Die Autoren danken S. Douglas für äußerst wertvolle Diskussionen und Beratung, und alle Mitglieder der Bachelet Labor für hilfreiche Diskussionen und Arbeit danken. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse von der Fakultät für Lebenswissenschaften und Institut für Nanotechnologie und Neue Materialien an der Bar-Ilan-Universität unterstützt.

1. Herstellung von Staples Pool Mixture <ol><li> Sortieren lyophilisiert DNA Nanorobotik Heftklammern auf 96-Well-Platten, wie in Tabelle 1 aufgeführt (siehe Materialien) und zu normalisieren, um 10 nmol. Für eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion und Architektur des DNA Nanoroboters siehe Ben-Ishay et al. 14 und Douglas et al. 15). </li><li> Rekonstituieren Stapel gut mit DNase / RNase-freies Reinstwasser auf eine Konzentration von 100 uM. Für Heftklammern bis 10 nmol normalisiert, auflösen mit 100 ul von ultrareinem Wasser. </li><li> Pool zusammen 20 ul jeder Klammer mit einer Mehrkanalpipette und ein steriles 55 ml-Lösung Becken. Hinweis: Da der Nanorobotik Form von 254 Heftstränge (einschließlich Kern, Kanten, Griffe und Guides Sequenzen, Tabelle 1), die Konzentration von jedem der Heftklammern in der Heftklammern Pool umfasste ist 394 nM. Entfernen von Heftklammern aus der Heftklammer-Pool oder das Hinzufügen einige an verschiedenen volUMEs, kann die Ausbeute deutlich zu reduzieren, oder auf andere Weise in ungefalteten Aggregate führen. </li></ol> 2. Herstellung von Fabrication Reaktionsgemisch <ol><li> Für ein Standard-Reaktionsgemisch zu verwenden 40 ul M13mp18 viralen Genoms kreisförmigen Einzelstrang-DNA, entsprechend 4 pmol Gerüst DNA (100 nM Stammlösung, siehe Materialien). Endkonzentration von Gerüst bei der Herstellung Gemisch 20 nM, Endvolumen 200 ul. <ol><li> Stellen Sie die Höhe der Gerüst DNA nach deren spezifischen Bedürfnissen; Jedoch halten die Endkonzentration von Gerüst-DNA in der Reaktionsmischung auf einem konstanten 20 nM. </li></ol></li><li> Hinzufügen Klammern an ein Gerüst, Klammern Verhältnis von 1 zu 10 zu erreichen sind. Für ein 20 nM Gerüst-DNA-Konzentration ist jede Endkonzentration 254 Staples 200 nM. Für eine 200 ul Endreaktionsvolumen fügen 102 ul der Heftklammern Pool Mischung (Abschnitt 1.2). <ol><li> In bestimmten Gate-Sequenzen getrennt zu the Klappreaktionsgemisch zu diesem Zeitpunkt. Diese Oligos sind separat zu bestellen und erfordern HPLC-Reinigung. Stellen Sie sicher, dass Tor Oligos in einer 1.10 Gerüst Tor Sequenz Verhältnis vorliegen, dh 200 nM jedes Oligos für eine 20 nM Gerüst Konzentration. Für ein 200 &amp; mgr; l Reaktionsvolumen Falten, je 0,4 &amp; mgr; l für jede der vier Gatter Oligo bei 100 uM Stammkonzentration. </li></ol></li><li> Hinzufügen 10x TAE Lager Puffer zu einer endgültigen Konzentration von 1x TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) zu erreichen. Für eine 200 ul Klappreaktionsvolumen, fügen Sie 20 ul 10x TAE. </li><li> 1 M MgCl 2 zu einer Endkonzentration von 10 mM. Für eine 200 ul Klappreaktionsvolumen, fügen Sie 2 ul 1 M MgCl 2. </li><li> Hinzuzufügen 36 ul DNase / RNase frei Reinstwasser ein Erreichbarkeits ein Endvolumen von 200 ul. </li><li> Vortex und aliquoten 100 ul Proben in PCR-Röhrchen. Hinweis: Wenden Thermocycler-Spezifikation in Bezug auf die zu verwendenden maximalen Reaktionsvolumina.Verringerung des Volumens, um diese Grenzen erfüllen nicht die erzielten Ausbeuten reduzieren. Reaktionsvolumina über dem angegebenen werden die Erträge beeinträchtigen Maximum. </li></ol> 3. Temperaturglühen Ramp von Fabrication Reaction <ol><li> Programm Thermocycler wie folgt: <ol><li> Rampe 85 ° C bis 60 ° C mit einer Geschwindigkeit von 5 min / ºC. </li><li> Rampe 60 ° C bis 4 ° C bei einer Geschwindigkeit von 75 min / ºC. </li><li> Halten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit. </li></ol></li><li> Nach der Herstellung hat Proben bei -20 ° C beendet. </li></ol> 4. Entfernung von überschüssigem Staples <ol><li> 100 ul Klappreaktionsgemisch auf ein 0,5 ml Zentrifugalfilter mit einem MWCO von 100 kDa. Speichern Sie eine 10 ul Probe der Nanoroboter Vorreinigung für eine spätere Analyse. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 9.600 x g. </li><li> Fügen Sie 400 ul Faltungspuffer (1x TAE, 10 mM MgCl 2). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 zwei weitere Male. </li><li>Zentrifuge für 5 min bei 9.600 x g. </li><li> Wiederherstellen des Konzentrats, indem Sie den Filter auf den Kopf in einem sauberen Mikrozentrifugenröhrchen und Spin für 1 min bei 9600 x g. Endvolumina je nach Ausgangsvolumen der Fertigung Reaktionsmischung, die in den Filter gesetzt wurde, variieren. Typischerweise ein 25-60 ul Endvolumen konzentrierte Nanoroboters Probe erhalten. </li><li> Messung der DNA-Konzentration in den Proben mittels Spektrophotometer bei 260 nm. Verwenden Molekulargewicht von 5,3 g / pmol bei der Berechnung der molaren Konzentrationen von Nanorobotik Proben. Anmerkung: Der molare Extinktionskoeffizient für dsDNA, 50 ug / OD 260, reicht für die meisten Anwendungen. 48 &amp; mgr; g / OD 260 berücksichtigt die Poly Thymin ssDNA erstreckt sich an den Rändern Klammern. </li></ol> 5. Agarose-Gel-Elektrophorese Die Analyse der Folded Nanoroboter <ol><li> Herstellung von 0,5x TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA), 2% Agarosegel mit 10 mM MgCl 2 supplementiert </sub&gt; (von Ernesto Castro et al angepasst. 21): <ol><li> Bereiten 0,5x TBE-Puffer durch Verdünnen von 6,25 ml 10x TBE stock Puffer in 118,75 ml ddH 2 O. </li><li> Aufzulösen 2,5 g Agarose in 125 ml 0,5 x TBE-Puffer. </li><li> Sieden Mikrowelle, bis die Agarose vollständig gelöst ist. </li><li> Hinzufügen 1,25 ml 1 M MgCl 2 zu einer Endkonzentration von 10 mM. </li><li> Hinzufügen 7 ul 10 mg / ml Ethidiumbromid. </li><li> Warten Sie, bis Lösung etwas abkühlen lassen und füllen Sie den Gelträger, bevor die Agarose-Gel verfestigt. Installieren Sie die gewünschten Kamm sofort. </li><li> Vorbereitung 1 L 0,5x TBE Laufpuffer durch Zugabe von 50 ml 10x TBE Stammpuffer und 10 ml 1 M MgCl 2 bis 940 ml ddH 2 O. </li><li> Sobald Gel ist solide Add Laufpuffer in die Elektrophoresevorrichtung und legte Gerät in einem Eisbad. </li></ol></li><li> Last 1 &amp; mgr; g Gesamt-DNA des Nanoroboter Vorreinigung (Schritt 3.2), und nach der Reinigung (Schritt 4.7), neben einem GerüstDNA-Probe und eine 1 kb DNA-Marker, auf das Gel. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 wiedergegeben. Die tatsächliche Probenvolumina hängen von den nach der Reinigung erhalten Konzentrationen. 6 Endvolumen Verhältnis: jeweils Proben mit Beladungspuffer bei einer 1 geladen. </li><li> Set Stromquelle auf 80 V und führen Gel für 3 Stunden. Führen Sie das Gel in einem Bad mit Eis und Wasser gefüllt. Nanoroboter wird sich entfalten und erscheinen als ein Abstrich, wenn das Agarose-Gel erwärmt sich während der Elektrophorese. Während der Elektrophorese fügen Sie zusätzliche Eis zum Gerät von Heizung zu halten. </li><li> Anzeigen Gel auf einem UV-Tabelle (Figur 2). </li></ol> 6. Negative Stain von Nanoroboter mit Uranyl Formiat- <ol><li> Herstellung von 2% Uranyl Formiat-Stammlösung (Castro et al angepasst. 23): <ol><li> Wiegen Sie 100 mg Uranyl Formiat-Pulver in einen 15-ml-Tube. </li><li> Boil DNase / RNase frei von ultrareinem Wasser für 3 min zu de-Sauerstoffverbindung. </li><li> 5 ml desoxygeniertem heißem Wasser (~ 60 ° C)in die 15 ml Röhrchen mit dem Uranyl Formiat-Pulver (aus dem vorherigen Schritt). Dicht schließende Deckel, in Alufolie wickeln und Wirbel konsequent für 10 min (fasten Rohr zu einem Vortex). Lösung sollte trüb mit gelber Farbe angezeigt. </li><li> Filter-Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter. Lösung sollte klar sein. </li><li> 200 ul Aliquot der Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 min in einer Tischzentrifuge zur Poolproben an der Unterseite des Rohres. </li></ol></li><li> Laden der Probe auf Raster und negative Färbung: <ol><li> Tauen Sie eine 200-ul-Aliquot von 2% Uranylacetat-Formiatlösung (in Abschnitt 6.1) hergestellt. In 10 ul 0,5 M NaOH-Lösung und Wirbel konsequent für 3 min. Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 Minuten unter Verwendung einer Tischzentrifuge. </li><li> Inzwischen Glimmentladung Gitter mit Raumluft bei 0,2 mbar und 25 mA für 30 Sekunden. </li><li> In 15 ul 2 nM Nanorobotik Probe nach der Reinigung (Abschnitauf 4.7) auf Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten) und lassen Sie absorbieren für 1 min. Verwenden Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter über dem Filterpapier abtropfen. Die Gitteroberfläche nicht berühren. </li><li> Zugabe von 10 ul 2% Uranylacetat-Formiat (aus Schritt 6.2.1) auf der Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten werden). </li><li> Benutzen schnell Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter auf der Oberseite des Filterpapier abtropfen lassen. Die Gitteroberfläche nicht berühren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.2.4 und 6.2.5. </li><li> Zugabe von 10 ul 2% Uranylacetat-Formiat (aus Schritt 6.2.1) auf der Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten werden). Lassen Färbelösung absorbieren 30 Sek. </li><li> Verwenden Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter über dem Filterpapier abtropfen. Die Gitteroberfläche nicht berühren. </li><li> Ließ das Gitter vollständig trocknen für mindestens 30 min, nach oben auf ein Filterpapier, vor dem Einspritzen in das TEM. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschrieben die Herstellung, Reinigung und Visualisierung der DNA-Nanoroboter. Nach der Herstellung des hexagonalen Chassis der Vorrichtung wird die Funktion des Nanoroboters mit der einfachen Einführung spezifischer Ladung und Erfassen Stränge an den Roboter, die leicht zu finden ihre bestimmten Position aufgrund von Wasserstoffbrücken Komplementarität vorhanden einsträngigen Andockstellen 14 programmiert , 15,22. Die beschriebenen Herstellungsprotokoll verwen...

Die Einsatzmöglichkeiten für Nukleinsäuren Nanotechnologie sind erstaunlich. Die Lenkbarkeit des Watson-Crick-Basenpaarung sowie die einfache und relativ kostengünstige großtechnische Synthese von maßgeschneiderten Oligos 2 hat eine Explosion von Anwendungen 3 und Forschung auf dem Gebiet der DNA-Nanotechnologie erzeugt. Strukturelle DNA Nanotechnologie, bezogen auf das immobile Seeman Kreuzung 4,5 als grundlegender Baustein macht Verwendung von DNA als eine selbstorganisierende Elementareinheit für die Konstruktion von beliebigen Formen 6-8. Die jüngste Entwicklung der rüstet DNA-Origami-9-Technik ermöglicht die Konstruktion von komplexen 2D- / 3D-Nanoarchitekturen 10-12 mit Sub-Nanometer Präzision und ist ein effizienter Weg für den Bau neuer funktionale Objekte mit zunehmender Komplexität und erstaunliche Vielfalt. Der Bauprozess wird auf eine lange Gerüsteinzelstrang-DNA basiert, in der Regel von einem viralen Genom abgeleitete, der durch die Hybridisierung von Hunderten von kurzen Einzelstrang-DNA-Oligos gefaltet werden kann bezeichnet Heftklammern. Die hohe Strukturauflösung durch diese Technik erhalten ist das direkte Ergebnis der natürlichen Dimensionen der DNA-Doppelhelix, während die Reproduzierbarkeit der Herstellung ist das Ergebnis der Anpassung der kurzen Einzelstrang-Stapelsequenzen, um die maximale Wasserstoffbrücken Komplementarität erreichbar zu erleichtern. Mit dem Einsatz von einem langsamen Temperaturglühen Rampe die entworfen niedrigsten Energie, in hohen Ausbeuten und Treue thermodynamisch bevorzugte Nanostruktur erreicht wird. Die einfache Umsetzung der Kreuzung Design-Regeln in einem Computercode aktiviert die Entwicklung von CAD-Tools, wie caDNAno 13, die extrem vereinfachen die Aufgabe der Gestaltung großer, komplexer Strukturen, die Hunderte von Übergängen verbunden. Zuvor beschrieben wir die Konstruktion eines DNA-Nanoroboter mit Hilfe des caDNAno Werkzeug 14,15. Die Herstellung Hier zeigen wir, undVisualisierung, über Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), der Nanoroboter, einem 3D hohlen sechseckigen Nanovorrichtung, mit den Abmessungen von 35 x 35 x 50 nm 3, entworfen, um eine große Konformationsänderung in Reaktion auf eine vorbestimmte Stimuli und Gegenwart spezifische Ladung, unterzogen werden wie wie Proteine ​​oder Nukleinsäure-Oligos, abgesondert innen. Während 12 Verladestationen stehen innerhalb der hohlen Gehäuse, die tatsächliche Anzahl der gebundenen Ladung unterscheidet mit Ladung groß. Cargomoleküle reichen von kleinen DNA-Moleküle, Enzyme, Antikörper und 5-10 nm Goldnanopartikel. Cargocan entweder einheitlich oder heterogen, so dass jedes Nanoroboters enthält ein Gemisch aus verschiedenen Molekülen. Sensor ist über zwei Doppelschräg Sperriegel Design entweder aptasensor 16,17 oder DNA-Strang-Verdrängungs-18-Technologien erreicht werden, um Proteine, Nukleinsäuren oder andere Chemikalien zu erfassen, beruht. Jüngste Entwicklungen in der Aptamer Selektionsprotokolle 19-21 ermöglichen die Gestaltung von Nanoroboter reagiertzu einer ständig wachsenden Palette von Molekülen und Zelltypen. Frühere Arbeiten zeigten eine Nanoroboter, der einen spezifischen Antikörper, der nach der Bindung an sein Antigen kann entweder eine hemmende oder ein produktiver Signal an der Innenseite von spezifischen Zelltypen in einer gemischten Zellpopulation 15 weiterzuleiten. Eine spannende Merkmal dieser Nanomaschinen ist ihre Fähigkeit, auch komplexere Aufgaben und Logic-Control mit der Einführung von verschiedenen Nanorobotik-Subtypen in einer einzigen Population durchzuführen. Kurzem zeigten wir bestimmte Subtypen von Nanoroboter Führen entweder positive oder negative Regulatoren, Steuern eines Effektorpopulation enthaltend einen aktiven Frachtmoleküls 22. Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Herstellung, Reinigung und Bildgebung eines Nanoroboter mit Aptamer-Sensor-Sequenzen, die selektiv an PDGF binden, um die Öffnung der Nanorobotik 15,22 erleichtern gated. Das beschriebene Herstellungsverfahren ist ähnlich dem nanorobot Herstellungsverfahren zunächst von Douglas et al. 15 mit Änderungen zur Verringerung der Gesamtprozessdauer ausgerichtet dargestellt, während die Erhöhung der Ausbeute und Reinigungsraten.

<table><tbody><tr><td>DNase/RNase free distilled water</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 ssDNA scaffold</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Gibco</td><td>15558-042</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO</td><td>Amicon</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>TBE buffer</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide 10&amp;nbsp;mg/ml solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA marker</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>Loading Dye</td><td>NEB</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>uranyl formate</td><td>polysciences</td><td>24762</td><td></td></tr><tr><td>carbon-coated TEM grids&amp;nbsp;</td><td>Science services</td><td>EFCF400-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler c1000 Touch</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow Discharge K100X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV table Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI-G12</td><td>Tecnai</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

Die DNA-Nanoroboter ist eine hohle hexagonale Nanometereinrichtung, entworfen, um als Reaktion auf bestimmte Reize und Gegenwart Fracht innerhalb abgesondert zu öffnen. Beide Reize und Ladung kann nach spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten werden. Hier beschreiben wir die DNA Nanoroboters Herstellungsprotokoll, wobei die Verwendung des DNA-Origamitechnik. Das Verfahren startet, indem man kurze einsträngige DNA von Klammern in einer Stammischung, der dann in Gegenwart eines Faltungspuffer zu einem langen, kreisförmigen, einsträngigen DNA-Gerüst aufgenommen. Ein Standard-Thermocycler so programmiert ist, allmählich gesenkt werden das Mischen der Reaktionstemperatur, um die Klammern zu Gerüstglühen, die die treibende Kraft hinter der Faltung des Nanoroboters ist erleichtern. Sobald die 60 h Faltungsreaktion vollständig ist, werden die überzähligen Klammern unter Verwendung einer Filterzentrifuge, gefolgt von Visualisierung über Agarose-Gelelektrophorese (AGE) verworfen. Schließlich wird erfolgreiche Herstellung des Nanoroboters durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) überprüft wird,mit der Verwendung von Uranyl-Formiat als negative Färbung.

Repräsentative Ergebnisse sind in 2A gezeigt. Alle Spuren enthalten 1 &amp; mgr; g Gesamt-DNA über Spektrophotometer (OD 260) gemessen. Im Vergleich mit dem kreisförmigen Einzelstrang-DNA-Gerüst (Spur 2), sind Nanoroboter im Gel aufgrund ihrer höheren Molekulargewicht behindert, ist das Ergebnis von Klammern Hybridisierung an das Gerüst DNA (Spur 3 roter Pfeil). Das Gewicht Band mit niedrigem Molekular in Spur 3 stellt überschüssige Heftklammern, die nicht auf das Schafott DNA (grüne...

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Faltung und Charakterisierung eines bioresponsiven Roboters aus DNA-Origami | Chemie | Video

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.6K Aufrufe.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

Serie: Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Inspired Selbstorganisation von Patterned und Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Forschung

Chemie

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Herstellung von Mica und Siliziumsubstraten für die DNA-Origami-Analyse und Experimentieren

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

Entwerfen einer Bio-responsive Robot von DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Biotechnik

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Biochemie

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Gentherapie inspiriert Polykation Beschichtung zum Schutz der DNA Origami Nanostrukturen

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic nanostructures. The high spatial precision of a DNA origami-templated assembly allows controlling the coupling between plasmonic resonances of individual particles and enables tailoring optical properties of the constructed nanostructures. Recently, chiral plasmonic systems attracted a lot of attention due to the strong correlation between the spatial configuration of plasmonic assemblies and their optical responses (e.g., circular dichroism [CD]). In this protocol, we describe the whole workflow for the generation of DNA origami-based chiral assemblies of gold nanorods (AuNRs). The protocol includes a detailed description of the design principles and experimental procedures for the fabrication of DNA origami templates, the synthesis of AuNRs, and the assembly of origami-AuNR structures. In addition, the characterization of structures using transmission electron microscopy (TEM) and CD spectroscopy is included. The described protocol is not limited to chiral configurations and can be adapted for the construction of various plasmonic architectures.

We describe the detailed protocol for the DNA origami-based assembly of gold nanorods into chiral plasmonic metamolecules with strong chiroptical responses. The protocol is not limited to chiral configurations and can be easily adapted for the fabrication of various plasmonic architectures.

Montage von Gold Laptops in chiralen plasmonische Metamolecules mit DNA Origami Vorlagen

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

DNA Origami-vermittelte Substrat Nanomusterung von anorganischen Strukturen für Sensoranwendungen

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Design und Synthese eines rekonfigurierbaren DNA-Akkordeon-Racks

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...