Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant l’installation de voies métaboliques dans les cellules leucémiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer le métabolisme des cellules leucémiques primaires en temps réel dans les cellules vivantes. Commencez par diluer un échantillon de moelle osseuse obtenu auprès d’un patient atteint de leucémie dans PBS à un rapport un à un.
Soigneusement, superposer six millilitres de l’échantillon dilué de moelle osseuse sur six millilitres de milieu de gradient de densité fraîchement préparé dans un tube conique de 15 millilitres et séparer les cellules par centrifugation de gradient de densité. Utilisez un tuyau Pasteur pour transférer soigneusement la couche d’interface des cellules mononucléaires à un nouveau tube conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de PBS pour un lavage centrifugation. Ensuite, resuspendez la pastille cellulaire mononucléaire en deux millilitres de PBS stérile pour le comptage.
Diluer les cellules à trois fois 10 à la concentration de sept cellules par millilitre. Et ajouter un millilitre de cellules à chacun des deux flacons T75 contenant 20 millilitres de milieu RPMI pour une incubation de 16 à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de CO2. Pendant ce temps, pour préparer les plaques pour l’analyse du flux extracellulaire, ajouter 12,5 microlitres de solution adhésive cellulaire dans chaque puits de deux, huit plaques d’analyseur de flux bien extracellulaire.
Après 20 minutes, aspirer l’adhésif cellulaire et laver chaque puits deux fois avec 200 microlitres d’eau stérile par lavage. Après le deuxième lavage, laisser les assiettes dans le capot jusqu’à ce que les puits soient secs. Et placez la cartouche du capteur à l’envers sur le banc du laboratoire.
Séparez la plaque d’utilité et la cartouche de capteur de l’analyseur de flux. Et remplissez chaque puits de la plaque d’utilité avec 200 microlitres de calibrant et chaque fossé autour de l’extérieur des puits avec 400 microlitres de calibrant. Retournez la cartouche de capteur à la plaque d’utilité qui contient maintenant le calibreur et placez l’assemblage de la cartouche dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius sans CO2 pendant la nuit.
Ensuite, allumez l’analyseur de flux extracellulaire et laissez-le chaud à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez les cellules du flacon à des tubes coniques de 50 millilitres pour centrifugation. Et resuspendez les granulés en un millilitre du milieu expérimental approprié pour le comptage.
Resuspendez les cellules à quatre fois 10 aux six cellules dans 400 microlitres de concentration moyenne expérimentale. Et ajouter 50 microlitres de cellules dans les puits B à G de la plaque d’analyseur de flux. Et 180 microlitres du milieu expérimental dans les puits A et H comme puits de contrôle de fond.
Après centrifugation lentement et soigneusement ajouter 130 microlitres du milieu expérimental aux puits B par G.Et confirmer visuellement l’adhérence stable des cellules au fond de chaque puits sous le microscope. Retournez ensuite la plaque d’analyse de flux à l’incubateur humidifié de 37 degrés Celsius sans CO2 pendant 30 minutes. 20 minutes avant la fin de l’incubation, charger les composés dans les ports d’injection appropriés de la cartouche selon le protocole expérimental tel qu’indiqué dans le tableau.
Configurez ensuite le programme d’analyse de flux extracellulaire approprié. Démarrez le programme et remplacez la plaque calibrée par la plaque d’analyse lorsqu’elle est poussée. Dans un test de stress de glycolyse, seul le milieu basal est utilisé de sorte que les cellules sont privées de nutriments.
Le premier paramètre obtenu est l’acidification basale qui devrait refléter la quantité de glucose stockée dans les cellules. Après la première injection, le taux d’acidification extracellulaire est augmenté à mesure que les cellules utilisent le glucose et peuvent fermenter le glucose pour lactate. L’oligomycine A dans la deuxième injection inhibe la synthase ATP et dirige ainsi les cellules à produire de l’ATP principalement par une glycolyse causant une élévation supplémentaire du taux d’acidification extracellulaire.
Alors que l’injection de 2-Deoxy-D-glucose inhibe complètement la glycolyse et le taux d’acidification extracellulaire diminue. Dans le test de stress mito cellulaire, un milieu complété par la glutamine et le glucose est utilisé afin que les cellules ne soient pas privées de tous les nutriments. Le paramètre de respiration basale reflète leur état métabolique basal.
Après la première injection avec l’oligomycine A, les cellules inhibent la respiration mitochondrique et passent à la glycolyse qui est représentée comme une diminution du taux de consommation d’oxygène. Les deuxième et troisième injections de FCCP cependant, découpler la production d’ATP de la respiration de sorte que les cellules consomment maintenant de l’oxygène à un rythme maximal. Et le taux de consommation d’oxygène atteint sa valeur la plus élevée.
La dernière injection du mélange de rotenone et d’antimycine A inhibe complètement la respiration mitochondriale, réduisant le taux de consommation d’oxygène à presque zéro. Tout en essayant cette procédure, il est important d’évaluer le pourcentage de explosions dans l’échantillon pour s’assurer que les paramètres métaboliques des leukemiablasts ne sont mesurés. Lors de la mise en œuvre de cette méthode, une optimisation minutieuse doit être appliquée aux conditions de culture et à la normalisation des données.
