저자는 매우 가치있는 토론과 조언, 도움이 토론과 작업 바첼 레트 연구소의 모든 구성원에 대한 S. 더글러스을 감사드립니다. 이 작품은 바 - 일란 대학의 생명 과학 학부 및 나노 기술 및 신소재 연구소에서 보조금에 의해 지원됩니다.

스테이플 풀 혼합물 1. 준비 <ol><li> 표 1에 열거 된 96 웰 플레이트에 주문 동결 건조 된 DNA 나노 로봇 스테이플 (자료 참조) 10 nmol의 정상화. DNA의 나노 로봇의 설계 및 아키텍처에 대한 자세한 설명은 벤 Ishay 등. (14)와 더글라스 등의 알을 참조하십시오. 15). </li><li> 100 μM의 농도로 각 주식 잘와 DNase의 /의 RNase없는 초순수를 복원합니다. 스테이플 10 nmol의 정규화를 들어, 초순수 100 ㎕로 재구성한다. </li><li> 풀 멀티 채널 피펫과 멸균 55 ㎖의 솔루션 유역을 사용하여 각 단의 함께 20 μL. 참고 : 나노 로봇 모양, 스테이플 풀의 스테이플 각각의 농도 (코어, 가장자리, 핸들 및 가이드 서열 표 1 포함) 254 스테이플 가닥으로 구성되어 있기 때문에 394 ㎚이다. 스테이플 풀에서 스테이플을 제거, 또는 다른 권에 몇 가지를 추가을 메 상당히 수율을 감소 시키거나 그렇지 않으면 펼쳐진 집계 될 수 있습니다. </li></ol> 제조 된 반응 혼합물의 제조 (2) <ol><li> 표준 반응 혼합물은 (자료 참조, 100 nm의 원액) 발판 DNA의 4 pmol의에 해당하는 M13mp18 바이러스 게놈 원형의 단일 가닥 DNA의 40 μl를 사용합니다. 제조 혼합물에 비계의 최종 농도는 20 nM의 최종 볼륨 200 μl를합니다. <ol><li> 특정 요구에 따라, 골격 DNA의 양을 조절; 그러나, 20 nm에서 일정한 반응 혼합물에 DNA 골격의 최종 농도를 유지한다. </li></ol></li><li> 각각 1-10의 스테이플 비율 발판에 도달 스테이플을 추가합니다. 20 ㎚ 골격 DNA 농도를 들어, 스테이플 (254) &#39;의 최종 농도는 각각 200 ㎚이다. 200 μl의 최종 반응 볼륨에 대한 스테이플 풀 혼합물 (1.2 절)의 102 μl를 추가합니다. <ol><li> 토륨 별도로 특정 게이트 시퀀스를 추가이때 E 폴딩 반응 혼합물. 이러한 올리고 별도로 주문 및 HPLC 정제를 필요로한다. 20 나노 지지체의 농도에 대한 각 올리고의 즉, 200 nm의, 게이트 올리고는 1:10 발판 게이트에 시퀀스 비율에 있는지 확인합니다. 200 μL 접는 반응 부피를 들어, 100 μm의 재고 농도에있는 4 개의 게이트 올리고 각 0.4 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 1X TAE (40 mM 트리스 - 아세테이트, 1mM의 EDTA)의 최종 농도에 도달하는 10 배 스톡 TAE 버퍼를 추가한다. 200 μL 접는 반응 볼륨의 경우, 10 배 TAE의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 10 mM의 최종 농도는 1 M의 MgCl 2를 추가한다. 200 μL 접는 반응 볼륨의 경우, 1 M의 MgCl 2의 2 μl를 추가합니다. </li><li> 200 μL의 최종 볼륨에 도달에 DNase의 /의 RNase 무료 초순수의 36 μl를 추가합니다. </li><li> PCR 튜브에 소용돌이와 나누어지는 100 μL 샘플. 참고 : 사용할 수있는 최대 반응 볼륨에 대한 열 자전거 타는 사람 사양을 참조하십시오.이러한 제한 사항을 충족하기 위해 볼륨을 줄이면 얻어진 수율을 감소하지 않습니다. 수율을 위태롭게 지정된 최대 상기 반응 볼륨. </li></ol> 제조 반응의 3 어닐링 온도 경사로 <ol><li> 프로그램 열 자전거 타는 사람은 다음과 같습니다 : <ol><li> 5 분 / ° C의 속도로 60 ° C에 85 ° C를 램프. </li><li> 램프 60 ℃ 75 분 / ° C의 속도로 4 ° C까지. </li><li> 무기한 4 ° C에서 잡으십시오. </li></ol></li><li> 후 제조는 -20 ° C에서 저장 샘플을 종료되었습니다. </li></ol> 초과 스테이플 4. 제거 <ol><li> 100 kDa의의 MWCO와 0.5 ml의 원심 필터에 접는 반응 혼합물을 100 μl를 추가합니다. 나중에 분석을위한 나노 로봇 사전 정화의 10 μL 샘플을 저장합니다. </li><li> 9,600 X g에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 접는 버퍼 400 μL (1X TAE, 10 밀리미터의 MgCl 2)를 추가합니다. </li><li> 반복 두 번 더 4.2 및 4.3 단계를 반복합니다. </li><li>9,600 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 9,600 × g으로 1 분간 클린 microcentrifuge 관과 스핀 거꾸로 필터를 배치하여 농축 물을 회수. 최종 부피는 필터에 넣고 제조 반응 혼합물의 초기 양에 따라 변할 수있다. 전형적으로 농축 된 나노 로봇 샘플 25-60 ㎕의 최종 부피를 얻을 수있다. </li><li> 260 nm에서 분광 광도계를 통해 시료에서 DNA의 농도를 측정한다. 나노 로봇 샘플의 몰 농도를 계산할 때 5.3 μg의 / pmol의 분자량을 사용합니다. 참고 : dsDNA의 몰 흡광 계수, 50 μg의 / OD (260)는, 대부분의 응용 프로그램에 충분합니다. 48 μg의 / OD (260)는 가장자리 스테이플에서 계정에 ssDNA를 뻗어 폴리 티민 걸립니다. </li></ol> 접이식 나노 로봇 5. 아가로 오스 젤 전기 영동 분석 <ol><li> 0.5X TBE에 (45 mM 트리스 - 보레이트, 1 mM의 EDTA), 2 % 아가 로즈 겔의 제조 된 10 mM의 MgCl 2 보충 </suB&gt; (에르네스토 카스트로 등의 알에서 적응 21.) : <ol><li> DDH 2 O의 118.75 ml의 10 배 TBE 스톡 버퍼의 6.25 mL로 희석하여 0.5 배의 TBE 버퍼를 준비 </li><li> 0.5 배의 TBE 버퍼의 125 ㎖에 아가로 오스의 2.5 g을 녹인다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 녹을 때까지 마이크로파에 끓인다. </li><li> 10 mm의 최종 농도 1 M의 MgCl 2의 1.25 ML을 추가합니다. </li><li> 10 mg을 7 μl를 추가 / ㎖ 에티 디움 브로마이드. </li><li> 약간 냉각 솔루션을 기다린 아가 로스 젤 응고 전에 젤 트레이를 입력합니다. 즉시 원하는 빗를 설치합니다. </li><li> DDH 2 O의 940 ml의 0.5 배의 TBE의 MgCl 2 배 TBE 스톡 버퍼 50 ㎖와 1 M 10 ㎖를 추가하여 버퍼를 실행 한 L 준비 </li><li> 겔을 빙욕에서 전기 영동 장치에 넣어 버퍼 장치를 실행 고체가 추가되면. </li></ol></li><li> 비계와 함께 나노 로봇 사전 정화의 부하 1 μg의 전체 DNA (3.2 단계), 사후 정화 (단계 4.7),DNA 샘플 겔 상 1킬로바이트의 DNA 마커. 예를 그림 2에 제시되어있다. 샘플의 실제 볼륨은 정제 후의 농도에 따라 달라집니다. (6) 최종 부피 비율 : 각각의 샘플은 1에서 로딩 완충액으로 로딩된다. </li><li> 80 V에 전원을 설정하고 3 시간 동안 젤을 실행합니다. 얼음과 물이 가득 욕조에 젤을 실행합니다. 나노 로봇이 전개와 아가로 오스 겔 전기 영동 동안 가열하면 얼룩으로 표시됩니다. 전기 영동 동안 가열에서 장치를 유지하기 위해 추가로 얼음을 추가합니다. </li><li> 자외선 테이블에보기 젤 (그림 2). </li></ol> 우라 닐 - 메이트와 나노 로봇의 6 부정적 얼룩 <ol><li> 2 % 우라 닐 - 메이트 원액의 제조 (카스트로 등의 알에서 적응 23.) : <ol><li> 15 ML 튜브에 우라 닐 - 메이트 분말 100 mg의 무게. </li><li> 3 분 동안 삶아의 DNase /의 RNase 무료 초순수는 탈 산소 물을 수 있습니다. </li><li> 환원 된 뜨거운 물 5 mL를 추가 (~ 60 ° C)(이전 단계) 우라 닐 포르 메이트를 함유하는 분말을 15 ㎖의 튜브에. 단단히 가까운 뚜껑, (소용돌이에 고정시킵니다 튜브) 엄격하게 10 분 동안 알루미늄 호일과 소용돌이에서 랩. 솔루션 노란색 컬러와 함께 혼탁 나타납니다. </li><li> 0.2 μm의 주사기 여과한다을 통해 필터 솔루션입니다. 해결 방법은 명확하게해야한다. </li><li> 분취 액을 마이크로 원심 튜브에 용액 200 μL. </li><li> 튜브의 하단에 풀 샘플 테이블 탑 원심 분리기에서 5 분 동안 최대 속도로 원심 분리기. </li></ol></li><li> 그리드 및 음의 염색에 샘플의로드 : <ol><li> 2 % 우라 닐 - 메이트 용액 (6.1 절에서 제조)의 200 μL 나누어지는 해동. 3 분 동안 엄격 0.5 M NaOH 용액과 소용돌이의 10 μl를 추가합니다. 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 5 분 동안 최대 속도로 원심 분리기. </li><li> 한편, 글로우 방전 그리드는 0.2 mbar에서 실내 공기를 사용하여 25mA 30 초. </li><li> 정화 후 2 나노 미터 나노 로봇 샘플의 15 μl를 추가합니다 (섹션에 ì그리드의 위쪽 상 4.7)에 (집게 개최) 1 분 동안 흡수 할 수 있습니다. 여과지 위에 그리드를 배치하여 여분의 액체를 배출 여과지를 사용합니다. 그리드 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 그리드의 위쪽에 (단계 6.2.1에서) 2 % 우라 닐 - 메이트의 10 μl를 추가 (집게 개최). </li><li> 신속 여과지 위에 그리드를 배치하여 여분의 액체를 배출 여과지를 사용합니다. 그리드 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 반복 6.2.4와 6.2.5 단계를 반복합니다. </li><li> 그리드의 위쪽에 (단계 6.2.1에서) 2 % 우라 닐 - 메이트의 10 μl를 추가 (집게 개최). 염색 용액을 30 초 동안 흡수 보자. </li><li> 여과지 위에 그리드를 배치하여 여분의 액체를 배출 여과지를 사용합니다. 그리드 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 그리드, 적어도 30 분 동안 완전히 건조 TEM에 주입하기 전에, 필터 종이에까지 직면하자. </li></ol></li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

우리는 DNA의 나노 로봇의 제조, 정제 및 시각화를 설명했다. 장치의 육방 섀시의 제작 후, 나노 로봇의 기능을 용이하게 때문에 가능한 단일 가닥 도킹 위치 (14)와 수소 결합 상보성에 그 지정 위치를 찾을 로봇 특정화물의 간단한 소개와 감지 가닥 프로그래밍 , 15, 22. 기재된 제조 프로토콜은 일반적으로 접기 광범위한 형상 폴드 연구실에서 사용되는 느린 ?...

핵산 나노 기술의 사용은 놀라운 있습니다. 왓슨 - 크릭 염기 쌍의 취급 용이성뿐만 아니라 주문품 올리고 2의 대규모 합성의 용이성 및 상대적 저비용 DNA 나노 기술의 분야에서 응용 프로그램 (3)의 폭발 및 연구를 생성했다. 기본적인 빌딩 블록으로 움직이지 시먼 접합 4,5에 기반 구조의 DNA 나노 기술은 임의의 모양 6-8의 건설을위한 자기 조립 초 단위로 DNA를 사용합니다. 스캐 폴딩 DNA 종이 접기 (9) 기술의 최근 개발은 나노 미터 이하의 정밀도와 복잡한 2D / 3D 나노 구조 10-12의 건설을 허용하고 증가하는 복잡성과 놀라운 다양성과 새로운 기능 객체를 구축하기위한 효율적인 경로입니다. 건조 공정이 긴 골격 단일 가닥 DNA에 기초하고, 일반적으로 바이러스로부터 유래 genom짧은 단일 가닥 DNA를 올리고 수백의 교잡을 통해 접을 수있는 전자는 스테이플 불린다. 제조의 재현성을 달성 할 수있는 최대의 수소 결합 상보성을 용이하게하기 위해 짧은 단일 가닥 스테이플 서열 원단의 결과 동안이 기술에 의해 얻어진 높은 구조적 해상도, DNA 이중 나선의 천연 치수의 직접적인 결과이다. 느린 어닐링 온도를 사용하여 열역학적으로 바람직한 나노 구조물을 고 수율 및 정확도에 도달 할 때 설계는 낮은 에너지를, 램프. 컴퓨터 코드의 접합부 설계 규칙의 구현은 매우 쉽게 연결 접합부 수백 함유 크고 복잡한 구조물을 설계하는 등의 작업을 단순화 caDNAno 13 CAD 도구의 개발을 활성화. 우리는 이전에 caDNAno 공구 14,15의 도움으로 DNA의 나노 로봇의 디자인을 설명했다. 여기에 우리가 제작을 묘사하고투과 전자 현미경 (TEM)을 통해 시각화의 차원 나노 로봇, 3 차원 중공 육방 나노 소자의 소정의 자극과 본 구체적인화물에 응답 주요 형태 변화를 겪게하도록 설계된 35 X 35 X 50 내지 3, 이러한 단백질 또는 핵산으로 올리고, 안쪽 압수. 로딩 스테이션 (12)은 중공 내부 섀시 사용할 수 있지만, 바인딩화물의 실제 수는화물의 크기와 다르다. 화물 분자는 작은 DNA 분자에서 효소, 항체 및 5 ~ 10 nm의 금 나노 입자에 이르기까지 다양합니다. 각각의 나노 로봇은 다른 분자의 혼합물을 함유하도록, 균일 또는 불균일 될 Cargocan 하나. 감지는 aptasensor 16, 17 또는 DNA 가닥 변위 (18) 기술 중 하나, 단백질, 핵산 또는 다른 화학 물질을 감지하는 두 개의 더블 헬리컬 잠금 게이트 디자인을 통해 달성을 기반으로합니다. 앱 타머 선택 프로토콜 19-21에서 최근의 발전 응답 나노 로봇의 디자인을 사용분자 및 세포 유형의 범위도 증가한다. 초기 연구는 항원에 결합하는 억제 성 또는 혼합 된 세포 집단 (15)의 특정 세포 유형의 내부에 다작 신호를 릴레이 할 때 특이 적 항체를 운반 나노 로봇을 보였다. 이러한 나노의 흥미로운 기능은 하나의 집단에서 서로 다른 나노 로봇 하위 유형의 도입으로 더욱 복잡한 작업 및 로직 제어를 수행 할 수있는 능력이다. 최근에 우리는 활성화물 분자 (22)를 포함하는 이펙터 인구를 제어, 양 또는 음의 규제 중 하나로 수행하는 나노 로봇의 특정 아형을 보여 주었다. 여기에 제시된 프로토콜은 나노 로봇 15, 22의 개방을 용이하게하기 위해 선택적으로 결합 PDGF 앱 타머 센서 서열 게이팅 나노 로봇의 제조, 정제 및 이미지를 설명한다. 설명 된 제조 공정과 유사한 N정제 수율 및 속도를 증가시키면서 anorobot 제작 공정은 먼저, 더글라스 외. 전체 공정 시간을 줄이기위한 변화 (15)에 의해 도시.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNase/RNase free distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 ssDNA scaffold</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15558-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC510024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide 10mg/ml solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA marker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7021S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl formate</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24762</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon-coated TEM grids&#160;</td>
			<td>Science services</td>
			<td>EFCF400-Cu-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler c1000 Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge K100X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV table Gel Doc EZ Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI-G12</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

DNA의 나노 로봇은 내부 압수 특정 자극과 현재화물에 대한 응답으로 열 수 있도록 설계 중공 육각형 나노 장치이다. 모두 자극 및화물 특정 필요에 따라 맞출 수 있습니다. 여기에서 우리는 DNA 종이 접기 기술을 이용하여, DNA의 나노 로봇 제조 프로토콜을 설명합니다. 절차는 폴딩 완충액의 존재하에 긴 원형의 단일 가닥 DNA 골격에 첨가 스톡 혼합물에 짧은 단일 가닥 DNA 스테이플을 혼합함으로써 개시한다. 표준 열 사이 클러 서서히 나노 로봇의 폴딩 뒤에 안내 힘 스테이플 간 지지체 소둔을 용이하게하기 위해 혼합 반응 온도를 낮추기 위해 프로그래밍된다. 60 시간 폴딩 반응이 완료되면, 과량의 스테이플은 아가 로스 겔 전기 영동 (AGE)을 통해 가시화 하였다 원심 필터를 이용하여 폐기된다. 마지막으로, 나노 로봇의 성공적인 제조는 (TEM) 투과 전자 현미경에 의해 확인되고,부정적인 얼룩 등의 우라 닐 - 메이트의 사용과.

대표적인 결과는도 2a에 도시된다. 모든 차선은 분광 광도계 (OD 260)를 통해 측정 된 총 DNA의 1 μg의가 포함되어 있습니다. 원형의 단일 가닥 DNA의 골격 (레인 2)과 비교하여, 나노 로봇이 그들의 높은 분자량 겔에 방해된다, 발판의 DNA에 스테이플 하이브리드의 결과 (레인 3 빨간색 화살표). 레인 3의 저 분자량 밴드는 발판의 DNA (녹색 화살표)에 결합하지 않은 초과 스테이플을 나...

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Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA 접기에서 바이오 응답 로봇의 폴딩 및 특성화

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.4K 조회수.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

종이 접기 고취 패턴 및 재구성 입자의 자기 조립

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

연구

화학

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

기능화의 합성 및 특성 금속 - 유기 프레임 워크

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

산화 DNA 바이오 마커의 HPLC 측​​정, -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2&#39;- 데 옥시 구아노 신, 배양 세포와 동물 조직

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

DNA 종이 접기 분석 및 실험에 대한 운모와 실리콘 기판의 제조

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar concentration forming hydrophobic cores surrounded by hydrophilic shells in aqueous environments. The core of these micelles can be utilized to load hydrophobic, poorly water soluble drugs like docetaxel (DTX) and everolimus (EVR). Systematic characterization of the micelle structure and drug loading capabilities are important before in vitro and in vivo studies can be conducted. The goal of the protocol described herein is to provide the necessary characterization steps to achieve standardized micellar products. DTX and EVR have intrinsic solubilities of 1.9 and 9.6 &#181;g/ml respectively Preparation of these micelles can be achieved through solvent casting which increases the aqueous solubility of DTX and EVR to 1.86 and 1.85 mg/ml, respectively. Drug stability in micelles evaluated at room temperature over 48 hr indicates that 97% or more of the drugs are retained in solution. Micelle size was assessed using dynamic light scattering and indicated that the size of these micelles was below 50 nm and depended on the molecular weight of the polymer. Drug release from the micelles was assessed using dialysis under sink conditions at pH 7.4 at 37 oC over 48 hr. Curve fitting results indicate that drug release is driven by a first order process indicating that it is diffusion driven.

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

준비 및 개인의 특성과 다중 약물은 물리적으로 고분자 미셀을 포획로드

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA Aptamer 선택, 특성, 및 전기 화학 Aptasensor 응용 프로그램

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...