המחברים מבקשים להודות ס דאגלס לדיונים בעלי ערך רבים ועצות, וכל החברים של המעבדה באשל לדיונים מועילים ועבודה. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהפקולטה למדעי חיים והמכון לננוטכנולוגיה והחומרים מתקדמים באוניברסיטת בר-אילן.

1. הכנת תערובת סטייפלס בריכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכות להזמין lyophilized DNA nanorobot על 96-גם צלחות כמפורט בטבלה 1 (ראה חומרים) ולנרמל עד 10 ננומול. לתיאור מפורט של העיצוב והאדריכלות של nanorobot DNA לראות אל בן-ישי ואח &#39;. 14 ודאגלס et. 15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש כל מצרך היטב עם DNase / ultrapure RNase ללא בריכוז של 100 מיקרומטר. לסיכות מנורמלות 10 ננומול, מחדש עם המים ultrapure 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה יחד 20 μl של כל מצרך באמצעות pipettor רב ערוצי ואגן פתרון סטרילי 55 מיליליטר. הערה: מאחר שצורת nanorobot מורכבת של 254 גדילי מצרך (כולל Core, קצוות, ידיות ורצפי מדריכים, טבלת 1), הריכוז של כל אחד מהסיכות בבריכת הסיכות הוא 394 ננומטר. הסרת סיכות מבריכת מצרך, או להוסיף כמה בכרך שונהumes, עשויים להפחית את התשואה משמעותית, או בדרך אחרת לגרום לאגרגטים פרש. </li></ol> 2. הכנת תערובת תגובת ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתערובת תגובה סטנדרטית להשתמש 40 μl של ה- DNA הנגיפי M13mp18 הגנום מעגלי אחת גדיל, מתאים ל4 pmol של DNA פיגום (פתרון 100 מניות ננומטר, ראה חומרים). ריכוז סופי של פיגום בתערובת הייצור הוא 20 ננומטר, נפח סופי 200 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את כמות ה- DNA פיגום בהתאם לצרכים ספציפיים; עם זאת, לשמור על הריכוז הסופי של ה- DNA פיגום בתערובת התגובה ב20 ננומטר קבועים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סיכות להגיע פיגום ליחס סיכות של 1 עד 10, בהתאמה. לריכוז ה- DNA 20 הפיגום ננומטר, כל אחד מהריכוז הסופי של הסיכות 254 הוא 200 ננומטר. לμl 200 סופי נפח תגובה להוסיף 102 μl של תערובת בריכת סיכות (סעיף 1.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף רצפי שער ספציפיים בנפרד התערובת תגובה מתקפלת דואר בשלב זה. oligos אלה הורה בנפרד ודורשת טיהור HPLC. ודא שoligos השער נמצא ב01:10 פיגום לשער יחס רצף, כלומר 200 ננומטר של כל אוליגו לריכוז של 20 ננומטר פיגום. לμl 200 מתקפל נפח תגובה, להוסיף 0.4 μl לכל אחת מהארבעה אוליגו השער בריכוז מניית 100 מיקרומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10x חיץ מניית טה להגיע לריכוז סופי של 1X טה (40 מ&quot;מ טריס-אצטט, 1 mM EDTA). לμl 200 מתקפל נפח תגובה, להוסיף 20 μl של 10x טה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 M MgCl 2 לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ. לμl 200 מתקפל נפח תגובה, להוסיף 2 μl של 1 M MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 36 μl מים ultrapure החופשי DNase / RNase ליגיע נפח סופי של 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס וaliquot 100 μl דגימות לתוך צלוחיות PCR. הערה: התייעץ עם מפרט Cycler תרמית לגבי כמויות תגובה המרביות לשימוש.הקטנת הנפח לעמוד במגבלות אלה לא תפחית את התשואות שהשיגו. כרכי תגובה מעל המרבי שצוינו יסכן את התשואות. </li></ol> רמפה חישול 3. טמפרטורה של תגובת ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cycler תרמית תכנית אחריו כמו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמפה 85 מעלות צלזיוס עד 60 מעלות צלזיוס בשיעור של 5 דקות / מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמפה 60 ° C ל- C ° 4 בשיעור של 75 דק &#39;/ מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק ב 4 ° C ללא הגבלת זמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הייצור הסתיים דגימות חנות ב -20 ° C. </li></ol> 4. ההסרה של סטייפלס העודף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לתערובת תגובה מתקפלת 100 μl למסנן צנטריפוגלי 0.5 מיליליטר עם MWCO של 100 kDa. להציל את מדגם 10 μl של nanorobots מראש טיהור לניתוח מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 9,600 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl של חיץ מתקפל (1x טה, 10 מ&quot;מ MgCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.2 ו -4.3 פעמיים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">צנטריפוגה במשך 5 דקות ב9,600 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את התרכיז על ידי הצבת המסנן הפוכה בצינור microcentrifuge נקי וספין 1 דקות ב9,600 x גרם. כרכים סופיים עשויים להשתנות בהתאם לכמות הראשונית של תערובת תגובת ייצור שהוכנסה למסנן. בדרך כלל נפח סופי 25-60 μl של מדגם nanorobot המרוכז מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז של ה- DNA בדגימות באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר. השתמש במשקל מולקולרי של 5.3 מיקרוגרם / pmol בעת חישוב ריכוזים טוחנות של דגימות nanorobot. הערה: מקדם טוחנת ההכחדה לdsDNA, 50 מיקרוגרם / OD 260, מספיק עבור רוב היישומים. 48 מיקרוגרם / OD 260 לוקח בחשבון את תימין פולי ssDNA משתרע בסיכות קצוות. </li></ol> 5. Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה ניתוח של nanorobots המקופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת TBE 0.5x (45 מ&quot;מ טריס-Borate, 1 mM EDTA), 2% agarose ג&#39;ל בתוספת 10 מ&quot;מ MgCl 2 </sub&gt; (מותאם מאל ארנסטו קסטרו et 21.): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר TBE 0.5x על ידי דילול 6.25 מיליליטר של חיץ מניות 10x TBE ב118.75 מיליליטר של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2.5 גרם של agarose ב125 מיליליטר של חיץ TBE 0.5x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים במיקרוגל עד agarose הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.25 מיליליטר של 1 M MgCl 2 לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר ethidium ברומיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה לפתרון למעט קריר ולמלא את מגש ג&#39;ל לפני מתמצק agarose ג&#39;ל. התקן מסרק הרצוי באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן L 1 TBE 0.5x הפעלת מאגר על ידי הוספת 50 מיליליטר של חיץ מניות 10x TBE ו -10 מיליליטר של 1 M MgCl 2-940 מיליליטר של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ג&#39;ל הוא תוספת מוצקה הפעלת מאגר למכשיר אלקטרופורזה ומכשיר לשים באמבט קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה- DNA 1 מיקרוגרם העומס הכולל של טרום טיהור nanorobots (שלב 3.2), ולאחר טיהור (שלב 4.7), לצד פיגוםדגימת DNA וסמן ה- DNA 1 KB, על ג&#39;ל. דוגמא ניתנת באיור 2. כרכים בפועל של דגימות תלויות בריכוזים המתקבלים לאחר טיהור. כל דגימות טעונה עם חיץ טעינה של 1: יחס נפח סופי 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר מקור כוח 80 V ולהפעיל ג&#39;ל למשך 3 שעות. הפעל את הג&#39;ל באמבט מלא בקרח ומים. Nanorobots יתפתח ויופיע ככתם אם agarose ג&#39;ל מתחמם במהלך אלקטרופורזה. במהלך אלקטרופורזה להוסיף קרח נוסף כדי לשמור על מכשיר מהחימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בג&#39;ל על שולחן UV (איור 2). </li></ol> 6. כתמים שליליים של Nanorobot עם Uranyl-formate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של 2% מניות פתרון uranyl-formate (מותאמת מאל קסטרו et 23.): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל של אבקת uranyl-formate 100 מ&quot;ג לתוך צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים ultrapure החופשי הרתיחה DNase / RNase 3 דקות לדה-חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של מים חמים deoxygenated (~ 60 מעלות צלזיוס)לתוך הצינור המכיל 15 מיליליטר אבקת uranyl-formate (מהשלב קודם). מהדקת את המכסה, לעטוף בנייר אלומיניום ומערבולת בקפדנות במשך 10 דקות (צינור להדק מערבולת). פתרון צריך להופיע עכור עם צבע צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון סינון באמצעות ניטור ארוך טווח אלחוטי מזרק 0.2 מיקרומטר. פתרון צריך להיות ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 200 μl של הפתרון לתוך צינורות microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות מקסימלית של 5 דקות בצנטריפוגה בראש הטבלה לדגימות בריכה בחלק התחתון של הצינור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינה של מדגם לרשת ומכתים שלילי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot 200 μl של 2% פתרון uranyl-formate (מוכן בסעיף 6.1). הוסף 10 μl של 0.5 פתרון M NaOH ומערבולת בקפדנות במשך 3 דקות. צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, רשת זוהר פריקה באמצעות אוויר חדר בmbar 0.2 ו -25 mA למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של 2 מדגם nanorobot ננומטר לאחר טיהור (sectiעל 4.7) על גבי רשת של למעלה (שנערך עם מלקחיים) ולתת לספוג דקות 1. השתמש בנייר אקולוגי ארוך טווח אלחוטי לניקוז הנוזל העודף על ידי הצבת הרשת על גבי נייר הסינון. אל תיגע במשטח הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 2% uranyl-formate (משלב 6.2.1) על גבי רשת של למעלה (שנערך עם מלקחיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להשתמש בנייר אקולוגי ארוך טווח אלחוטי לניקוז הנוזל העודף על ידי הצבת הרשת על גבי נייר הסינון. אל תיגע במשטח הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.2.4 ו6.2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 2% uranyl-formate (משלב 6.2.1) על גבי רשת של למעלה (שנערך עם מלקחיים). בואו פתרון מכתים לספוג למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר אקולוגי ארוך טווח אלחוטי לניקוז הנוזל העודף על ידי הצבת הרשת על גבי נייר הסינון. אל תיגע במשטח הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הרשת להתייבש לחלוטין לפחות 30 דקות, עם פנים כלפי מעלה על נייר סינון, לפני הזרקה לתוך TEM. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetical+implications+of+the+structure+of+deoxyribonucleic+acid.">Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 171, 964-967 (1953).</li><li>Kosuri, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+de+novo.+DNA+synthesis:+technologies+and+applications.">Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications.</a> Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).</li><li>Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+structural+DNA+nanotechnology.">Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology.</a> Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).</li><li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+junctions+and+lattices.">Nucleic acid junctions and lattices.</a> J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).</li><li>Chen, J. H., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+from+DNA+of+a+molecule+with+the+connectivity+of+a+cube.">Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube.</a> Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).</li><li>Wei, B., Dai, M., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+shapes+self-assembled+from+single-stranded+DNA+tiles.">Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles.</a> Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321 (5890), 824-826 (2008).</li><li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+DNA+nanotechnology:+state+of+the+art+and+future+perspective.">Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective.</a> J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).</li><li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno.">Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li><li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami.">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> J Vis Exp. (77), e50268 (2013).</li><li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads.">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li><li>Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+from+cell-based+selection+for+bioanalytical+applications.">Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications.</a> Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamer-Guided+Cancer+Therapeutics+and+Diagnostics:+The+Next+Generation+of+Cancer+Medicine.">Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine.</a> Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).</li><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions.">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).</li><li>Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+aptamers+for+recognition+of+virus-infected+cells.">Generating aptamers for recognition of virus-infected cells.</a> Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).</li><li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX.">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li><li>McKeague, M., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+for+Small+Molecule+Aptamer+Development.">Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development.</a> J Nucleic Acids. 2012, (2012).</li><li>Amir, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+computing+by+DNA+origami+robots+in+a+living+animal.">Universal computing by DNA origami robots in a living animal.</a> Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).</li><li>Castro, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+scaffolded+DNA+origami.">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).</li><li>Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+folding+of+DNA+into+nanoscale+shapes+at+constant+temperature.">Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature.</a> Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).</li><li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).</li><li>Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object.">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

תארנו את הייצור, טיהור, ויזואליזציה של nanorobot DNA. בעקבות ייצור של מארז המשושה של המכשיר, הפונקציה של nanorobot מתוכנת עם ההקדמה הפשוטה של מטען ספציפי וגדילי חישה לרובוט שבקלות למצוא את המיקום המיועד שלהם עקב השלמת מימן מליטה עם אתרי עגינה אחת הגדיל זמין 14 , 15,22. <p class="j...

השימושים לננוטכנולוגיה חומצות גרעין הם מדהימים. נְהִילוּת של זיווג הבסיס ווטסון-קריק, כמו גם את הקלות והבעלות נמוכה היחסית של סינתזה בקנה מידה גדולה של oligos מחוייט 2 ניב פרץ של יישומים 3 ומחקר בתחום הננו-טכנולוגיה ה- DNA. המבנית DNA ננוטכנולוגיה, המבוססת על 4,5 צומת Seeman הנייחת כאבן בניין בסיסית עושה שימוש בדנ&quot;א כיחידה יסודי הרכבה עצמית לבניית צורות שרירותיות 6-8. הפיתוח האחרון של טכניקת אוריגמי 9 DNA הפיגומים מאפשר לבניית ננו-ארכיטקטורות 2D / 3D המורכבות 10-12 עם דיוק תת-ננומטר והוא מסלול יעיל לבניית אובייקטים פונקציונליים חדשים עם מורכבות גוברים וגיוון מדהים. תהליך הבנייה מבוסס על ה- DNA חד גדילי פיגום ארוך, בדרך כלל נגזר מgenom נגיפידואר, אשר יכול להיות מקופל באמצעות ההכלאה של מאות oligos DNA הגדיל הבודד הקצר כינה סיכות. הרזולוציה הגבוהה המבנית מתקבלת על ידי טכניקה זו היא התוצאה הישירה של הממדים הטבעיים של סליל הדנ&quot;א הכפול, תוך שחזור של ייצור הוא התוצאה של התאמת רצפי מצרך יחיד גדיל הקצר כדי להקל על השלמת מימן מליטה המרבית השגה. עם השימוש של חישול בטמפרטורה איטי רמפה הנמוכה ביותר באנרגיה המיועדת, thermodynamically ננו-המבנה העדיף הוא הגיע בתשואות ונאמנות גבוהות. היישום קל של כללי עיצוב צומת בקוד מחשב אפשר הפיתוח של כלים CAD, כגון 13 caDNAno, שמאוד לפשט את המשימה של תכנון מבנים גדולים, מורכבים המכילים מאות צמתים מחוברות. בעבר תאר את העיצוב של nanorobot DNA בעזרת כלי 14,15 caDNAno. כאן אנו מציגים את הייצור והדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), של nanorobot, nanodevice משושה החלול 3D, עם ממדים של 35 x 35 x 50 3 ננומטר, שנועדו לעבור שינוי קונפורמציה גדול בתגובה לגירויים שנקבעו מראש ומטען ספציפי נוכחי, כגון חלבונים או oligos חומצות גרעין, מוחרם בפנים. בעוד 12 תחנות טעינה זמינות בתוך המארז החלול, המספר האמיתי של מטען קשור שונה עם גודל מטען. מולקולות מטען נעות בין מולקולות DNA קטנות לאנזימים, נוגדנים ו5-10 חלקיקי זהב ננומטר. Cargocan או להיות אחיד או הטרוגנית, כך שכל nanorobot מכיל תערובת של מולקולות שונות. חישה מושגת באמצעות שני עיצוב שערי נעילת סליל כפול לחוש חלבונים, חומצות גרעין או כימיקלים אחרים, המבוססת גם על aptasensor עקירת 16,17 או גדיל DNA 18 טכנולוגיות. ההתפתחויות אחרונות בפרוטוקולי בחירת aptamer 19-21 לאפשר העיצוב של nanorobots להגיבלמגוון הולך וגדל של מולקולות ותאים מסוגים. העבודה קודמת הראתה nanorobot נושא נוגדנים ספציפיים, אשר על הכריכה לאנטיגן שלה יכולה להעביר גם אות פורה לחלק הפנימי של סוגי תאים מסוימים באוכלוסיית תאים מעורבת 15 מעכבת או. תכונה מרגשת של ננו-התקנים אלה היא היכולת שלהם לבצע אפילו יותר משימות מורכבות ושליטה היגיון עם ההקדמה של תת nanorobot שונה באוכלוסייה אחת. לאחרונה הפגינו תת-סוגים ספציפיים של nanorobots ביצוע כמו גם רגולטורים חיוביים או שליליים, השליטה אוכלוסיית מפעיל המכילה מולקולת מטען פעילה 22. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את הייצור, טיהור והדמיה של nanorobot מגודר עם רצפי חיישן aptamer המחייבים באופן סלקטיבי לPDGF כדי להקל על פתיחת nanorobot 15,22. תהליך הייצור המתואר דומה לnתהליך ייצור anorobot תחילה מתואר על ידי דאגלס et al. 15 עם שינויים שמטרתה צמצום משך תהליך כולל, תוך הגדלת שיעורי התשואה וטיהור.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNase/RNase free distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 ssDNA scaffold</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15558-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC510024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide 10mg/ml solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA marker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7021S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl formate</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24762</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon-coated TEM grids&#160;</td>
			<td>Science services</td>
			<td>EFCF400-Cu-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler c1000 Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge K100X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV table Gel Doc EZ Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI-G12</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

Nanorobot DNA הוא מכשיר חלול משושה ננומטריים, שנועד לפתוח בתגובה לגירויים ספציפיים ובהווה מטען מוחרם בפנים. ניתן להתאים גירויים ומטען שני בהתאם לצרכים ספציפיים. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ייצור nanorobot DNA, עם השימוש בטכניקת אוריגמי DNA. ההליך יוזם על ידי ערבוב סיכות DNA חד-גדיל קצרים לתערובת מניות אשר לאחר מכן הוסיפה לפיגום ארוך, עגול, אחד גדיל DNA בנוכחותו של חיץ מתקפל. Cycler תרמו סטנדרטי מתוכנת להוריד את טמפרטורת תגובת ערבוב בהדרגה כדי להקל על חישול סיכות ל- פיגום, שהוא הכוח המנחה מאחורי הקיפול של nanorobot. ברגע שהתגובה מתקפל 60 שעות שלמה, סיכות עודפות מבוטלים באמצעות מסנן צנטריפוגלי, ואחריו להדמיה באמצעות אלקטרופורזה agarose-ג&#39;ל (גיל). לבסוף, ייצור מוצלח של nanorobot מאומת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM),עם השימוש בuranyl-formate ככתם שלילי.

נציגי תוצאות מוצגות באיור 2 א. כל הנתיבים מכילים 1 מיקרוגרם של ה- DNA הכולל, נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר (OD 260). בהשוואה לפיגום DNA חד-גדיל העגול (ליין 2), nanorobots הם הפריעו בג&#39;ל בשל המשקל המולקולרי גבוה יותר שלהם, התוצאה של הכלאת סיכות ל- DNA הפיגום (ליין 3. חץ אדום)...

Watch this Scientific Journal Video about Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami at JoVE.com

קיפול ואפיון של רובוט מגיב ביו מ-DNA Origami | כימיה | וִידֵאוֹ

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

folding-characterization-bio-responsive-robot-from-dna

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Chemistry

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

14.4K Views.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

Video: Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

אוריגמי השראה עצמית הרכבה של חלקיקים בדוגמת וReconfigurable

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

הכנת מצעים נציץ והסיליקון לDNA אוריגמי ניתוח וניסויים

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar concentration forming hydrophobic cores surrounded by hydrophilic shells in aqueous environments. The core of these micelles can be utilized to load hydrophobic, poorly water soluble drugs like docetaxel (DTX) and everolimus (EVR). Systematic characterization of the micelle structure and drug loading capabilities are important before in vitro and in vivo studies can be conducted. The goal of the protocol described herein is to provide the necessary characterization steps to achieve standardized micellar products. DTX and EVR have intrinsic solubilities of 1.9 and 9.6 &#181;g/ml respectively Preparation of these micelles can be achieved through solvent casting which increases the aqueous solubility of DTX and EVR to 1.86 and 1.85 mg/ml, respectively. Drug stability in micelles evaluated at room temperature over 48 hr indicates that 97% or more of the drugs are retained in solution. Micelle size was assessed using dynamic light scattering and indicated that the size of these micelles was below 50 nm and depended on the molecular weight of the polymer. Drug release from the micelles was assessed using dialysis under sink conditions at pH 7.4 at 37 oC over 48 hr. Curve fitting results indicate that drug release is driven by a first order process indicating that it is diffusion driven.

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

הכנה ואפיון של פרט ורב-סמים נטענים בפח פיזי Micelles פולימרית

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

ריפוי גנטי בהשראת Polycation ציפוי הגנה על ה-DNA אוריגמי Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...