
	<li>Après 24 heures, grattez et récupérez les cellules dans le DMEM ne contenant pas de sérum fœtal bovin (FBS) et effectuez trois cycles de gel-dégel pour briser les cellules ouvertes et libérer des particules virales.</li>
	<li>Effectuer un essai de plaque avec une superposition liquide de 10 % de réactifs de sélection FBS DMEM et GPT, comme suit :<ol>
<li>Ensemencez une plaque de 6 puits avec une monocouche de cellules BS-C-1.</li>
		<li>Infecter les monocouches de cellules 100% confluentes avec des dilutions en série des cellulesgelées contenant des particules virales pour assurer une séparation adéquate des plaques individuelles.</li>
		<li>Recouvrur de liquide à 10 % de FBS contenant du DMEM contenant les réactifs de sélection gpt - acide mycophénolique et xanthine à des concentrations finales de 25 μg/ml et 250 μg/ml respectivement.</li>
	</ol></li>
	<li>Après une incubation de 24 heures, retirez la couche liquide et utilisez un microscope fluorescent pour rechercher des plaques présentant une fluorescence rouge diffuse correspondant à l’incorporation de mCherry du vecteur TDS dans le virus. En fonction du gène cible et de l’étiquette fluorescente choisie, une fluorescence localisée du gène marqué peut également être observée dans la même plaque rouge.</li>
	<li>Choisissez plusieurs plaques pour chaque virus recombinant en grattant localiséement avec une pointe de pipette et 100 μl de FBS à 5% contenant du DMEM pour transférer les cellules dans un tube Eppendorf, suivi de trois séries de gel-décongélation de cellules raclées pour libérer des virus recombinants.</li>
	<li>Ajouter le virus DMEM contenant le virus congelé-décongelé à une monocouche de cellules dans une plaque de 12 puits pour amplifier les virus recombinants avec des réactifs de sélection GPT dans le milieu de croissance. Gratter les amplifications réussies 24 heures après l’infection.</li>
	<li>Effectuez un test de plaque de plaques amplifiées avec succès présentant une fluorescence rouge, cette fois avec une superposition d’agarose et une sélection GPT, comme suit:<ol>
<li>Ensemencez une plaque de 6 puits avec une monocouche de cellules BS-C-1.</li>
		<li>Effectuer une dilution en série des virus recombinants et infecter les puits avec une dilution croissante des virus dans le DMEM libre de FBS.</li>
		<li>1 heure après l’infection, retirer le milieu liquide et superposer chaque puits avec 0,5 % d’agarose dans un milieu essentiel minimal (MEM) contenant 2,5 % de FBS, 292 μg/ml de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, ainsi que les réactifs de sélection gpt.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 jours après l’infection, choisissez des plaques affichant une fluorescence à la fois rouge et la couleur de l’étiquette fluorescente choisie pour amplifier à nouveau, cette fois sans sélection GPT.</li>
	<li>Effectuez le prochain test de plaque avec une superposition d’agarose sans sélection.</li>
	<li>Choisissez les plaques qui ont perdu leur fluorescence rouge diffuse mais conservez la fluorescence localisée correspondant à l’étiquette de choix.</li>
	<li>Continuer à purifier la plaque sans sélection pour obtenir un stock pur de virus recombinants qui ont perdu les gènes de sélection mCherry et gpt mais conservent la fluorescence localisée correspondant à la balise choisie. Vérifiez que les stocks sont purs par dosage de plaque, toutes les plaques doivent avoir un phénotype de plaque similaire.</li>
	<li>Utiliser le criblage PCR de l’ADN génomique pour s’assurer que les stocks viraux sont purs.<ol>
<li>Concevoir des amorces qui flanquent le site d’insertion du gène fluorescent et des amorces qui amplifient le gène fluorescent inséré lui-même. Différentes combinaisons de ces amorces produiront des amplicons PCR qui détecteront l’insertion de gènes et indiqueront la pureté.</li>
		<li>Amplifier les stocks viraux à filtrer par PCR dans un puits d’une monocouche de plaques de 12 puits de cellules BS-C-1.</li>
		<li>24 heures après l’infection, gratter les cellules infectées en 250 μl de DMEM.</li>
		<li>Centrifuger les cellules infectées (18 000 x g pendant 10 min, 4 °C), éliminer le surnageant et ressusciter les pastilles cellulaires dans 500 μl TE (Tris-HCl 10 mM et EDTA 1 mM, pH 8) avec une FDS de 0,1 % (v/v). Vortex pour lyser les cellules.</li>
		<li>Ajouter 500 μl d’acohol phénol-chloroforme-isoamyl, inverser pour mélanger. Centrifugeuse (18 000 x g pendant 4 min, 4 °C). Prenez le surnageant et répétez.</li>
		<li>Effectuer une précipitation d’éthanol sur le surnageant en ajoutant 1 ml d’éthanol à 100% (réfrigéré) et 50 μl d’acétate de sodium, inversé pour mélanger.</li>
		<li>Laisser passer à -20 °C pendant la nuit ou -80 °C pendant 1 h. Centrifuger (18 000 x g pendant 30 min, 4 °C), éliminer tout liquide et laisser sécher l’ADN précipité à l’air. Remise en suspension dans 50 μl TE.</li>
		<li>Utilisez-le comme modèle pour le dépistage par PCR de l’ADN génomique.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Génération de virus recombinants portant plus d’une étiquette
<ol><li>Co-infection de la même monocouche cellulaire avec des virus recombinants fluorescents pour créer des virus à double ou triple étiquette ou répéter la procédure du protocole 1) avec une étiquette différente.</li>
	<li>Purifier les virus à partir du phénotype de la plaque ou du dépistage par PCR de l’ADN génomique de l’isolat de virus.</li>
</ol>

<ol>
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Aucun conflit d’intérêts déclaré.

Cette technique décrit un protocole efficace et modulaire pour la création de virus recombinants qui expriment des protéines virales marquées par fluorescence. La méthode garantit que le seul changement apporté au génome viral est l’ajout d’une étiquette ou d’un marqueur, ne laissant derrière lui aucun marqueur de sélection. La courte longueur de bras requise pour la recombinaison homologue permet sa synthèse directe, éliminant plusieurs cycles chronophages de PCR et de clonage, tandis que la fluorescence de mCherry et la sélection métabolique GPT sont utilisées pour isoler les intermédiaires de recombinaison virale. Ces intermédiaires peuvent être résolus, après la suppression de la sélection, en un virus avec un gène marqué ou de retour au type parental. Une méthode similaire impliquant l’utilisation de la sélection fluorescente et métabolique a été décrite précédemment27 bien que la méthode utilisée dans cette étude utilise des régions plus courtes et synthétisées d’homologie, permettant l’identification du virus recombinant désiré par imagerie de la fluorescence du gène marqué d’intérêt. Cette sélection secondaire ne s’applique qu’au marquage de gènes viraux hautement exprimés qui produisent une fluorescence suffisante dans un essai de plaque. Alternativement, on pourrait envisager l’insertion d’une cassette d’expression complète, par exemple une protéine fluorescente sous un promoteur viral fort. Dans ce cas, les bras gauche et droit définiraient le point d’insertion plutôt que le gène viral à marquer.
Certaines étapes clés se sont avérées utiles au cours de la procédure expérimentale. La superposition liquide de l’étape 2.3.3 décrite ci-dessus s’est avérée cruciale pour la détection et l’isolement des plaques fluorescentes rouges/vertes. Nous croyons que la combinaison des réactifs de sélection GPT et de la superposition d’agarose a dissuadé la croissance des virus recombinants et est donc passée à une superposition liquide pour la première étape de l’amplification des virus après transfection. Il est également important de choisir des plaques fluorescentes montrant une fluorescence localisée de la couleur de l’étiquette pour l’enrichissement et la purification, car les intermédiaires résultant de la recombinaison du bras gauche peuvent entraîner une fluorescence diffuse observée dans les plaques si le bras gauche contient également une séquence promotrice. Le gène marqueur mCherry dans le vecteur TDS peut également être remplacé par gfp,par exemple, pour permettre l’incorporation et la sélection faciles de mCherry comme une étiquette fluorescente.
Certaines techniques décrites ci-dessus diffèrent légèrement des méthodes établies de création du virus de la vaccine recombinante. Par exemple, le MOI du virus utilisé pour créer des recombinants est normalement inférieur à 128, mais l’utilisation de MOIs plus élevés a été suffisante pour la création du virus de la vaccine recombinante par cette méthode. L’utilisation de réactifs de sélection GPT nécessite normalement une préincubation des cellules avec des réactifs de sélection18,mais leur ajout lors de la phase de sauvetage post-infection a tout de même fourni une sélection suffisante de recombinants souhaités, en particulier en raison de la présence d’un marqueur de sélection fluorescent.
Comme mentionné précédemment, l’une des limites de cette technique est que l’étape de sélection de la fluorescence secondaire repose sur la protéine d’intérêt marquée étant fortement exprimée, à un niveau qui permet sa détection par l’œil dans un dosage de plaque. Sans cela, il serait possible de purifier les virus qui ne présentent que la fluorescence mCherry, dont au moins 50% contiendraient les virus recombinants souhaités, qui pourraient être identifiés par des stratégies moléculaires telles que la PCR décrite à l’étape 2.12 ci-dessus. Une autre limitation pourrait être l’inactivation de certaines protéines à la suite de leur marquage. L’étiquette fluorescente peut subir des mutations ou être excisée par le virus recombinant avec passaging au fil du temps. Par conséquent, un échantillonnage régulier des stocks de virus recombinants par microscopie et PCR est recommandé. Enfin, il peut y avoir une limite au nombre de protéines marquées par fluorescence qui peuvent être incorporées dans un seul virus. Un aspect de ceci est la possibilité de les visualiser tous simultanément; étant donné la nature de chevauchement des spectres d’émission des étiquettes fluorescentes disponibles, il est important de les sélectionner avec soin pour assurer un fond perdu spectral minimal. En outre, l’utilisation de balises étroitement liées telles que GFP et Cerulean ouvre la possibilité d’une recombinaison entre les deux, en fonction de leur emplacement dans le génome recombinant.
La nature modulaire de cette technique permet la substitution simple d’étiquettes fluorescentes en fonction de la compatibilité avec d’autres choix de coloration et/ou d’étiquettes. En éliminant les marqueurs sélectionnables, la méthode TDS permet l’ajout en série de diverses protéines fluorescentes ou la combinaison du marquage à base de TDS avec des délétions de gènes à base de TDS pour des analyses phénotypiques29. À titre d’exemple de l’utilité de cette approche, un virus fluorescent à double marquage qui marque les cœurs de virus et la membrane WV a été généré. Les études d’imagerie avec ce virus pourraient être utilisées pour étudier le mouvement, la morphogenèse et l’enveloppement du virus pendant la réplication du virus. Jusqu’à présent, des protéines virales de vaccinia non caractéristiques peuvent également être marquées et étudiées par cette technique.
Le virus de la vaccine a été largement utilisé dans les études d’imagerie en raison de nombreuses caractéristiques du virus qui sont favorables à la microscopie à cellules vivantes. Les étiquettes fluorescentes sont exprimées à partir du génome viral, éliminant le besoin de transfection, permettant aux cellules primaires dérivées d’animaux infectés ou de cellules non transmissibles d’être facilement analysées. Initialement, les VCA fluorescents ont été utilisés pour le suivi subcellulaire simple du mouvement du virus30,mais des approches plus récentes ont élargi leur utilité pour inclure les études FRET31,le FRAP à des particules virales uniques32,les reporters promoteurs33,l’imagerie intravitale34et les études structurelles35-37. Toutes ces techniques pourraient être plus faciles et plus proches couplées à cette méthode de création de virus fluorescents recombinants.

Le virus de la vaccine (VCA) est le poxvirus prototypique et fortement apparenté au virus de la variole, l’agent causal de la variole. Ces deux virus sont membres du genre orthopox qui comprend d’autres agents pathogènes notables tels que la variole du singe et le virus ectromelia (mousepox)1. Les orthopoxvirus ont de grands génomes d’ADN double brin (180-220 kb) qui codent plus de 200 cadres de lecture ouverts prédits2,3. La réplication de ces virus implique la formation d’une usine de virus périnucléaires, où des virus matures (MV) sont fabriqués, et du réseau trans-Golgi où un sous-ensemble de MV acquiert deux membranes supplémentaires pour générer des virus enveloppés (WV) (examiné par Roberts et Smith4). Les génomes orthopox sont très sensibles à la manipulation génétique en raison du degré élevé de recombinaison génétique qui est une caractéristique de la réplication du génome VACV et est médiée par l’ADN polymérase virale5. La génération de virus recombinants repose sur une recombinaison homologue et des molécules d’ADN linéaires avec des homologies aussi petites que 12 pb étant suffisantes pour arbitrer la recombinaison dans les cellules infectées par le virus de la vaccine6. Le étiquetage fluorescent du virus de la vaccine peut produire des particules virales extrêmement brillantes en raison de la grande taille des particules d’orthopox, ce qui permet l’incorporation de nombreuses protéines fluorescentes par virion7. La vaccine a la capacité de transporter de gros fragments d’ADN étranger8 et de plus, l’absence de symétrie rigide des capsides peut permettre un certain degré de flexibilité lors de l’expression de fusions de gènes de protéines virales à partir de leurs loci endogènes9. Le marquage fluorescent des protéines VACV s’est avéré inestimable pour l’étude des interactions hôte-pathogène au niveau subcellulaire, en particulier dans le domaine de l’entrée du virus10,du transport11-13,et de la morphogenèse, en particulier des virions enveloppés7.
Les virus recombinants peuvent être sélectionnés par le sauvetage d’un phénotype de croissance atténuée14,15,la sélection métabolique16-18,ou par l’expression d’un gène marqueur(par exemple X-gal19 ou protéine fluorescente13,20). Nous décrivons ici la sélection de virus fluorescents à l’aide d’une puissante combinaison de sélection fluorescente et métabolique. Les vecteurs de sélection dominante transitoire (TDS), développés par Faulkner et Moss (1990)21, permettent d’intégrer les marqueurs avec le gène d’intérêt marqué par fluorescence souhaité. Lorsque la sélection métabolique est supprimée, un événement de recombinaison secondaire peut se produire qui excise les gènes de sélection, mais laisse intacte la protéine virale marquée par fluorescence. La figure 2 ci-dessous donne un aperçu de la procédure expérimentale. Les gènes de sélection utilisés dans cette étude sont mCherry et le gène Escherichia coli guanine phosphoribosyltransférase(gpt),tous deux exprimés à partir d’un promoteur viral synthétique précoce/tardif et utilisés précédemment par Cordeiro et al. 22 En outre, il existe une fluorescence de la protéine de fusion marquée d’intérêt. Lorsque la sélection métabolique est supprimée, les marqueurs sélectionnables (mCherry et gpt) sont excisés, ne laissant que la fluorescence du gène marqué, ce qui permet d’identifier les virus recombinants corrects. L’excision des marqueurs de sélection offre la possibilité de combiner plusieurs étiquettes fluorescentes, ce qui nous permet de créer des virus avec la capacité d’étiqueter par fluorescence plusieurs protéines virales simultanément. Des études antérieures ont déterminé les exigences minimales en matière d’homologie pour la recombinaison de la vaccine des molécules d’ADN linéaires et circulaires transfectées en cellules infectées par le virus de la vaccine6. Nous voulions déterminer les efficacités de recombinaison des longueurs variables d’homologie des bras flanquants dans le vecteur TDS gpt-mCherry par son incorporation dans le génome viral de la vaccine. Il a été déterminé que les régions homologues de 100 pb dans le vecteur TDS sont suffisantes pour cibler et arbitrer l’insertion d’ADN recombinant dans le génome vacv par recombinaison homologue (Figure 4). Alors que des longueurs d’homologie plus petites permettraient également la recombinaison, des longueurs d’homologie de 100 pb ont fourni suffisamment de virus recombinants qui pourraient être facilement identifiés avec la sélection métabolique et fluorescente. Des fragments d’ADN de cette taille peuvent être synthétisés commercialement à un coût relativement faible et facilite grandement la production de vecteurs multiples pour la création de virus recombinants. Nous avons choisi d’augmenter la longueur d’homologie à 150 pb pour fournir une plus grande fréquence de recombinaison tout en maintenant bas les coûts de synthèse de la séquence d’oligonucléotide des régions flanquantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mycophenolic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3536-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 0.1N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xanthine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X0626-5G</td>
			<td>Dissolve in 0.1N NaoH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE HD transfection reagent</td>
			<td style="width:95px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td>
			<td style="width:95px;">Olympus, Chroma</td>
			<td style="width:119px;">BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

Le marquage des protéines virales avec des protéines fluorescentes s’est avéré une approche indispensable pour approfondir notre compréhension des interactions virus-hôte. Le virus de la vaccine (VVAC), le vaccin vivant utilisé dans l’éradication de la variole, se porte particulièrement bien à la microscopie fluorescente à cellules vivantes en raison de sa grande taille de virion et de la facilité avec laquelle il peut être conçu au niveau du génome. Nous rapportons ici un protocole optimisé pour générer des virus recombinants. Les exigences minimales pour la recombinaison homologue ciblée pendant la réplication de la vaccine ont été déterminées, ce qui permet de simplifier la génération de construction. Cela a permis l’alliance de la sélection dominante transitoire (TDS) avec un rapporteur fluorescent et une sélection métabolique pour fournir une approche rapide et modulaire aux protéines virales d’étiquette fluorescente. En rationalisant la génération de virus recombinants fluorescents, nous sommes en mesure de faciliter les applications en aval telles que l’analyse d’imagerie avancée de nombreux aspects de l’interaction virus-hôte qui se produit lors de la réplication du virus.

La figure 1 répertorie les différentes constructions requises pour cette procédure, qui sont soit synthétisées(figures 1b et 1c),soit créées par des étapes de clonage(figure 1d). La figure 2 donne un aperçu de la procédure expérimentale avec des images représentatives de plaque fluorescente d’un VCA recombinant A3-GFP représentées pour chaque étape du processus de sélection. Sur la figure 3, onmontre des virus de la vaccine recombinante exprimant des protéines marquées à l’aide de marqueurs fluorescents ciblant les protéines structurelles virales A3 et F13, qui font partie du noyau interne du virus23 et de l’enveloppe externe24,respectivement. Les observations de plaques virales et de cellules infectées pour chacun des virus recombinants créés sont représentées. L’efficacité de la recombinaison homologue des vecteurs avec le génome vacv, contenant aussi peu que 70 bp régions d’homologie à celui-ci, a été testée et les résultats sont représentés à la figure 4. Le succès relatif de l’identification des plaques virales faites de la recombinaison avec des vecteurs contenant l’homologie de 100 points d’ébullition était le raisonnement derrière le choix de synthétiser les bras gauches et droits de longueur de 150 points d’ébullition de l’homologie au gène cible.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Figure 1. Vecteur de recombinaison TDS (Transient Dominant Selection). (a) Vecteur TDS avec marqueurs de sélection gpt et mCherry. (b) Les bras gauche et droit d’homologie sont conçus avec des sites de restriction spécifiques entre les deux et flanquant les bras d’homologie. Les sites de restriction entre les bras gauche et droit utilisés dans cette méthode étaient NotI et BamHI, le site NotI étant également utilisé comme agent de liaison entre le gène et l’étiquette fluorescente. c)Les étiquettes fluorescentes compatibles avec cette méthode sont flanquées de sites de restriction correspondants. Certains tags employés sont GFP (green fluorescent protein), RFP (red fluorescent protein), Cerulean (une amélioration par rapport à ECFP, une protéine fluorescente cyan, par mutagenèse dirigée vers site25)et mini-SOG, une protéine fluorescente fabriquée à partir de GFP qui crée un produit résolvable par EM sur l’éclairage26. (d)Étapes de clonage impliquées dans la génération du vecteur de recombinaison TDS final. L’oligonucléotide synthétisé contenant les bras flanquant gauche et droit est d’abord cloné dans le vecteur TDS. Cela fournit un vecteur de recombinaison dans lequel toute balise de choix peut être transférée dans et hors par clonage dans les sites de restriction incorporés entre les bras gauche et droit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Figure 2. Aperçu de la procédure expérimentale pour créer un virus de la vaccine recombinante. Les événements survenant aux niveaux génétique et cellulaire sont décrits, ainsi que des images de plaque représentatives décrivant les étapes suivant la création d’un virus de la vaccine fluorescent marqué par A3-GFP. (A) Les cellules infectées par le virus de la vaccine sont transfectées avec le vecteur de recombinaison TDS. (B) Dans cette figure, seul le résultat de la recombinaison de gauche est représenté et l’exemple utilise GFP comme étiquette fluorescente de choix. La recombinaison à droite entraînerait l’incorporation du plasmide TDS entier dans le génome d’une manière similaire, sauf que l’étiquette serait fusionnée à l’ensemble du gène cible à l’étape intermédiaire, c’est-à-dire à l’étape C. Un dosage de plaque est effectué sur une monocouche cellulaire avec le mélange de recombinaison et soumis à la sélection GPT. (C) Les plaques présentant à la fois une fluorescence rouge et verte, correspondant respectivement à l’expression mCherry et GFP, sont cueillies et amplifiées. Une fois la sélection supprimée, il y aura perte de fluorescence rouge correspondant à la perte des gènes gpt et mCherry (D)et des plaques présentant exclusivement une fluorescence verte sont cueillies et amplifiées(E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Figure 3. Résultats représentatifs du système de recombinaison TDS. Les images représentent des plaques entières de cellules recombinantes infectant le VCA après 48 heures(a, c, e; barre d’échelle 100 μm), accompagnées d’une image d’une seule cellule infectée par le virus recombinant correspondant après 8 heures(b,d, f; barre d’échelle10 μm). Des gènes correspondant à des protéines localisées par virion ont été sélectionnés pour visualiser les particules virales. A3 est une protéine centrale de la virion vaccinia (a, b) et F13 (c, d ) est une protéine del’enveloppe virale. Un virus à double marquage avec A3 et F13 (e, f) marqués par fluorescence est également montré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Figure 4. Analyse quantitative de l’efficacité de recombinaison entre les vecteurs recombinants et le génome vacv. Des monocouches BS-C-1 ont été infectées par VACV et ont transfecté 1 heure poteau-infection avec trois vecteurs de recombinaison contenant des régions d’homologie de 500 points d’ébullition, de 100 points d’ébullition, ou de 70 points d’ébullition au génome de VACV. Chaque vecteur contenait également la cassette TDS comprenant les gènes de sélection gpt et mCherry. Des cellules ont été récupérées 24 heures poteau-infection et lysées pour libérer les virus de recombinaison formés. Des analyses de plaque ont été exécutées sur des lysats de cellules avec des médias de sélection de GPT et des plaques montrant la fluorescence de mCherry ont été comptées en tant que recombinaison réussies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Figure 5. Carte du vecteur TDS gpt-mCherry montrant le site de clonage multiple. Le vecteur a été décrit précédemment22 et la carte vectorielle a été créée à l’aide de la carte plasmidique EZ v1.9 du Zhang Lab Group (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.

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Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Un protocole rapide et modulaire pour la génération de virus de vaccinia recombinants exprimant des protéines fluorescentement marquées simultanément utilisant la méthode de sélection dominante transitoire est décrit ici.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K vues.  University of Sydney. Un protocole rapide et modulaire pour la génération de virus de vaccinia recombinants exprimant des protéines fluorescentement marquées simultanément utilisant la méthode de sélection dominante transitoire est décrit ici.

Vidéo: Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

Dépistage ARNi pour les facteurs de l&#39;hôte impliqués dans Vaccine</emVirus Infection> aide Drosophile Cellules

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Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Finger-stick Méthode d&#39;échantillonnage de sang pour la détermination des induite par l&#39;exercice apoptose des lymphocytes

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

L&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l&#39;expression des gènes

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...