Cette approche offre un moyen efficace d’introduire d’autres antigènes viraux dans le génome hvt pour le développement rapide de vaccins recombinants. Un certain avantage de cette technique est qu’une cassette d’expression GFP est attachée à l’insert d’abord pour une visualisation facile, puis supprimée par le système Cre-LoxP. La même approche peut être utilisée pour insérer plus de gènes viraux à différents endroits du génome hvt, ou d’autres virus de l’herpès aviaire pour le développement de vaccins recombinants multivalents.
Katy Moffat, experte en tri cellulaire, démontrera la procédure. Na Tang, Yaoyao Zhang et Guanggang Qu, scientifiques de mon laboratoire. La veille de la transfection préparer fibroblastes embryon poussin tel que décrit dans le protocole texte.
Graine 1,3 million de cellules en 2,5 millilitres de milieu dans chaque puits d’une plaque de six puits. Transfecter les cellules CEF avec 0,5 microgramme chacun des deux plasmides d’ARN guide Cas9, et un microgramme du plasmide donneur à l’aide d’un réagage de transfection approprié selon les instructions du fabricant. Incuber les cellules à 38,5 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 12 heures.
12 heures après transfection diluer le stock de virus HVT avec le milieu de culture M199 à une concentration de 100 000 unités formant de la plaque par millilitre. Ajouter 130 microlitres du virus dilué à chaque puits de cellules transfectées. Réglez un puits de cellules non infectées comme un contrôle négatif et ajoutez la même quantité de virus.
Incuber les cellules à 38,5 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. La veille du tri, préparer deux 96 plaques de puits en ensemencer 20 000 cellules dans chaque puits. Trois jours après l’infection, récupérez les six plaques de puits contenant les CEF transfectés et infectés.
Aspirer le milieu de chaque puits et rincer la feuille de cellule avec PBS. Ajouter un millilitre de 0,05 % trypsine-EDTA à chaque puits et incuber les cellules à 38,5 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant environ cinq minutes. Ensuite, résuspendez les cellules avec 50 microlitres de FBS et transférez cette suspension dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Centrifugeuse à 200 fois la gravité pendant cinq minutes. Resuspendez les cellules en un millilitre de PBS contenant 1%FBS. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et ajuster la densité cellulaire à un million de cellules par millilitre.
Ensuite, transférez les cellules dans un tube de tri en polystyrène à travers son capuchon de passoire. À l’aide d’un trieur cellulaire, trier les cellules individuelles exprimant le GFP dans les plaques de puits préséées 96. Incuber les plaques avec les cellules triées à 38,5 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours.
Après cinq jours, utilisez le microscope à fluorescence pour vérifier les 96 plaques de puits et marquer les puits qui contiennent une seule plaque positive GFP. Essayez chaque GFP positif bien avec 50 microlitres de trypsine-EDTA pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de milieu de culture pour résuspendre les cellules et transférer cette suspension dans un puits d’une plaque de six puits avec des CEF.
Après trois jours, congeler un flacon de chacune des premières générations de virus recombinants dans le milieu de congélation. Conservez ces virus récoltés dans de l’azote liquide. Recueillir 100 000 cellules de chacune des premières généra tures de virus.
Centrifugeuse les cellules à 2000 rpm pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Conserver les cellules à un taux négatif de 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à effectuer l’extraction de l’ADN. Lorsqu’ils sont prêts à effectuer l’extraction de l’ADN utiliser 50 microlitres de tampon squishing pour décongeler et résuspendre les granulés cellulaires.
Lyse les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant deux minutes pour inactiver le Proteinase K.Effectuer une réaction PCR avec trois amorces de jonction de premier plan en utilisant un microlitre de chaque échantillon d’ADN tel que décrit dans le protocole de texte. Chargez deux microlitres des produits d’amplification à un puits de gel d’agarose de 1% pour l’électrophoresis de gel. Pour éliminer le gène GFP du virus recombinant, utilisez un réaccente de transfection pour transfecter deux microlitres de plasmide d’expression cre recombinase dans la plaque de six puits qui a été préséminée avec des cellules CEF.
12 heures après la transfection décongeler un flacon de virus recombinant de l’azote liquide. Resuspendez doucement le virus et ensemencez 50 microlitres dans chaque puits de cellules transfectées, en fixant un ainsi que le contrôle négatif avec la même quantité de virus. Incuber à 38,5 degrés Celsius pendant trois jours.
72 heures après l’infection préparer les cellules pour le tri comme décrit précédemment. Trier les cellules non fluorescentes individuelles dans une plaque de 96 puits présénée avec des CEF. Ensuite, essayez de visualiser les plaques choisies et de résuser les cellules correspondantes telles que décrites dans le protocole texte.
Passez la moitié des cellules dans chaque puits d’une plaque de puits de 96 qui a été précédée de CEF comme deuxième génération. Centrifuger les cellules restantes de chaque clone à 200 fois la gravité pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules avec 50 microlitres de tampon squishing pour l’extraction de l’ADN.
Ensuite, effectuez pcr avec cinq amorces de jonction de premier plan en utilisant un microlitre de modèle d’ADN tel que décrit dans le protocole de texte. Sur la base des résultats pcr choisir trois à cinq clones positifs de HVT recombinant pour d’autres passages et la vérification. Tout d’abord, infecter les CEF avec la deuxième génération de HVT recombinant dans une plaque de puits présénée 24.
48 heures après l’infection enlever le milieu de culture et ajouter 500 microlitres de 4% paraformaldéhyde dans PBS pour fixer les cellules. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, retirez le fixatif et lavez la couche cellulaire trois fois avec PBS.
Retirez le PBS et ajoutez 500 microlitres de 0,1% Triton X-100 pour perméabiliser les cellules. Après 15 minutes laver la couche cellulaire trois fois avec PBS. Ajouter le tampon de blocage pendant une heure pour bloquer la liaison non spécifique.
Ensuite, diluer l’anticorps primaire anti-VP2 anticorps monolinal HH7 ou HVT infecté sérum de poulet à un à 200 dans le tampon de blocage. Ajouter 200 microlitres de l’anticorps primaire dilué à chaque puits et incuber à température ambiante pendant une heure. Lavez la couche cellulaire trois fois avec PBS.
Diluer l’anticorps secondaire chèvre anti-souris IgG Alexa 568 ou chèvre anti-poulet IgG Alexa 488 à un à 200 dans le tampon de blocage. Ajouter 200 microlitres d’anticorps secondaires dilués à chaque puits et incuber à température ambiante pendant une heure. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec PBS.
Utilisez le microscope à fluorescence pour vérifier l’expression des protéines. La veille de l’expansion du virus graine 2,6 millions de cellules CEF dans chaque flacon T25. Décongeler au moins trois clones positifs et ajouter un flacon de cellules ou de virus à chaque flacon.
Incuber les flacons à 38,5 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’un effet cytopathique de 50% soit observé. Ensuite, récoltez les cellules en deux millilitres de milieu de culture. Infecter 50 microlitres à un nouveau flacon T25 qui a été présééré avec des cellules CEF pour la prochaine génération.
Continuez à passer le virus recombinant pendant au moins 15 générations. À l’aide de PCR analyser chaque génération de virus pour la présence de la séquence VP2. À l’aide d’un test d’immunofluorescence indirecte, analyser chaque génération de virus d’expression VP2.
Après le tri d’une seule cellule, le virus purifié obtenu est analysé par trois PCR de jonction principale, qui montre un produit PCR de la taille prévue. Après l’excision du journaliste du GFP par Cre recombinase plus de 50% des plaques ont perdu leur expression GFP. La plaque purifiée après l’excision GFP est obtenue par tri cellulaire unique et est encore confirmée par cinq PCR de jonction principale qui montre le produit de la taille prévue.
L’expression protéique est ensuite confirmée par un test d’immunofluorescence indirecte avec un anticorps monoclonal spécifique VP2 et un sérum de poulet anti-HVT. Comme prévu, les cellules infectées par le HVT parental ne peuvent être tachées que par sérum anti-HVT. Tandis que les cellules infectées recombinantes de HVT montrent clairement l’expression du gène VP2.
Pour générer un virus recombinant taux élevé de transfection est nécessaire pour maximiser les chances du virus et l’insert de se rencontrer dans la même cellule pour l’édition d’avoir lieu. Suite à cette procédure, des expériences animales peuvent être réalisées pour évaluer l’immunogénicité et l’efficacité des vaccins recombinants. La mise au point de nouveaux vaccins vecteurs multivalents utilisant la plate-forme système CRISPR/Cas9 décrite ici sera très bénéfique pour l’industrie avicole afin de se protéger contre de multiples maladies de la volaille.
