Notre protocole est conçu pour sonder les mécanismes biophysiques régissant le transport de marchandises par des équipes de protéines motrices cytosquelettiques identiques ou dirigées de manière opposée. En utilisant l’origami d’ADN pour la construction moléculaire, cette méthode peut choisir pour le type, le nombre, et l’emplacement des moteurs sur les formes précises définies de cargaison. Bien que ce protocole se concentre sur les moteurs à base de microtubules dynein et kinésine, il est adaptable à la myosine moteur à base d’actine, ainsi qu’à d’autres systèmes protéiques qui fonctionnent en coopération.
Un aspect difficile de ce protocole est de maintenir l’intégrité et l’activité des protéines motrices tout au long du processus de purification, car elles sont sensibles à la chaleur et à la force mécanique. Pour induire la croissance et l’expression des protéines motrices par l’intermédiaire du promoteur de galactose, utilisez une baguette d’inoculation stérile pour stries de la souche de levure congelée d’intérêt sur une plaque de culture levure-peptone-dextrose pour une incubation de trois à quatre jours à 30 degrés Celsius. Le quatrième jour de la culture, lorsque la densité optique à 600 nanomètres se situe entre 1,5 et deux, recueillir les cellules de levure par centrifugation, et de réutiliser la pastille dans l’eau pour les laver et consolider les cellules en une seule bouteille.
Faites tourner les cellules à nouveau pour la collecte, et resuspendez la pastille dans environ deux millilitres d’eau double-distillée. Ensuite, utilisez une pipette de 10 millilitres pour distribuer lentement le lisier cellulaire dans de l’azote liquide une goutte à la fois pour produire des granulés de cellules de levure congelés. Pour la purification des protéines motrices, utilisez un moulin à café de type lame pré-refroidi avec de l’azote liquide pour moudre les granulés de levure congelés dans une poudre fine, et transférer la poudre de levure dans un bécher en verre pré-réfrigéré de 100 millilitres sur la glace.
Ajouter un petit volume de tampon de lyse 4X fraîchement préparé avec des suppléments à la poudre afin que la concentration finale du tampon ne dépasse pas 1X, et placer le bécher dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius avec agitation continue avec une spatule pour décongeler rapidement la poudre. Ajouter un tampon 4X supplémentaire avec des suppléments pour amener la concentration tampon finale à 1X dans le lysate. Le volume final se situe souvent entre 25 et 30 millilitres.
Puis recueillir les cellules de levure par centrifugation, et transférer la protéine soluble contenant supernatant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres sur la glace. Pour la purification de l’affinité IgG, ajouter 200 microlitres de suspension de perle d’affinité lavée à l’extrait de protéine, et incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant une heure avec rotation douce. À la fin de l’incubation, filtrer le mélange à travers la même colonne de chromatographie utilisée pour préparer les perles à quatre degrés Celsius, suivie de deux lavages avec cinq millilitres de tampon de lavage par lavage sur la glace.
Après le deuxième lavage, rincer les perles sur la glace avec cinq millilitres de tampon TEV, permettant au tampon de s’écouler complètement de la colonne. Pour l’étiquetage oligonucléotide d’ADN, plafonnez la colonne de chromatographie et incubez les perles motrices avec 100 microlitres de tampon TEV complétés par 10 à 20 micromolaires de l’oligo purifié de benzylguanine à température ambiante pendant 10 à 15 minutes, réutilisant doucement les perles une fois par minute. À la fin de l’incubation, laver les perles quatre fois avec un tampon TEV frais par lavage comme il vient de le démontrer, avant de recapping le fond du tube pour permettre la resuspension des perles motrices dans pas plus de 200 microlitres de tampon TEV frais.
Pour le clivage TEV, transférez la suspension de perle motrice dans un tube de microcentrifugeuse à fond rond de deux millilitres et incubez les perles motrices avec environ 0,3 unité de protéase TEV par microlitre de mélange de perles motrices à 16 degrés Celsius pendant une heure avec rotation douce. À la fin de l’incubation, centrifuger les perles motrices et recueillir le mélange au fond du tube. Ensuite, utilisez une pointe de pipette P1000 coupée pour transférer le mélange dans une colonne de spin, et centrifugez le mélange comme nous venons de le démontrer.
Recueillir le filtrate contenant le TEV-cleaved, moteurs purifiés, et aliquot le filtrate en volumes de 50 microlitres pour la purification de l’affinité microtubule. Puis flash congeler les aliquots dans l’azote liquide pour moins 80 degrés Celsius de stockage. Pour la purification du châssis, en fin d’après-midi de la veille de la purification, superposez doucement 80 microlitres chacun de concentration de glycérol dans un tampon pliant origami dans un tube de centrifugeuse.
Les limites entre les couches doivent être légèrement visibles. Après une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius, couche 10% glycérol dans origami tampon pliant dans la solution châssis plié sur la couche supérieure du gradient, et centrifuger le gradient avec le châssis. À la fin de la centrifugation, recueillir des fractions de 50 microlitres du gradient dans une direction de haut en bas, et charger cinq microlitres de chaque fraction dans des puits individuels d’un gel d’agarose de 2%.
Après 90 à 120 minutes à 70 volts, imagez le gel à l’aide de conditions adaptées à la tache de gel d’ADN utilisée. Les concentrations quantifiées des fractions d’intérêt sélectionnées peuvent être déterminées à l’aide des méthodes spectroscopiques standard appropriées. L’analyse SDS-PAGE peut être utilisée pour confirmer l’extraction réussie de la dynein à partir de levure, car le filtrate final montre une bande claire et nette à environ 350 kilodaltons.
La protéase TEV est également présente dans le filtrate final et forme une bande claire à environ 50 kilodaltons. Après purification d’affinité de microtubule, la dynein apparaît comme bande claire et simple à 350 kilodaltons, alors que la kinésine peut être observée comme frottis légèrement, bandes multiples à environ 120 kilodaltons. En plus de la protéase TEV, une quantité notable de tubuline peut également être observée dans le supernatant final.
Le pliage des structures origami d’ADN peut être apaisé par électrophoresis de gel d’agarose, avec un décalage dans la mobilité entre le brin pur d’échafaudage déplié et la réaction pliante indiquant le pliage d’origami. En outre, la réaction de pliage indique la présence d’une certaine multimérisation des structures du châssis. La motilité des ensembles de châssis moteurs est facilement détectable et mesurable sur les kymographes générés à partir des films TIRF, car les kymographes du châssis flexible conjugué à sept protéines de dynein démontrent des courses très processives à des vitesses relativement cohérentes.
Il est essentiel de contrôler soigneusement la température des protéines motrices à chaque étape de la procédure. Après la purification des protéines motrices et du châssis origami ADN, les deux composants peuvent être conjugués pour les analyses de motilité des ensembles sous un microscope TIRF. Cette méthode permet de déchiffrer les mécanismes biophysiques et biochimiques qui régissent la motilité émergente des ensembles moteurs.
