La procédure pour analyser et trier Streptomyces pastilles d&#39;une culture de liquide augmenté de deux jours-vieux est représentée schématiquement à la figure 1. Détails de la méthode sont donnés ci-dessous. Une. Croissance (y compris la préparation des médias et de la zone tampon) <ol><li> Préparer 1 litre de 10x tampon phosphate salin (PBS, 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 dans 1 litre d&#39;eau distillée ajustée à pH 7,4). Au moment de l&#39;utilisation, ajouter 100 ml de 10x PBS à 900 ml d&#39;eau distillée pour obtenir 1 litre de PBS. </li><li> Préparer 1 litre de milieu YEME (3 g extrait de levure Difco, 5 g de Bacto peptone, 3 g Oxoid extrait de malt, 10 g de glucose, 340 g de saccharose, de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à 1 L) et 100 ml de 2,5 M de MgCl2. Stériliser les deux solutions à l&#39;autoclave. Notez que d&#39;autres médias Streptomyces peuvent être utilisés 4,14. </li><li> Ajouter 100 ml de milieu YEME et 0,2 ml de 2,5 M de MgCl2 à unestérile Erlenmeyer de 250 ml équipé avec des ressorts métalliques enroulés. Préparer autant de ballons que les échantillons bactériens à étudier. </li><li> Inoculer chaque flacon avec 10 8 spores de Streptomyces pour obtenir une concentration de spores de 10 6 spores / ml. Cultiver les bactéries pendant 2 jours à 30 ° C tout en agitant à 180 rpm. </li></ol> 2. Échantillonnage <ol><li> Transférer un échantillon de 5 ml de chaque culture dans un tube Falcon de 15 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile 5 ml. Secouez la culture en prenant l&#39;échantillon afin de s&#39;assurer que l&#39;échantillon est représentatif de l&#39;ensemble de la culture. </li><li> Lorsque les échantillons sont analysés immédiatement avec COPAS aucun étapes de préparation des échantillons sont nécessaires. Conserver l&#39;échantillon sur la glace et passez à l&#39;étape 3.1 de ce protocole. Lorsque les échantillons sont analysés à un point de temps plus tard, fixer les pastilles comme décrit dans les étapes 2.3 à 2.5 de ce protocole. A noter que la fixation empêche également la croissance des bactéries dans le système de tuyauterie lorsqu&#39;il n&#39;est pas correctement nettoyé après analyses. Veiller à ce que la fixation avec le formaldéhyde n&#39;est pas une entrave analyses en aval. Par exemple, l&#39;ARN n&#39;a pas pu être isolé à partir de pastilles fongiques après la fixation au formaldéhyde. Par contraste, l&#39;ARN a été isolé avec succès, après fixation à l&#39;éthanol 70% 12. </li><li> Ajouter 600 pi de 37% de formaldéhyde à 5 ml d&#39;échantillon et mélanger en inversant le tube 3x. Fixer les échantillons sur la glace pendant 30 min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 2500 x g dans un rotor fixé à 4 ° C pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant et laver les pastilles avec 5 ml de PBS. </li><li> Répéter l&#39;étape 2.4 de sorte que les pastilles sont lavées avec du PBS 2x. Les échantillons peuvent être conservés dans du PBS à 4 ° C pendant plusieurs semaines. </li></ol> 3. Analyse COPAS <ol><li> Assurez-vous que la COPAS De plus, la pompe, l&#39;ordinateur et le 488 nm laser à l&#39;argon sont sous tension et lancer le logiciel Biosort. Bien allumé, le laser sera toujours en mode veille. </li><li> Vérifier si la bouteille de liquide de gaine est pleine et l&#39;bouteille de déchets est vide. </li><li> Cliquez sur «Démarrer» puis sur «RUN» pour passer le 488 nm laser à l&#39;argon en mode veille pour le. Après environ 60 secondes, lorsque le laser est activé, cliquez sur «Terminé». </li><li> Vérifiez les manomètres. Les pressions en faveur de «gaine», «échantillon», «trieur» et «Clean» doivent lire environ 4,0, 0,5, 2,7, et 10,9 respectivement. </li><li> Cochez la case à côté de «pression OK &#39;. Le système amorce alors la cellule d&#39;écoulement et est prêt à l&#39;emploi. </li><li> Réglages standard sont supposés avec «Retard» à 11 et «largeur» 7. Les seuils sont fixés à 50 pour &quot;signal&quot; et 40 pour &quot;TOF minimum», avec TOF représentant le temps de vol. (Pour être complet: tous les «gains» sont fixés à 1, le déclenchement est réglé à EXT (Extinction) et dans l&#39;onglet &quot;Configuration&quot; sous &quot;Sélectionnez la vitesse de balayage &#39;de 2,50 MHz est choisi coïncidence est réglé sur« amélioré ».). </li><li> Enlever l&#39;eau les restes de l&#39;un échantillon de tassed ajouter 0,1 ml d&#39;échantillon Streptomyces de l&#39;étape 2.2 ou 2.5 dans la tasse avec du PBS (environ 50 ml). Assurez-vous que la coupelle d&#39;échantillon est correctement fermé. </li><li> Cliquez sur «Acquire» pour commencer la collecte de données. Gérer la vitesse d&#39;écoulement d&#39;obtenir entre 30-50 événements par seconde. Si le débit est trop élevé, ajouter du PBS à la coupelle d&#39;échantillon. Si la vitesse d&#39;écoulement est trop faible, ajouter plus de l&#39;échantillon. </li><li> Lorsque au moins 2.500 événements sont collectés, cliquez sur &#39;STOP&#39;. Pour enregistrer toutes les données, cliquez sur &quot;Store&quot; et enregistrer votre fichier pour l&#39;analyse statistique ultérieure. Le logiciel Biosort enregistre les données dans quatre dossiers, dont seul le fichier txt. Sera utilisé pour l&#39;analyse ultérieure. </li><li> Nettoyer la coupelle d&#39;échantillon en retirant l&#39;échantillon avec une seringue de 50 ml et on lave 2x avec de l&#39;eau. </li><li> Répétez les étapes 03.07 à 03.10 jusqu&#39;à ce que tous les échantillons sont analysés. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Ouvrez le fichier txt. Et jetez données avec un EXT inférieur à 25 (en utilisant par exemple MS Excel). Cecorrespond aux débris et fragments mycéliens vrac (pour Aspergillus Niger toutes les données avec un EXT inférieur à 150 sont rejetées) 4,12. Ensuite, enregistrez tous TOFs dans une colonne dans une plaine fichier (par de nombreux fichiers de données ce qui peut être automatisé dans le langage de programmation R, disponible à partir de: «txt». <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Assurez-vous que SciLab (version 5.3.2 ou plus récent de http://www.scilab.org/) est installé avec la bibliothèque «fittools», qui est disponible, avec le manuel, à partir de: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Lancer SciLab et exécuter les fonctions nécessaires de la bibliothèque fittools pour modéliser les données. En bref: Installez la bibliothèque de fittools comme indiqué dans le manuel (nécessaire seulement une fois). <ol><li> Charger la bibliothèque de fittools. </li><li> Lire les données («txt». Fichiers) dans SciLab. </li><li>Connectez-vous transformer les données (logarithme naturel est la fonction de journal par défaut). </li><li> Ajuster le modèle de deux populations aux données. </li><li> Tracer un graphique avec l&#39;histogramme et modèle (en option). </li><li> Amorcer les données (1000 répétitions). </li><li> Ajuster le modèle pour les jeux de données bootstrap. </li><li> Obtenez le intervalles de confiance des estimations des 5 paramètres. Ceci fournira des informations sur la fraction de la participation (p) des populations, leurs moyens (2 μ 1 et μ 2) et les écarts-types d&#39;accompagnement (α 1 et α 2). En outre, les intervalles de confiance à 95% sont déterminées par remontage avec le modèle après l&#39;amorçage (1000 répétitions) 12,13,15. Lorsque les intervalles de confiance de la moyen ne se chevauchent pas et l&#39;intervalle de confiance de p est compris entre 0,025 à 0,975 le jeu de données peut être expliqué comme une combinaison des deux populations de distributions normales. (Remarque èmeà la fraction de la participation des petites boulettes est p, tandis que la participation des grandes boulettes est 1 - p.) La relation entre TOF et le diamètre d&#39;une pastille Streptomyces est égal à 0,57 × 159 um TOF + 4. </li></ol></li><li> Dans le cas de deux populations se trouvent l&#39;utilisation des moyens de TOFs comme paramètres de tri dans la COPAS que la partie supérieure et limite inférieure de trier les petites et grandes pastilles suite. A noter que d&#39;autres paramètres de tri peuvent être sélectionnés en fonction des exigences de l&#39;utilisateur. </li></ol> 5. Pellet Tri <ol><li> Chargez l&#39;échantillon Streptomyces qui doit être trié comme décrit dans l&#39;étape 3.7. </li><li> Set &#39;Tri limites »et fournir des détails sur le minimum (Lo) et maximale (Salut) valeurs TOF. Vous pouvez également définir une zone en sélectionnant «Régions», puis «Définir porte Région» pour sélectionner les pastilles avec les dimensions ou propriétés désirées. </li><li> Placer un tube de 50 ml àregrouper plusieurs pastilles qui répondent aux paramètres de tri. En variante, une plaque de microtitration peut être utilisé pour trier les pastilles individuelles. Pastilles multiples (10 4 -10 5) sont nécessaires pour l&#39;ADN et l&#39;extraction des protéines. Une seule pastille est suffisante pour l&#39;analyse par qPCR de l&#39;expression génique, mais plusieurs pastilles sont nécessaires pour réaliser le séquençage de l&#39;ARN. </li><li> Décider et fixer le nombre de pastilles qui doivent être triés et cliquez sur «Trier manuellement» pour trier les paramètres sélectionnés. Lorsque le montant fixé de pellets est atteint, le tri se termine automatiquement. </li><li> Retirer à gauche sur l&#39;échantillon avec une seringue de 50 ml de l&#39;échantillon tasse et laver la tasse avec de l&#39;eau 2x. Répéter les étapes 5.1 à 5.5 si d&#39;autres échantillons doivent être triés. </li><li> Avant d&#39;arrêter les COPAS rincer l&#39;échantillon tasse avec de l&#39;eau pour enlever les pastilles restantes et nettoyer la coupelle d&#39;échantillon avec 70% EtOH et / ou 2% d&#39;hypochlorite dans l&#39;eau. Exécuter un échantillon de l&#39;eau chlorée pour nettoyer l&#39;ensemble du système et répéter ce avec de l&#39;eau. Vide til déborde récipient et nettoyez ou remplacez le filtre qui se trouve dans ce conteneur. </li><li> Lorsque vous avez terminé, cliquez sur &#39;STOP&#39; pour libérer la pression du système. Quand le moteur s&#39;arrête fermer le programme et cliquez sur «arrêt sans purge. Ensuite, éteignez l&#39;ordinateur, la COPAS, le laser, et la pompe. </li></ol>

<ol>
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J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. 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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La cytométrie en flux a permis l&#39;analyse à haut débit d&#39;un grand nombre de cellules individuelles, ce qui a contribué à notre compréhension de l&#39;hétérogénéité des populations clonales 6. Cytométrie en flux régulier n&#39;est pas possible pour l&#39;analyse des pastilles de mycélium multicellulaires Streptomycetes et les champignons. Nos travaux ont montré que l&#39;analyse à haut débit de pellets Streptomyces est réalisable à l&#39;aide COPAS. La procédure décrite ici est simple, rapide, et très reproductible. Le paramètre essentiel de garder à l&#39;esprit pendant le fonctionnement de l&#39;instrument est la vitesse d&#39;écoulement, ce qui ne devrait pas dépasser 100 événements / sec (étape 3.8 de ce protocole). Si la concentration de la pastille, et donc également la vitesse d&#39;écoulement, devient trop élevée, les valeurs de TOF seront mal calculé parce que l&#39;instrument ne parvient pas à détecter pastilles individuelles. Diluer suffisamment l&#39;échantillon par l&#39;addition de PBS permet de surmonter ce problème. Limites De plus l&#39;utilisation COPAS<html> d ici a un diamètre de buse de 1 mm, ce qui est adapté à la mesure des particules ayant une taille allant de 30 à 700 um. Cette buse permet donc de mesurer les pastilles formées par les streptomycètes. Dans le cas des champignons filamenteux les micro-colonies peuvent être plus grands, ce qui limite l&#39;applicabilité générale de la COPAS Plus. La COPAS XL peut mesurer des particules jusqu&#39;à 1500 um en taille, mais sa sensibilité dans la gamme inférieure de diamètre est inférieur par rapport à celui de la COPAS Plus. Tant la COPAS Plus et la COPAS XL ne peuvent pas analyser les particules inférieures à 30 um. Cela implique que les spores ou les cellules microbiennes individuelles ne peuvent pas être analysés. En outre, la COPAS peut ne pas analyser avec précision les petits agrégats de cellules ou de spores et les très petits micro-colonies. A cet effet, les analyseurs de cellules régulières doivent être utilisés. Cette limitation est vaincue par la Biosorter de Union Biometrica, qui peut analyser des particules dans la gamme de 1-1,500 um. Le prix d&#39;achat est toutefois plus élevé. t &quot;&gt; Dépannage La COPAS est un instrument robuste qui est facile à utiliser. Cependant, parfois, pastilles ne sont pas détectés après le chargement d&#39;un échantillon dans le gobelet et de commencer la mesure. La cause est généralement un tube d&#39;entrée bouché, qui peut être facilement résolu en appuyant sur la commande «propre». Cela va forcer les pastilles de retour provenant du système de tuyau dans le récipient d&#39;échantillon. Une alternative raison pourrait être que le couvercle n&#39;est pas correctement placé sur la coupelle d&#39;échantillon. Cela conduit à la perte de pression et l&#39;insuffisance concomitante de détecter des pastilles. Importance et orientations futures Nous ici concentrés sur l&#39;analyse de la taille des granulés, mais la configuration de la COPAS est également capable d&#39;analyser et de trier en fonction de la fluorescence et de la densité. détection de fluorescence nous permet d&#39;analyser l&#39;expression des gènes en fonction des journalistes tels que la GFP. En outre, la composition de cellules peut être évalué. Encore plus puissante est la possibilité de séparer des pastilles selon ces paramètretres. Présentation pastilles peuvent être utilisées pour des analyses en aval, y compris les études d&#39;ensemble omique. En effet, nous l&#39;avons déjà trié 60 000 grandes et 200 000 petites pastilles, et démontré que le protéome est significativement différente entre les grandes et les petites pastilles 4. Cette technologie offre donc de nouvelles pistes pour améliorer Streptomycetes comme usines cellulaires. Le principal avantage de la technologie COPAS est temps. Des études précédentes sur les culots de cellules ont été réalisées en utilisant un microscope, ce qui limite le nombre de pastilles qui peuvent être analysés jusqu&#39;à plusieurs centaines 16. études de microscopie déjà suggéré l&#39;existence de deux populations de granules dans liquide grandi cultures de Streptomyces 16. En effet, les deux populations de pastilles ont été détectés, indépendamment des conditions de culture dans un grand nombre de différents streptomycètes 4. Cette hétérogénéité de taille n&#39;est pas limitée aux streptomycètes filamenteux, mais a également été observée chez les champignons filamenteux 12 &lt;/ Sup&gt;. Dans tous les cas, les mécanismes sous-jacents de l&#39;hétérogénéité ne sont pas encore connus. La possibilité de trier pastilles selon la taille et la fluorescence nous permet de démêler ces mécanismes.

Streptomycetes sont des bactéries filamenteuses du sol qui sont bien connus pour leur aptitude à rendre des antibiotiques, ainsi que des composés qui peuvent être utilisés comme immunosuppresseurs ou à lutter contre les infections fongiques ou d&#39;un cancer 1,2. En outre, ces micro-organismes produisent des enzymes qui sont d&#39;intérêt pour une large gamme d&#39;applications industrielles 3. La plupart de ces composés commercialement intéressantes sont produites dans des bioréacteurs. La croissance dans des bioréacteurs de streptomycètes est caractérisée par la formation de structures complexes des hyphes interconnectés, appelés blocs ou de pastilles. Ces structures multicellulaires sont très hétérogènes quant à la taille 4 et peuvent atteindre des tailles qui sont plus d&#39;un million de fois plus grande que la bactérie unicellulaire tels que Escherichia coli ou Bacillus subtilis. Bien que l&#39;hétérogénéité est considérée comme une caractéristique avantageuse dans des systèmes biologiques naturels 5, il est considéré comme un piège de production dans l&#39;industrie. Biocultures du réacteur doivent être reproductible et contrôlable pour obtenir les rendements les plus élevés possibles. Une compréhension détaillée du rôle de chacun des types de granulés dans un bioréacteur est donc crucial d&#39;améliorer Streptomycetes comme usine cellulaire. La cytométrie en flux est couramment utilisé pour analyser des cellules individuelles dans une population 6. cytomètres de flux peuvent acquérir des informations multiparamétrique par les caractéristiques des cellules (comme la taille, la densité et la fluorescence multicolore) mesurer simultanément. De cette façon, les propriétés des cellules peuvent être corrélées contribuant ainsi à notre compréhension de l&#39;hétérogénéité au sein d&#39;une culture et de l&#39;existence de populations distinctes de cellules 6. Plus instruments spécialisés ont permis de trier les cellules en fonction de paramètres définis par l&#39;utilisateur. Par exemple, les mutants peuvent être criblés. Après le tri, les cellules mutantes peuvent être cultivées pour une caractérisation plus poussée. Cela a déjà prouvé être utile, entre autres,pour améliorer la productivité des souches 7,8. Les buses de cytomètres de flux permettent typiquement pour le passage des cellules d&#39;un diamètre maximal d&#39;environ 10 um. Par conséquent, des pastilles de Streptomycetes ne peuvent pas être analysés avec cytometers réguliers des débits. Cependant, ils peuvent être analysés avec l&#39;objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse (COPAS). Comme cytometers réguliers des débits, COPAS peut acquérir des données multiparamétriques de particules de manière à haut débit. Selon le type de COPAS 10-1,500 um de taille des particules peuvent être analysées. En outre, il permet de classer des particules individuelles qui peuvent être utilisés pour la culture ou les analyses en aval, telles que l&#39;isolement de l&#39;ADN, de l&#39;ARN ou des protéines. COPAS a été initialement conçu pour l&#39;analyse et le tri des petits organismes multicellulaires, comme les nématodes Caenorhabditis elegans 9 et embryons de drosophile et les larves 10. Les instruments ont également été utilisés pour 11 un poisson zèbree pour champignons filamenteux 12,13. Les derniers organismes forment également des pastilles de mycélium qui sont encore plus grands que ceux formés par des bactéries filamenteuses. Nous avons récemment démontré que l&#39;utilisation de COPAS est également possible pour les streptomycètes 4. Nous décrivons ici la procédure expérimentale pour l&#39;utilisation des COPAS pour évaluer culot hétérogénéité dans Streptomyces coelicolor, y compris des détails sur la méthodologie de trier pastilles selon la taille. S&#39;il vous plaît noter, toutefois, que ce procédé peut également être utilisé pour l&#39;analyse d&#39;autres streptomycètes formation de pastilles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomycetes sont des bactéries filamenteuses du sol qui sont utilisés dans l&#39;industrie pour la production d&#39;enzymes et les antibiotiques. Lorsqu&#39;il est cultivé dans des bioréacteurs, ces organismes forment des réseaux de hyphes interconnecté, connue sous forme de pastilles, qui sont hétérogènes en taille. Nous décrivons ici une méthode d&#39;analyse et de boulettes sorte de mycélium à l&#39;aide d&#39;un objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse (COPAS). Les instructions détaillées sont données pour l&#39;utilisation de l&#39;instrument et l&#39;analyse statistique des données de base. Nous décrivons en outre comment pastilles peuvent être triés en fonction des paramètres définis par l&#39;utilisateur, ce qui permet le traitement en aval tels que l&#39;analyse de l&#39;ARN ou la teneur en protéines. En utilisant cette méthodologie, le mécanisme sous-jacent de croissance hétérogène peut être abordée. Cela jouera un rôle pour améliorer Streptomycetes comme usine cellulaire, compte tenu du fait que la productivité est corrélée avec la taille de culot.

Mesures COPAS de pellets Streptomyces Streptomycetes former des pastilles de mycélium dans des cultures liquides qui ont une large gamme de tailles. Pour analyser la distribution de taille de granulés, d&#39;un liquide vieux de 2 jours cultivés Streptomyces coelicolor culture a été soumise à l&#39;écoulement des particules de grande cytométrie en utilisant un profileur COPAS plus équipé d&#39;une buse de 1 mm. Une sortie COPAS typique est un nuage de points, comme visualisé dans la figure 2A. L&#39;axe des abscisses représente le temps de vol (TOF), qui est en corrélation avec la taille de pastille (c&#39;est à dire qu&#39;il faut plus de temps pour les grandes pastilles pour passer le faisceau laser). L&#39;axe des ordonnées représente l&#39;extinction, qui représente la densité optique de l&#39;objet. Chaque point du nuage de points correspond à une épreuve individuelle, c&#39;est à dire une seule pastille passer le faisceau laser. Il est important, lorsque l&#39;échantillon est trop concentré (c&#39;est à dire lorsque le laser détecte plus de 100 événements / sec), la COPAS échoue souvent à détecter p individuellets. Cela conduit à des valeurs de TOF fausses qui sont trop élevés. Dilution de l&#39;échantillon réduit les valeurs moyennes de TOF, jusqu&#39;à un certain point où en outre la dilution fait aucun impact plus TOF. Ce point est atteint lorsque environ 100 pastilles / s ont été analysés. Tracer les points de données dans un histogramme indique que les tailles ne sont pas distribuées normalement (figure 2B). La distribution semble être biaisée vers la droite. Connectez-vous transformer l&#39;ensemble de données n&#39;a pas non plus conduire à une distribution normale (figure 2C). Afin de déterminer si la distribution de la taille peut s&#39;expliquer par l&#39;hypothèse d&#39;un mélange de deux distributions normales des données a été modélisée mathématiquement 12,15. Modélisation en effet indiqué que la distribution de taille peut être expliquée en supposant l&#39;existence de deux populations distinctes de pastilles. La population de petites pastilles composée de 92% de toutes les pastilles ayant une taille moyenne de 248 um, alors que la population de grande pelpermet (8% de l&#39;ensemble des pastilles) avait une taille moyenne de 319 um (à noter que deux populations sont supposées exister lorsque la fraction de participation est comprise entre 2,5 à 97,5%). Tri des pastilles Streptomyces fonction de la taille Micro-colonies des populations de grands et de petits granules ont été triés. A cet effet, la taille des granulés moyennes des deux populations ont été utilisés pour définir les limites pour le tri. Pellets de taille inférieure à 248 um ont été considérées comme de la petite population de granulés, alors que des pastilles de plus de 319 um ont été considérées comme de la grande population de pastilles (figure 3), de manière à limiter le tri de pastilles à partir de la partie de chevauchement des deux tailles distributions. L&#39;analyse microscopique de granulés triés montré leurs tailles différentes (figure 3). Les boulettes recueillies peuvent être en outre utilisées pour l&#39;ADN, l&#39;ARN, ou des isolements de protéines. &lt;img alt = &quot;Figure 1&quot; fo: contenu width = &quot;5 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1. Représentation schématique du dispositif expérimental pour mesurer et analyser pastilles Streptomyces utilisant COPAS. Pour plus de détails, voir les procédures expérimentales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Figure 2. Taille de Pellet hétérogénéité liquides cultivés cultures de Streptomyces. Analyse COPAS d&#39;un S. 2-day-old culture coelicolor YEME (A) indique que la taille des granulés (indiqués comme valeurs de temps de vol) ne sont normalement pas distribuerd (B), et ni le devenir quand transformées en log (C). Au lieu de cela, deux populations de pastilles qui diffèrent par TOF (et donc la taille) ont été détectés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figure 3. Fractionnement des pastilles Streptomyces selon la taille. Pellets avec une taille inférieure à 248 um (indiqué en rose) ont été considérés comme de petites pastilles, alors que des pastilles avec une taille supérieure à 319 um (indiqué en bleu) ont été considérées comme des grands granulés. L&#39;analyse microscopique a confirmé la différence de taille. Notez que ces formats ont été calculées à partir des données de log-transformées en utilisant la relation décrite entre TOF et le diameter d&#39;une pastille Streptomyces, ce qui équivaut à 0,57 × 159 + TOF um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

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Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Cultures de Streptomyces liquides cultivés sont caractérisés par des pastilles de mycélium qui sont de taille hétérogène. Nous décrivons ici une méthode pour analyser et trier ces pastilles de manière à haut débit. Ces pastilles peuvent être utilisées pour d&#39;autres analyses, qui fourniront conduit à comprendre et à contrôler l&#39;hétérogénéité de croissance.

Tri des<em&gt; Streptomyces</em&gt; culots cellulaires à l&#39;aide d&#39;un objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K vues.  Leiden University.  Cultures de Streptomyces liquides cultivés sont caractérisés par des pastilles de mycélium qui sont de taille hétérogène. Nous décrivons ici une méthode pour analyser et trier ces pastilles de manière à haut débit. Ces pastilles peuvent être utilisées pour d'autres analyses, qui fourniront conduit à comprendre et à contrôler l'hétérogénéité de croissance. 

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A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Un système multi-paramétriques Islet périfusion dans un dispositif microfluidique périfusion

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Recherche

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Tri cellulaire activée par fluorescence pour l’isolement des populations de cellules sclérosiennes

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Utilisation d’un analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel pour surveiller la bioénergétique des ostéoblastes

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...