Nous remercions Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) pour d&#39;abord nous enseigner la technique HGD et le Dr Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) pour son orientation permanente dans divers aspects de la technologie. Ce travail a été financé par Hunter College, CUNY fonds de démarrage et d&#39;attribution NSF pain IOS-1249166. Nous remercions la subvention d&#39;appui NYULMC histopathologie base NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 pour l&#39;histologie sur des foies de souris.

Toutes les expériences décrites ici ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de Hunter College, City University de New York. Une. Préparation d&#39;ADN plasmidique sans endotoxine <ol><li> Choisir une colonie unique de bactéries contenant le gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;expression de mammifère à partir d&#39;une plaque sélective fraîchement striée. </li><li> Suivez les recommandations contenues dans le manuel d&#39;un kit de purification de plasmide disponible dans le commerce sans endotoxine des bactéries croissance et la récolte. </li><li> Purifier le plasmide ADN libre à l&#39;endotoxine à partir de cellules bactériennes en suivant le protocole du kit de purification de plasmide exempt d&#39;endotoxine disponibles dans le commerce. </li><li> Utilisez les articles en plastique sans endotoxine et manipuler l&#39;ADN avec soin pour s&#39;assurer que l&#39;endotoxine n&#39;est pas réintroduite dans l&#39;échantillon d&#39;ADN après l&#39;étape d&#39;élimination. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ADN plasmidique exempt d&#39;endotoxine par la détermination de son absorbance à 260 nm en utilisant un micro volume spectrophotomètre UV telle que décrite ci-dessous ou à une norme, spectrophotomètre base cuvette. <ol><li> Nettoyer les surfaces optiques inférieures et supérieures du système de retenue d&#39;échantillon du spectrophotomètre micro comme suit. 1 ul d&#39;eau désionisée propre sur le système optique inférieur. Fermez le bras de levier et appuyez dessus à quelques reprises pour baigner le système optique supérieure, alors levier d&#39;ouverture et essuyer avec un tissu. </li><li> Ouvrez le logiciel de micro spectrophotomètre et sélectionner le module d&#39;acides nucléiques. </li><li> Placez 1 pi d&#39;eau déminéralisée propre sur le système optique inférieur, le bras de levier et sélectionnez &quot;initialiser&quot; à partir du logiciel de programme. Une fois l&#39;initialisation surfaces complètes, propres à la fois optiques avec un tissu .. </li><li> Effectuer mesure à blanc en chargeant 1 pl de tampon TE exempt d&#39;endotoxine (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) et en sélectionnant &quot;vide&quot; à partir du logiciel de programme. Une fois la mesure vide est fait, nettoyer les surfaces optiques à la fois avec untissu. </li><li> Effectuer une mesure de l&#39;échantillon en chargeant 1 ul de l&#39;échantillon et en sélectionnant l&#39;ADN exempt d&#39;endotoxine &quot;mesure&quot; à partir du logiciel de programme. On enregistre la concentration de l&#39;ADN. Évaluer la pureté de l&#39;ADN par l&#39;enregistrement du rapport d&#39;absorbance 260/280 nm qui apparaît sur l&#39;écran. Etant donné que l&#39;utilisation d&#39;ADN pur (260/280 du rapport de 1,8) pour le MH est hautement souhaitable, éviter d&#39;utiliser un échantillon d&#39;ADN avec un rapport de 260/280 en dessous de 1,7. Une fois la mesure terminée, nettoyer les deux surfaces optiques avec un tissu. </li></ol></li></ol> 2. Pesée de souris <ol><li> Mark souris dans un approprié de manière à la souche. Remarque: le marquage de la queue n&#39;est pas recommandé pour cette procédure. <ol><li> Espèces de souris Marquer ayant fourrure blanche (par exemple Swiss Webster) sur le dos avec un marqueur noir. Réappliquer marques au fil du temps si nécessaire. </li><li> Espèces Mark souris qui ont une fourrure noire (par exemple C57BL / 6) à l&#39;oreille poinçonnage plusieurs jours à l&#39;avance. </li></ol></li><li> Peser souris individually en les plaçant dans un plateau de pesée des animaux ou seau doucement placé sur une balance de laboratoire numérique. Noter le poids de chaque souris utilisée dans l&#39;expérience, le jour de l&#39;expérience. </li></ol> 3. Préparation des seringues <ol><li> Préparation du mélange d&#39;injection <ol><li> Calcul de la quantité d&#39;ADN nécessaire en supposant 5-50 ug d&#39;ADN plasmidique exempt d&#39;endotoxine pour l&#39;injection de chaque souris. <ol><li> Déterminer la quantité optimale d&#39;ADN de plasmide expérimentalement. </li><li> Lors de la détermination de la quantité d&#39;ADN nécessaire, assumer injection d&#39;une souris supplémentaire par groupe, comme le chargement correct des seringues, il faudra un certain mélange d&#39;injection supplémentaire. Pour aider les calculs, prenons l&#39;exemple suivant: injecter 4 souris expérimentales et 4 contrôle, chaque 25 g pesage, avec 50 ug d&#39;ADN plasmidique par la souris. Pour déterminer la quantité d&#39;ADN nécessaire dans ce cas, calculer avec 5 souris par groupe: 5 x 50 pg = 250 pg d&#39;ADN nécessaires pour chaque groupe. </li></ol></li><li> Déterminer la quantité de solution saline (chlorure de sodium à 0,9%) nécessaire en supposant 10% de poids de corps pour l&#39;injection de chaque souris. <ol><li> Selon l&#39;exemple ci-dessus, chaque injection de 25 g de souris avec 50 ug d&#39;ADN plasmidique dans 2,5 ml de solution saline (2,5 g de liquide). </li><li> Pour déterminer la quantité de solution saline nécessaire pour tout un groupe de souris, supposons injection d&#39;une souris supplémentaire par groupe pour permettre le chargement correct des seringues. Compte tenu de l&#39;expérience donnée, calculer la quantité de solution saline nécessaire pour 5 souris dans chaque groupe: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml de solution saline pour chaque groupe (ou 25 ml au total). Remarque: si des souris d&#39;un même groupe ne sont pas le même poids (différence de plus de 10% du poids corporel), à préparer l&#39;injection se mélange séparément. </li></ol></li><li> Utiliser, une solution saline stérile sans conservateur et sans endotoxine qui a été approuvé pour l&#39;usage humain, en 10 ml, des flacons à usage multiple. </li><li> En utilisant une aiguille de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm) fixé à un embout de type luer-lock d&#39;une seringue de 20 ml,retirer le liquide à partir de flacons de sérum physiologique et de vider la seringue dans un tube conique de 50 ml. Pour aider pipetage précise de solution saline au cours de la préparation des mélanges d&#39;injection ADN-solution saline, une solution saline recueillir plus que nécessaire pour l&#39;injection de toutes les souris dans l&#39;expérience. Pour l&#39;expérience ci-dessus, retirer saline de 3, flacons de 10 ml (soit un total d&#39;environ 30 ml), même si le montant calculé de solution saline nécessaire pour l&#39;expérience est à seulement 25 ml. </li><li> Introduire à la pipette la quantité calculée d&#39;ADN dans un tube conique de 50 ml différente. Prenez soin de ne pas toucher le côté du tube avec le corps de la pipette pour éviter l&#39;introduction de l&#39;endotoxine. Selon l&#39;exemple, pipeter 250 ug de contrôle et 250 pg d&#39;ADN de plasmide expérimentale dans des tubes coniques distinctes. </li><li> Ajouter la quantité nécessaire de solution saline à l&#39;ADN en utilisant une pipette sérologique. Compte tenu de l&#39;expérience de l&#39;échantillon, la pipette 12,5 ml de sérum physiologique à chacun des mélanges maîtres (expérimental et de contrôle). </li><li> Autoriser toutes les solutions pour atteindrela température ambiante avant l&#39;injection. </li></ol></li><li> Préparation des seringues <ol><li> Pour chaque souris, remplir un, 3 ml, de Luer-Lok seringue stérile avec la composition de l&#39;ADN en utilisant une solution saline, une aiguille stérile de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm). Prenez soin d&#39;éviter les bulles d&#39;air. Évitez d&#39;utiliser des seringues de volume plus élevé que le taux d&#39;injection de flux ne peut pas être contrôlée très bien, et il est difficile de manipuler les grandes seringues dans une main. Éjecter tout ADN-saline mélange en excès dans le tube conique, comme cela peut être réutilisé. </li><li> Mettez l&#39;aiguille, une aiguille stérile de calibre 27. Remplissez l&#39;aiguille avec le liquide complètement sans introduire de bulles d&#39;air. Ajuster le volume du mélange d&#39;ADN-une solution saline telle que calculée sur la base du poids de la souris. </li><li> Ne pas laisser l&#39;aiguille non plafonné de toucher n&#39;importe quelle surface non stérile. Si nécessaire, les aiguilles peuvent être re-plafonnés en utilisant la technique d&#39;une seule main: placer le bouchon sur une surface plane, insérer l&#39;aiguille sans avoir à tenir le cap avec l&#39;autre main et appuyez sur l&#39;aiguille plafonnéecontre un objet dur pour fixer le capuchon sur l&#39;aiguille. Les seringues sont maintenant prêts pour les injections de queue veineuse. </li></ol></li></ol> 4. Livraison d&#39;ADN hydrodynamique <ol><li> A noter que les souris anesthésiants peuvent réduire la viabilité. Évitez d&#39;effectuer des DHG dans une salle qui est trop froid, car cela permettra également de réduire la viabilité. Si la pièce a une température ambiante de 20 ° C ou si vous utilisez l&#39;anesthésie, placez la souris sur un coussin chauffant à 37 ° C procédure de poste pour éviter la perte de tous les animaux. Si vous utilisez l&#39;anesthésie, veiller à ce que la bouche et le nez de la souris sont alors dégagée sur la garniture de la chaleur et d&#39;observer la souris jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère entièrement. Ne pas retenir la nourriture ou de l&#39;eau de la souris avant HGD. </li><li> Réchauffer les souris à dilater les vaisseaux sanguins. <ol><li> Placer la cage de la souris (avec literie incluse) sur un tapis de chaleur pendant 5 minutes pour que la température de la litière est d&#39;environ 38 à 39 ° C. La température doit être suffisamment bas pour maintenir les souris sur le tapis de la chaleur pour unpériode prolongée. </li><li> Sinon, placez la souris dans un dispositif de retenue d&#39;accès dorsal avec retenue minimale. Réchauffez la queue de la souris pendant 1 min en maintenant doucement avec un morceau de gaze humidifiée à l&#39;eau tiède. Laisser la souris pour repositionner, si nécessaire. Essuyez la queue avec un mouchoir pour sécher. </li><li> En variante, souris chaude en plaçant la cage sous une lampe chauffante pendant pas plus de 2 min. Si vous utilisez une lampe de chaleur, faire preuve de prudence pour éviter la surchauffe de la souris. </li></ol></li><li> Injection veine de la queue de grand volume <ol><li> Immobiliser un accès de contention dorsale sur une surface plane par un ruban de laboratoire. </li><li> Tenant par la queue, placez la souris doucement dans le dispositif de retenue et insérer la fiche. Utilisez le moins de retenue que nécessaire pour que la queue immobilisée. Assurez-vous que la souris respire librement. </li><li> Si la souris est en détresse à tout moment de la procédure, retirez la souris du dispositif de retenue immédiatement et laisser reposer. </li><li> Placez la souris pourl&#39;une des veines caudales latérale est visible. Repérez les veines caudales latérales par la recherche vers le bas à l&#39;arrière de la souris: la ligne rouge qui dans le milieu de la queue est une artère, tandis que les lignes bleues de chaque côté de la queue sont les veines caudales latérales. </li><li> Essuyez la queue de la souris à fond avec un tampon imbibé d&#39;alcool. </li><li> Avec la main non injectables, tenir la queue bien entre l&#39;index et le majeur ainsi que la queue passe sous l&#39;index, sur le milieu et troisième doigts et sous le petit doigt. Laisser le pouce reste libre de se déplacer. (Figure 1A) </li><li> De l&#39;autre main, essuyer la zone à injecter à nouveau avec un tampon imbibé d&#39;alcool. Laisser la surface de sécher. </li><li> Prenez la seringue chargé de l&#39;injection à la main et en le tenant par le canon entre le pouce et les quatre autres chiffres. Ne tenez pas sur le piston. </li><li> Placer la seringue parallèlement à la queue avec le pointage de l&#39;aiguille en direction du corps de la souris etle biseau (arête oblique) de l&#39;aiguille vers le haut. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans la veine de la queue. Procéder à l&#39;injection que si la veine est correctement placé, ce qui est évident à partir de l&#39;aiguille coulissant dans aucune résistance. Notez que la profondeur d&#39;insertion de l&#39;aiguille est une question de préférence personnelle cependant, l&#39;insertion complète n&#39;est pas recommandée en raison du risque accru de cisaillement de la veine. Évitez de déplacer l&#39;aiguille. </li><li> Avec le pouce de la main de la queue-tenant, fermer sur le moyeu de l&#39;aiguille et appuyez sur moyeu contre la queue pour maintenir l&#39;aiguille en position. Ne pas appliquer de pression extrême et ne tient pas sur l&#39;arbre de l&#39;aiguille, car ceux-ci entraver l&#39;écoulement du liquide dans la veine. Tenez la queue avec l&#39;index de façon lâche à ce point afin de ne pas entraver l&#39;injection (figure 1A). </li><li> Re-positionner la main une seringue de telle façon que l&#39;index et le majeur tiennent sur ​​la bride et le pouce est à l&#39;extrémité du piston (Figure 1A). </li><li> Appuyez sur le piston en un, un mouvement continu et injecter la totalité du volume de liquide dans 6-8 sec. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la veine et arrêter le saignement en appliquant une légère pression sur la queue avec un mouchoir. </li><li> Retirez la souris de la contention et le lieu souris dans une cage de récupération placé sur le dessus d&#39;un coussin chauffant (literie devrait être 37-38 ° C). Si la chambre d&#39;injection est froid, cette étape est essentielle pour la survie de la souris. Tenez la queue de la souris jusqu&#39;à ce que le saignement s&#39;arrête complètement. </li><li> Observez la souris pendant 1 heure après la livraison de l&#39;ADN hydrodynamique. Une période initiale de halètement et l&#39;immobilité est normal en raison de l&#39;arythmie temporaire causée par HGD mais assurez-vous que la souris montre des signes de reprise dans environ 5 min. Si la respiration de la souris devient extrêmement faible, masser doucement l&#39;abdomen de la souris pour faciliter la respiration. A noter que le taux de recouvrement peut être légèrement influencée par la souche de souris utilisée. </li><li> la souris de retourau logement cage et veiller à ce que la souris a une offre abondante de nourriture et d&#39;eau. </li></ol></li><li> Injection veine de la queue de grand volume en utilisant une position de la main de remplacement <ol><li> Placer la souris dans le dispositif de retenue et se préparer pour injection en suivant les étapes 4.3.1 4.3.5 à travers, comme décrit précédemment. </li><li> Reste la main non-injection sur une surface plane avec quatre doigts pliés à un angle de quatre-vingt-degré. Les doigts (tous sauf le pouce) devraient reposer sur le dessus de l&#39;autre, la création d&#39;une plate-forme. Tenez la queue de la souris entre le pouce et le doigt de pointage (figure 1B). </li><li> De l&#39;autre main, essuyer la zone à injecter à nouveau avec un tampon imbibé d&#39;alcool. Laisser la surface de sécher. </li><li> Prenez la seringue avec l&#39;injection à la main et la tenir par la bride et l&#39;extrémité du piston, prête pour l&#39;injection. </li><li> Terminez la procédure en suivant ce protocole de l&#39;étape 4.3.9 à l&#39;étape 4.3.17, comme décrit précédemment. </li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+catheter-based+procedures+for+transducing+the+isolated+rabbit+liver+with+plasmid+DNA.">Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).</li><li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume.">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).</li><li>Vanden Bossche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+general+aspects+of+the+distribution+and+epidemiology+of+bovine+trypanosomosis+in+southern+Africa.">Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa.</a> Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).</li><li>Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis:+Epidemiology+and+control.">Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control.</a> Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).</li><li>Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein.">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li><li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosome+lytic+factor,+a+subclass+of+high-density+lipoprotein,+forms+cation-selective+pores+in+membranes.">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li><li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes.">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li><li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model.">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li><li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei.">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li><li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes.">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans.">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li><li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene.">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li><li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver.">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Quand elle est réalisée correctement, HGD est un moyen remarquablement efficace et sans danger de la livraison du transgène. Les étapes essentielles à la réussite de HGD sont: 1) fournir la bonne quantité d&#39;ADN dans un grand volume d&#39;eau salée véhicule 2) dans la veine de la queue de la souris 3) en moins de 8 secondes. Bien que le processus d&#39;injection elle-même exige indéniablement une certaine dextérité manuelle, le succès de cette deuxième procédure de six ré...

Depuis sa première description par Liu et al. Et Zhang et al., La livraison de gène hydrodynamique (DHG) est devenu un outil précieux pour étudier la fonction des gènes dans des systèmes modèles de rongeurs 1, 2. La technique implique l&#39;injection rapide (7.5 sec) d&#39;un volume important (12.8% de poids corporel) de la solution dans la veine caudale de souris afin de faciliter l&#39;absorption de l&#39;ADN plasmidique par des cellules d&#39;organes cibles 1, 2. Ces conditions conduisent à l&#39;expression des gènes dans le foie robuste et moins l&#39;expression du gène dans le rein, la rate, les poumons et le cœur. Injection de 10 pg pCMV-LacZ plasmide peut transfecter autant que 40% des hépatocytes, ce qui HGD non-virale, la méthode la plus efficace, in vivo livraison de gène à la date 1. Contrairement transporteurs virales, pDNA est facile à préparer, ne provoque pas une réponse immunitaire chez l&#39;hôte rongeur 3 et ne pose pas de risque pour la santé par se recombiner avec finvirus exogène. En outre, puisque les molécules d&#39;ADN fournis par HGD n&#39;ont pas besoin de l&#39;emballage, cette méthode est adaptée pour la livraison de chromosomes artificiels de bactéries (BAC) aussi grandes que 150 ko 4. D&#39;autres types de molécules qui ont été délivrés par un procédé hydrodynamique comprennent l&#39;ARN de 5 à 10, 11 morpholinos, des protéines de 12, 13 et d&#39;autres petites molécules 12, 14. Les avantages et les inconvénients de HGD sur les autres méthodes de livraison ont été abordés dans d&#39;excellentes critiques dans la littérature 15-20 et un certain nombre d&#39;auteurs ont fourni une description détaillée de la procédure 21-23. L&#39;introduction de transgènes dans des souris par le MH est sûr et efficace 1-3, 24 et le procédé a été utilisé avec succès chez des rats comparable 25. Avec certaines modifications, des expériences de validation de concept ont été réalisées chez les poulets, 26 rables bits 27 et 28 porcs, bien que, l&#39;application in vivo de cette technique dans les plus grands animaux reste un défi. Lorsqu&#39;on utilise ce procédé, une autre limitation commune est que la plupart des vecteurs d&#39;expression mammaliens disponibles ne disposent pas des composants pour atteindre une persistante, le niveau élevé de l&#39;expression génique. L&#39;utilisation d&#39;un plasmide, l&#39;expression du gène pCMV-Luc dans les organes cibles est évident dès dix minutes après HGD, toutefois, le niveau d&#39;expression initial, haute diminue fortement dans la première semaine après l&#39;injection 1. L&#39;expression du transgène à long terme est possible selon le promoteur et l&#39;intron utilisés dans la conception de plasmide 3, 24 injections Toutefois, le maintien de l&#39;expression du gène de haut niveau nécessite souvent répété. Pour cette raison, HGD peut-être moins approprié pour étudier les maladies chroniques qui sont le résultat de l&#39;exposition à long terme à des protéines nuisibles ou des produits protéiques. Avec ces limitations, HGD est un outil extrêmement puissant pour étudier la potiel rôle d&#39;un gène et l&#39;effet de celle des mutants in vivo, ainsi que les effets thérapeutiques et la régulation des protéines et pour établir des modèles animaux de la maladie (pour revue, voir 15). Par exemple, HGD peut être utilisée pour affecter la fonction des domaines et des acides aminés des protéines en introduisant individuellement différentes constructions de gènes dans les souris qui ont les gènes respectifs assommé. En outre, cette technique peut être utilisée dans n&#39;importe quelle souche de souris. Ce protocole décrit HGD chez la souris avec un accent sur les aspects techniques nécessaires à la réalisation transfection réussie: insertion correcte de l&#39;aiguille dans la veine, le volume d&#39;injection et la rapidité de livraison. L&#39;application de cette méthode est démontrée dans un modèle de souris de la trypanosomiase africaine, une maladie mortelle de l&#39;homme et de l&#39;élevage 29, 30. Bien que plusieurs espèces de trypanosomes causent la maladie chez le bétail, la plupart ne peuvent pas provoquer la maladie chez l&#39;homme due à des complexes immuns innés en blood appelées facteurs lytiques des trypanosomes (TLF) 29, 31, 32. Ces, lipoprotéines de haute densité formation de pores (HDL) contiennent deux protéines, les primates spécifique uniques:. HPR, le ligand de, ce qui facilite l&#39;absorption de TLF dans les trypanosomes, et PALO-I, le composant lytique 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense est capable d&#39;infecter les êtres humains en raison de l&#39;expression d&#39;une protéine associée à la résistance de sérum (SRA) qui se lie à et neutralise apoL-I humain 34, 39. Baboon TLF n&#39;est pas neutralisé par SRA en raison de sa divergent protéine PALO-I 40. Comme indiqué précédemment, en utilisant un vecteur d&#39;expression de mammifère (pRG977), l&#39;expression transgénique de babouin composants TLF chez la souris confère une protection contre les trypanosomes humains-infectieux 40. Les données représentatives présentées ici montrent comment la délivrance de gènes hydrodynamique peut être appliquée pour étudier les effets thérapeutiques d&#39;une protéine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Prep Wipe</td>
			<td style="width:113px;">Webcol</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6818</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AST kit, Amplite Colorimetric</td>
			<td style="width:113px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical Tube, 50 ml</td>
			<td style="width:113px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:113px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:113px;">KIMTECH</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse Tail Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MTI RST</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pRG977 (mammalian expression vector)</td>
			<td style="width:113px;">Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">NC9054335</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:167px;">Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice

L&#39;expression efficace de transgènes in vivo est d&#39;une importance critique pour l&#39;étude de la fonction génique et le développement de traitements pour des maladies. Au cours des dernières années, la livraison de gène hydrodynamique (DHG) a émergé comme une méthode simple, rapide, sûr et efficace pour fournir des transgènes dans les rongeurs. Cette technique repose sur la force générée par l&#39;injection rapide d&#39;un grand volume de solution physiologique pour augmenter la perméabilité des membranes cellulaires des organes perfusés et ainsi délivrer de l&#39;ADN dans les cellules. L&#39;un des principaux avantages de HGD est la possibilité d&#39;introduire des transgènes dans des cellules de mammifère en utilisant l&#39;ADN plasmidique nu (ADNp). L&#39;introduction d&#39;un gène exogène en utilisant un plasmide est peu laborieux, très efficace et, contrairement aux transporteurs virales, remarquablement sûr. HGD a été initialement utilisé pour délivrer des gènes dans des souris, il est maintenant utilisé pour délivrer une large gamme de substances, y compris des oligonucleotides, des chromosomes artificiels, des ARN, des protéines et de petites molécules dans des souris, des ratset, à un degré limité, d&#39;autres animaux. Ce protocole décrit HGD chez la souris et se concentre sur trois aspects clés de la méthode qui sont essentiels à l&#39;exécution de la procédure avec succès: une bonne insertion de l&#39;aiguille dans la veine, le volume d&#39;injection et la rapidité de livraison. Des exemples sont donnés pour montrer l&#39;application de cette méthode pour l&#39;expression transitoire de deux gènes qui codent pour des protéines sécrétées, des primates-spécifique, l&#39;apolipoprotéine LI (apoL-I) et la protéine apparentée à l&#39;haptoglobine (HPR).

Le positionnement correct de l&#39;aiguille dans la veine de la queue de la souris (comme illustré à la figure 1) est une condition préalable pour avoir réussi un transgène par transfection à base d&#39;hydrodynamique. Souvent, la partie la plus difficile de la technique, cependant, est le maintien de l&#39;aiguille dans la veine de la queue sans mouvement de sorte que la totalité du volume de l&#39;injection peut être rendu dans un délai de 6-8 s. Les erreurs mineures au cours du processus d&#...

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Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Dans la transfection in vivo d&#39;ADN nu par la délivrance de gènes hydrodynamique introduit les gènes dans le tissu d&#39;un animal avec une réponse inflammatoire minime. Des quantités suffisantes de produit du gène sont générées de telle sorte que la fonction des gènes et de la réglementation ainsi que la structure et la fonction des protéines peuvent être analysées.

Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

transient-expression-of-proteins-by-hydrodynamic-gene-delivery-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

28.3K vues.  Hunter College, CUNY.  Dans la transfection in vivo d'ADN nu par la délivrance de gènes hydrodynamique introduit les gènes dans le tissu d'un animal avec une réponse inflammatoire minime. Des quantités suffisantes de produit du gène sont générées de telle sorte que la fonction des gènes et de la réglementation ainsi que la structure et la fonction des protéines peuvent être analysées. 

Vidéo: Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Recherche

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.