Os autores agradecem a S. Douglas para discussões e conselhos extremamente valiosos, e todos os membros do laboratório Bachelet para discussões úteis e trabalho. Este trabalho é apoiado por subsídios da Faculdade de Ciências da Vida e do Instituto de Nanotecnologia e Materiais Avançados da Universidade de Bar-Ilan.

1. Preparação de Staples Piscina Mistura <ol><li> Encomendar liofilizado DNA grampos nanorrobôs em placas de 96 poços como listadas na Tabela 1 (ver Materiais) e normalizar a 10 nmol. Para uma descrição detalhada do projeto e da arquitetura do nanorrobô de DNA ver Ben-Ishay et al. 14 e Douglas et al. 15). </li><li> Reconstituir cada agrafo bem com DNase / RNase-ultrapura livre a uma concentração de 100 uM. Para agrafos normalizados para 10 nmol, reconstitua com 100 ul de água ultrapura. </li><li> Piscina juntas 20 ul de cada grampo usando um pipetador multicanal e uma bacia de solução estéril de 55 ml. Nota: Uma vez que a forma nanorrobô é composta de 254 filamentos descontínuas (incluindo Core, Edges, Puxadores e sequências de Guias, Tabela 1), a concentração de cada um dos grampos na piscina grampos é 394 nM. Retirar os agrafos da piscina grampo, ou adicionando um pouco diferente em volumes, pode reduzir consideravelmente o rendimento, ou de outro modo resultar em agregados não dobradas. </li></ol> 2. Preparação da Mistura de Reacção de Fabricação <ol><li> Para uma mistura de reação padrão usar 40 ul de M13mp18 viral genoma circular de DNA de cadeia simples, o que corresponde a 4 pmol de ADN andaime (100 de solução estoque nM, ver Materiais). A concentração final de andaime na mistura de fabricação é de 20 nm, volume final de 200 ul. <ol><li> Ajustar a quantidade de ADN de andaime de acordo com necessidades específicas; no entanto, manter a concentração final do ADN andaime na mistura de reacção a uma temperatura constante de 20 nM. </li></ol></li><li> Adicionar grampos de andaime para atingir uma razão de grampos de 1 a 10, respectivamente. Para uma concentração de 20 nM DNA andaime, cada uma concentração final os 254 grampos &#39;é de 200 nm. Para um volume de reacção final de 200 uL adicionar 102 uL da mistura de piscina grampos (secção 1.2). <ol><li> Adicionar sequências Portão específicos separadamente para the mistura reaccional de dobragem neste momento. Estes oligos são ordenados separadamente e necessitam de purificação por HPLC. Assegurar que os oligos porta estão presentes em uma solução 1:10 andaime para Portão relação sequência, isto é, 200 nM de cada oligo para uma concentração de 20 nM de andaime. Para um volume de reacção de dobrar 200 ul, adicionar 0,4 mL para cada um dos quatro oligo porta a uma concentração de caldo de 100 | iM. </li></ol></li><li> Adicionar 10x tampão TAE estoque para atingir uma concentração final de 1x TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM de EDTA). Para um volume de reacção de dobrar 200 ul, adicionar 20 ul de 10 x TAE. </li><li> Adicionar 1 M de MgCl2 para uma concentração final de 10 mM. Para um volume de reacção de dobrar 200 ul, adicionar 2 mL de 1 M de MgCl2. </li><li> Adicionar 36 ul de DNase / RNase isenta de água ultrapura com uma alcançar um volume final de 200 ul. </li><li> Amostras de vórtice e alíquota de 100 uL para tubos de PCR. Nota: Consultar especificação termociclador sobre os volumes máximos de reacção a serem utilizadas.Reduzindo o volume para atender a esses limites não vai reduzir os rendimentos obtidos. Os volumes de reacção acima do máximo especificado irá comprometer os rendimentos. </li></ol> 3. Temperatura Annealing Rampa de Reacção Fabrication <ol><li> Termociclador programa como segue: <ol><li> Rampa 85 ° C a 60 ° C a uma velocidade de 5 min / ° C. </li><li> Rampa 60 ° C a 4 ° C a uma velocidade de 75 min / ° C. </li><li> Manter a 4 ° C indefinidamente. </li></ol></li><li> Depois de fabricação terminou armazenar as amostras à temperatura de -20 ° C. </li></ol> 4. A remoção do Staples Excesso <ol><li> Adiciona-se 100 ul de mistura reaccional de dobragem a um filtro de centrífuga de 0,5 ml com um MWCO de 100 kDa. Guardar a uma amostra de 10 ul de pré-purificação nanorobôs para análise posterior. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 9.600 x g. </li><li> Adicionar 400 ul de tampão de dobragem (TAE 1X, MgCl 2 10 mM). </li><li> Repita os passos 4.2 e 4.3 vezes mais. </li><li>Centrifugar durante 5 minutos a 9.600 x g. </li><li> Recuperar o concentrado colocando o filtro de cabeça para baixo num tubo de microcentrífuga limpo e centrifugação durante 1 min a 9600 x g. Volumes finais pode variar dependendo do volume inicial da mistura de reacção de fabricação que foi colocado dentro do filtro. Tipicamente, um volume final de 25-60 ul de amostra concentrada nanorobot é obtido. </li><li> Medir a concentração de ADN nas amostras através de espectrofotómetro a 260 nm. Use peso molecular de 5,3 ug / pmol ao calcular as concentrações molares de amostras nanorrobôs. Nota: O coeficiente de extinção molar para dsDNA, 50 ug / OD 260, é suficiente para a maioria das aplicações. 48 ug / OD 260 leva em conta a timina poli ssDNA se estende aos grampos bordas. </li></ol> 5. Agarose Gel Eletroforese Análise de Dobrado Nanorobots <ol><li> Preparação de TBE 0,5x (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM), 2% de gel de agarose suplementada com 10 mM de MgCl2 </sub&gt; (adaptado de Ernesto Castro et al. 21): <ol><li> Prepare tampão TBE 0,5x por diluição de 6,25 ml de tampão de estoque de 10x TBE em 118,75 ml de DDH 2 O. </li><li> Dissolve-se 2,5 g de agarose em 125 ml de tampão TBE 0,5x. </li><li> Ferver em microondas até a agarose estar completamente dissolvida. </li><li> Adicionar 1,25 ml de 1 M MgCl2 a concentração final de 10 mM. </li><li> Adicionar 7 uL de 10 mg / ml de brometo de etídio. </li><li> Aguarde solução para um pouco fria e encher a bandeja de gel antes das solidifica gel de agarose. Instale pente desejado imediatamente. </li><li> Prepare 1 litro de tampão TBE 0,5x a executar pela adição de 50 ml de tampão de estoque de 10x TBE e 10 ml de 1 M de MgCl2 para 940 ml de ddH 2 O. </li><li> Uma vez que é de gel de suplemento sólido tampão de corrida para o dispositivo de electroforese e o dispositivo colocado num banho de gelo. </li></ol></li><li> DNA de carga 1 pg total da nanorobôs pré-purificação (passo 3.2), e pós purificação (passo 4.7), ao lado de um andaimeAmostra de ADN e um marcador de ADN de 1 kb, sobre o gel. Um exemplo é dado na Figura 2. Volumes reais de amostras depende das concentrações obtidas após purificação. Cada uma das amostras é carregado com tampão de carga a uma razão de 1: volume final 6. </li><li> Regule a fonte de energia para 80 V e executar gel durante 3 horas. Submeter o gel em um banho cheio de gelo e água. Nanorobots vai se desdobrar e aparecem como uma mancha se o gel de agarose aquece durante a electroforese. Durante a electroforese adicionar gelo adicional para manter dispositivo de aquecimento. </li><li> Ver em gel numa mesa de UV (Figura 2). </li></ol> 6. coloração negativa de nanorrobô com uranilo-formato <ol><li> Preparação da solução de 2% uranyl-formato (adaptado de Castro et al 23.): <ol><li> Pesar 100 mg de pó de uranilo-formiato para um tubo de 15 ml. </li><li> Ferva DNase / RNase água ultrapura livre por 3 min de-oxigenado. </li><li> Adicionar 5 ml de água quente deoxygenated (~ 60 ° C)para dentro do tubo de 15 ml que contém o pó de uranilo-formiato (a partir do passo anterior). Feche bem a tampa, embrulhe em folha de alumínio e vortex rigorosamente por 10 min (tubo de fechamento para um vórtice). Solução deve aparecer turva, com cor amarela. </li><li> Filtrar a solução através de uma seringa de 0,2 um fi ltro. Solução deve ficar clara. </li><li> Alíquota de 200 ul da solução em tubos de microcentrífuga. </li><li> Centrifuga-se a velocidade máxima durante 5 minutos numa centrífuga de topo de mesa para agrupar as amostras na parte inferior do tubo. </li></ol></li><li> Carregando de amostra a grade e coloração negativa: <ol><li> Descongelar uma alíquota de 200 ul de solução de uranilo-formiato de 2% (preparada na secção 6.1). Adicionar 10 ul de solução de NaOH 0,5 M e rigorosamente vortex durante 3 min. Centrifuga-se a velocidade máxima durante 5 minutos, utilizando uma centrífuga de topo de mesa. </li><li> Enquanto isso, a grade de descarga luminescente usando ar ambiente a 0,2 mbar e 25 mA durante 30 segundos. </li><li> Adicionar 15 ul de 2 nM amostra nanorrobô após purificação (seçem 4.7) para topside da grade (realizada com fórceps) e deixe absorver durante 1 min. Use papel fi ltro para drenar o excesso de líquido através da colocação da grade na parte superior do papel de filtro. Não toque na superfície da grelha. </li><li> Adicionar 10 ml de 2% uranyl-formato (do passo 6.2.1) para o topside da grade (realizada com uma pinça). </li><li> Rapidamente use papel fi ltro para drenar o excesso de líquido através da colocação da grade na parte superior do papel de filtro. Não toque na superfície da grelha. </li><li> Repita os passos 6.2.4 e 6.2.5. </li><li> Adicionar 10 ml de 2% uranyl-formato (do passo 6.2.1) para o topside da grade (realizada com uma pinça). Vamos solução de coloração absorver durante 30 segundos. </li><li> Use papel fi ltro para drenar o excesso de líquido através da colocação da grade na parte superior do papel de filtro. Não toque na superfície da grelha. </li><li> Deixe secar completamente a grade por pelo menos 30 min, viradas para cima em um papel de filtro, antes de injetar na TEM. </li></ol></li></ol>

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H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object.">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos a fabricação, a purificação, e a visualização da nanorobot ADN. Após o fabrico do chassi hexagonal do dispositivo, a função do nanorobot é programado com a simples introdução de carga específica e fios de detecção para o robô que facilmente encontrar a sua posição designada devido à complementaridade ligações de hidrogénio com os locais de ligação disponíveis de cadeia simples 14 , 15,22. O protocolo de fabricação descrito utiliza uma rampa d...

Os usos para os ácidos nucleicos nanotecnologia são surpreendentes. A rastreabilidade da base de emparelhamento de Watson-Crick, bem como a facilidade e baixo custo relativo de síntese em larga escala de feitos sob oligos 2 tem gerado uma explosão de aplicações 3 e pesquisas no campo da nanotecnologia de DNA. Nanotecnologia de ADN estrutural, com base no imóvel 4,5 junção Seeman como um bloco de construção fundamental faz uso de DNA como uma unidade elementar de auto-montagem para a construção de formatos arbitrários 6-8. O desenvolvimento recente do DNA origami scaffolded 9 técnica permite a construção de complexos nano-arquiteturas 2D / 3D 10-12 com precisão sub nanômetros e é uma rota eficiente para a construção de novos objetos funcionais com o aumento da complexidade e diversidade surpreendente. O processo baseia-se na construção de um ADN de cadeia simples de comprimento de andaime, usualmente derivada de um genom viralE, que pode ser dobrada através da hibridação de centenas de oligos simples e curtas de DNA strand denominado grampos. A resolução estrutural alta obtida por esta técnica é o resultado directo das dimensões naturais da dupla hélice de ADN, enquanto que a reprodutibilidade de fabricação é o resultado de adaptar as sequências descontínuas de cadeia simples curtos para facilitar o máximo de complementaridade ligações de hidrogénio realizáveis. Com a utilização de uma temperatura de recozimento a rampa lenta concebidos de menor energia, termodinamicamente nanoestrutura preferido é alcançado com altos rendimentos e fidelidade. A fácil implementação de regras de projeto de junção em um código de computador permitiu o desenvolvimento de ferramentas de CAD, tais como caDNAno 13, que extremamente simplificar a tarefa de projetar estruturas grandes e complexas que contêm centenas de cruzamentos conectados. Anteriormente tínhamos descrito o desenho de um nanorobot ADN com o auxílio da ferramenta de 14,15 caDNAno. Aqui nós retratam a fabricação evisualização, através de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), do nanorrobô, um nanodevice hexagonal oca 3D, com dimensões de 35 x 35 x 50 nm 3, destinado a sofrer uma grande mudança conformacional em resposta a um estímulo pré-determinados e presente de carga específica, tais como proteínas ou ácidos nucleicos oligos, sequestrado dentro. Enquanto 12 estações de carga estão disponíveis dentro do chassi oco, o número real de carga limite é diferente com o tamanho da carga. Moléculas de carga variam de pequenas moléculas de ADN de enzimas, anticorpos e nanopartículas de ouro 5-10 nm. Cargocan quer ser homogéneo ou heterogéneo, de modo a que cada nanorobot contém uma mistura de moléculas diferentes. Sensing é conseguido através de dois duplo helicoidal projeto portões de bloqueio para detectar proteínas, ácidos nucleicos ou outros produtos químicos, tanto baseada aptasensor 16,17 ou fita de DNA deslocamento 18 tecnologias. Desenvolvimentos recentes em protocolos de seleção de aptâmeros 19-21 permitir a concepção de nanorobôs respondera uma gama cada vez maior de moléculas e tipos de células. Trabalhos anteriores mostraram uma nanorobot transportando um anticorpo específico, o qual após se ligar ao seu antigénio pode transmitir quer um efeito inibitório ou um sinal prolífica para o interior de tipos específicos de células numa população de células misturada 15. Uma característica interessante destes nanodispositivos é a sua capacidade para realizar tarefas mais complexas e até mesmo controle de lógica com a introdução de diferentes subtipos nanorrobôs em uma única população. Recentemente, demonstrou subtipos específicos de nanorrobôs que exercem tanto como reguladores positivos ou negativos, controlando uma população efetoras contendo uma molécula de carga ativa 22. O protocolo aqui apresentado descreve a fabricação, de purificação e de imagem de um nanorobot fechado com sequências de aptâmero de sensores que se ligam selectivamente a PDGF para facilitar a abertura da nanorobot 15,22. O processo de fabrico descrito é semelhante ao nprocesso de fabricação anorobot inicialmente descrito por Douglas et al. 15, com as alterações que visam reduzir a duração total do processo, ao aumentar as taxas de rendimento e de purificação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNase/RNase free distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 ssDNA scaffold</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15558-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC510024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide 10mg/ml solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA marker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7021S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl formate</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24762</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon-coated TEM grids&#160;</td>
			<td>Science services</td>
			<td>EFCF400-Cu-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler c1000 Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge K100X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV table Gel Doc EZ Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI-G12</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

O nanorrobô de DNA é um dispositivo nanométrico hexagonal oco, projetado para abrir em resposta a estímulos específicos e presente de carga sequestradas no interior. Ambos os estímulos e carga podem ser adaptados de acordo com necessidades específicas. Aqui descrevemos o protocolo de fabricação nanorobot ADN, com a utilização da técnica de origami de DNA. O procedimento inicia através da mistura de grampos de ADN de cadeia simples curtos em uma mistura da qual é, em seguida, adicionada a uma longa, circular, de cadeia simples andaime ADN na presença de um tampão de renaturação. Um termociclador padrão é programado para baixar gradualmente a temperatura da reacção de mistura para facilitar o emparelhamento-a-grampos de andaime, a qual é a força condutora por detrás da dobragem da nanorobot. Uma vez que a reacção de dobragem 60 HR está completa, o excesso de grampos são desprezados, utilizando um filtro de centrífuga, seguido de visualização por meio de electroforese em gel de agarose (AGE). Finalmente, o fabrico com sucesso do nanorobot é verificada por microscopia electrónica de transmissão (TEM),com a utilização de uranilo-formiato como coloração negativa.

Os resultados representativos são mostrados na Figura 2A. Todas as pistas contêm 1 ug de ADN total, medido através de espectrofotómetro (OD 260). Em comparação com a circular andaime de ADN de cadeia simples (pista 2), nanorrobôs são prejudicadas no gel devido ao seu peso molecular mais elevado, o resultado de grampos hibridação com o ADN de andaime (Pista 3. Vermelho seta). A banda de baixo peso molecular na pista 3 representa grampos em excesso que não se ligam a...

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Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Dobragem e Caracterização de um robô Bio-responsivo a partir de ADN de Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.4K visualizações.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Inspirado Auto-montagem de Partículas estampados e Reconfigurável

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Química

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosídeos Trisfosfatos - Da síntese à Caracterização Bioquímica

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparação de Mica e silício substratos para análise do DNA Origami e Experimentação

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Gene-terapia inspirou Polycation revestimento para proteção de nanoestruturas de Origami de DNA

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic nanostructures. The high spatial precision of a DNA origami-templated assembly allows controlling the coupling between plasmonic resonances of individual particles and enables tailoring optical properties of the constructed nanostructures. Recently, chiral plasmonic systems attracted a lot of attention due to the strong correlation between the spatial configuration of plasmonic assemblies and their optical responses (e.g., circular dichroism [CD]). In this protocol, we describe the whole workflow for the generation of DNA origami-based chiral assemblies of gold nanorods (AuNRs). The protocol includes a detailed description of the design principles and experimental procedures for the fabrication of DNA origami templates, the synthesis of AuNRs, and the assembly of origami-AuNR structures. In addition, the characterization of structures using transmission electron microscopy (TEM) and CD spectroscopy is included. The described protocol is not limited to chiral configurations and can be adapted for the construction of various plasmonic architectures.

We describe the detailed protocol for the DNA origami-based assembly of gold nanorods into chiral plasmonic metamolecules with strong chiroptical responses. The protocol is not limited to chiral configurations and can be easily adapted for the fabrication of various plasmonic architectures.

Montagem de Nanobastões de Ouro em Metamoléculas Plasmônicas Quirais Usando Modelos de Origami de DNA

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

DNA origami-mediada substrato Nanopatterning de estruturas inorgânicas para aplicações de sensoriamento

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Medições SERS de molécula única habilitadas por nanoantenas de origami de DNA plasmônico

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) SERS is able to provide molecule-specific spectroscopic information about individual molecules and therefore yields more detailed chemical information than other SM detection techniques. At the same time, there is the potential to unravel information from SM measurements that remain hidden in Raman measurements of bulk material. This protocol outlines the SM SERS measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) in combination with atomic force microscopy (AFM) and Raman spectroscopy. A DNA origami fork structure and two gold nanoparticles are combined to form the DONAs, with a 1.2-2.0 nm gap between them. This allows an up to 1011-fold SERS signal enhancement, enabling measurements of single molecules. The protocol further demonstrates the placement of a single analyte molecule in a SERS hot spot, the process of AFM imaging, and the subsequent overlaying of Raman imaging to measure an analyte in a single DONA.

Autor em destaque: Medições de espalhamento Raman aprimoradas por superfície de molécula única habilitadas por nanoantenas de origami de DNA plasmônico  

This protocol demonstrates single-molecule surface-enhanced Raman scattering (SERS) measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) combined with colocalized atomic force microscopy (AFM) and Raman measurements.

Medidas de espalhamento Raman aprimoradas por superfície de molécula única habilitadas por nanoantenas de origami de DNA plasmônico

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...