Wir danken Xia Liu (Neron Pharmaceuticals) für zunächst lehrt uns die HGD Technik und Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) für seine kontinuierliche Führung in verschiedenen Aspekten der Technologie. Diese Arbeit wurde vom Hunter College finanziert CUNY Startkapital und NSF Brot Auszeichnung IOS-1249166. Wir danken der NYULMC Histopathologie Kern NYUCI Center Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 für die Histologie auf Mäuselebern.

Alle hier beschriebenen Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Hunter College, City University of New York zugelassen. 1. Vorbereitung der Endotoxin-freiem Plasmid-DNA <ol><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie von Bakterien, die das Gen von Interesse in einer Säugetier-Expressionsvektor von einer frisch ausgestrichenen selektive Platte. </li><li> Folgen Sie den Empfehlungen im Handbuch eines handelsüblichen Endotoxin-freie Plasmid-Reinigungs-Kits für den Anbau und die Ernte Bakterien gefunden. </li><li> Reinige den Endotoxin-freie Plasmid-DNA aus Bakterienzellen durch nach dem Protokoll von einem kommerziell erhältlichen Endotoxin-freiem Plasmid-Reinigungskits. </li><li> Verwenden Endotoxin-freiem Kunststoff-ware und Griff-DNA mit darauf, dass Endotoxin wird nicht in der DNA-Probe nach dem Entfernen Schritt wieder eingeführt. </li><li> Messung der Konzentration von Endotoxin-freiem Plasmid-DNA durch Bestimmung seiner Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines MICRo-Volumen UV-Spektrophotometer wie unten beschrieben, oder ein Standard-Küvetten-basierte Spektralphotometer. <ol><li> Reinigen der unteren und oberen optischen Oberflächen der Mikro Spektrophotometer Probenhaltesystem wie folgt. Je 1 ul sauber VE-Wasser auf die untere optischen Systems. Schließen Sie den Hebelarm und tippen Sie es ein paar Mal, um die obere optische System zu baden, dann den Hebel zum Öffnen und wischen Sie mit einem Gewebe. </li><li> Öffnen Sie die Software von der Mikro-Spektralphotometer und wählen Sie die Nukleinsäuren-Modul. </li><li> Platz 1 ul sauber VE-Wasser auf der unteren optischen System, senken Sie den Hebelarm und wählen Sie &quot;initialisieren&quot; aus dem Programm-Software. Sobald die Initialisierung abgeschlossen ist, reinigen Sie beide optischen Flächen mit einem Tuch .. </li><li> Führen Sie Blindmessung durch Laden von 1 ul der Endotoxin-freiem TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) und wählen Sie &quot;blank&quot; aus dem Programm-Software. Sobald Leermessung durchgeführt wird, sauber sowohl optischen Oberflächen mit einemGewebe. </li><li> Führen Probenmessung durch Laden 1 Mikroliter Endotoxin-freie DNA-Probe und wählen Sie &quot;Maßnahme&quot; aus der Programm-Software. Notieren Sie sich die DNA-Konzentration. Bewerten DNA Reinheit durch die Aufnahme der Absorptionsverhältnis 260/280 nm, die auf dem Bildschirm erscheint. Da die Verwendung von reiner DNA (260/280 Verhältnis von 1,8) für HGD ist sehr wünschenswert, zu vermeiden, mit einer DNA-Probe mit einem Verhältnis von 260/280 unter 1,7. Nach Messung durchgeführt wird, reinigen Sie beide optischen Flächen mit einem Tuch. </li></ol></li></ol> 2. Wiegen der Mäuse <ol><li> Mark Mäuse in einer angemessenen Art und Weise für den Stamm. Hinweis: Kennzeichnung der Schwanz wird für dieses Verfahren nicht empfohlen. <ol><li> Mark Mausarten, die weißes Fell (z. B. Swiss Webster) auf dem Rücken mit einem schwarzen Marker zu haben. Wenden Marken im Laufe der Zeit wie nötig. </li><li> Mark Mausarten, die schwarzes Fell (zB C57BL / 6) mit dem Ohr haben Stanzen mehrere Tage im Voraus. </li></ol></li><li> Wiegen Mäuse individually vorsichtig, indem sie in einem Tier Waagschale oder Eimer auf einem digitalen Laborwaage gelegt. Das Gewicht jeder Maus in dem Experiment verwendet, am Tag des Experiments. </li></ol> 3. Vorbereitung von Spritzen <ol><li> Herstellung der Injektionsmischung <ol><li> Berechnen der Menge an DNA unter der Annahme, 5 erforderlich - 50 ug Endotoxin-freie Plasmid-DNA für die Injektion von jeder Maus. <ol><li> Bestimmung der optimalen Menge an Plasmid-DNA experimentell. </li><li> Bei der Bestimmung der Menge an DNA benötigt wird, übernehmen Injektion einer zusätzlichen Maus pro Gruppe, wie eine ordnungsgemäße Ladung der Spritzen einige zusätzliche Injektion Mix erforderlich. Um Berechnungen zu helfen, sollten Sie das folgende Beispiel: injizieren 4 Versuchs und 4 Kontroll-Mäusen, einem Gewicht von jeweils 25 g, mit 50 ug Plasmid-DNA pro Maus. Um die Menge an DNA in diesem Fall notwendig zu bestimmen, berechnet mit 5 Mäusen pro Gruppe: 5 x 50 = 250 &amp;mgr; g pro &amp;mgr; g DNA Gruppe benötigt. </li></ol></li><li> Bestimmung der Menge an Salzlösung (0,9% Natriumchlorid) unter der Annahme von 10% des Körpergewichts für die Injektion von jeder Maus erforderlich. <ol><li> Gemäß dem obigen Beispiel injizieren je 25 g Maus mit 50 ug Plasmid-DNA in 2,5 ml Kochsalzlösung (2,5 g Flüssigkeit). </li><li> Bei der Bestimmung der Menge an Kochsalzlösung für eine ganze Gruppe von Mäusen erforderlich, übernehmen Injektion einer zusätzlichen Maus pro Gruppe, um eine ordnungsgemäße Beladung der Spritzen zu ermöglichen. Berücksichtigung des Experiments gegeben, die Berechnung der Menge an Kochsalzlösung für 5 Mäuse in jeder Gruppe benötigt: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml Kochsalzlösung für jede Gruppe (oder 25 ml insgesamt). Hinweis: Wenn Mäusen innerhalb der gleichen Gruppe sind nicht das gleiche Gewicht (mehr als 10% Unterschied im Körpergewicht), bereiten Injektion vermischt sich getrennt. </li></ol></li><li> Verwenden Konservierungsmittel-und Endotoxin-frei, steriler Kochsalzlösung, die für den menschlichen Gebrauch zugelassen wurde, in 10 ml, Mehrfachnutzung Fläschchen. </li><li> Verwendung einer 20-Gauge-Nadel (0,9 mm x 25 mm) mit einem Luer-Lock-Spitze einer 20 ml-Spritze angebracht ist,ziehen Sie die Flüssigkeit aus Salzfläschchen und leeren die Spritzen in einen 50 ml konischen Röhrchen. Um genaue Pipettieren von Salz während der Herstellung der DNA-Kochsalzinjektion Mischungen helfen, sammeln mehr als Salzlösung für die Injektion von allen Mäusen in dem Experiment benötigt. Für das Experiment oben zurückzuziehen Kochsalzlösung aus 3, 10 ml Vials (insgesamt etwa 30 ml), selbst wenn die berechnete Menge von Kochsalzlösung für das Experiment erforderlich ist, ist nur 25 ml. </li><li> Pipettieren die berechnete Menge an DNA in einen anderen 50 ml konischen Röhrchen. Achten Sie darauf, nicht auf die Seite der Röhre mit der Pipette Körper zu berühren, um die Einführung von Endotoxin zu vermeiden. Gemäß dem Beispiel, pipettieren 250 ug und 250 ug Steuer experimenteller Plasmid-DNA in separaten konischen Röhrchen. </li><li> Die erforderliche Menge an Salzlösung mit der DNA unter Verwendung einer serologischen Pipette. In Anbetracht der Proben Experiment Pipette 12,5 ml Kochsalzlösung zu jeder der Master-Mixe (Versuchs-und Kontroll). </li><li> Lassen Sie alle Lösungen zu erreichen,Raumtemperatur vor der Injektion. </li></ol></li><li> Vorbereitung von Spritzen <ol><li> Für jede Maus Füllen eines sterilen 3 ml, Luer-Lock-Spritze mit der DNA-Kochsalzmischung mit einer sterilen 20-Gauge-Nadel (0,9 mm x 25 mm). Achten Sie darauf, um Luftblasen zu vermeiden. Vermeiden, mit höheren Volumen Spritzen als die Strömungsgeschwindigkeit der Injektion kann nicht sehr gut gesteuert werden und es schwierig ist, größere Spritzen in einer Hand manipulieren. Werfen Sie überschüssiges DNA-Salzmischung zurück in den konischen Rohr dies auch sein mag wieder verwendet werden. </li><li> Wechseln Sie die Nadel in einem sterilen, 27-Gauge-Nadel. Füllen Sie die Nadel mit der Flüssigkeit vollständig, ohne dabei Luftblasen. Stellen Sie die Lautstärke der DNA-Kochsalzmischung als bezogen auf das Gewicht der Maus berechnet. </li><li> Lassen Sie das nicht begrenzten Nadel nicht mit einer nicht-sterilen Oberfläche berühren. Falls erforderlich, können Nadeln wieder verschlossen mit der Ein-Hand-Technik werden: Legen Sie den Deckel auf eine ebene Fläche, die Nadel legen, ohne das Festhalten an der Kappe mit der anderen Hand und drücken Sie die bedeckten Nadelgegen einen festen Gegenstand, den Deckel auf die Nadel zu sichern. Die Spritzen sind nun bereit für Schwanzvene Injektionen. </li></ol></li></ol> 4. Hydrodynamische DNA-Abgabe <ol><li> Beachten Sie, dass Anästhesie Mäuse können Lebensfähigkeit zu reduzieren. Vermeiden Sie es, HGD in einem Raum, der zu kalt ist, da dies auch zu einer Verminderung Lebensfähigkeit. Wenn der Raum hat eine Umgebungstemperatur von 20 ° C oder bei Verwendung von Anästhesie, legen die Mäuse auf einem Heizkissen bei 37 ° C nach dem Eingriff festgelegt, um den Verlust von Tieren zu vermeiden. Bei der Verwendung von Anästhesie, sicherzustellen, dass der Mund und Zunge des Maus frei sind, während auf dem Heizkissen und beobachten Sie die Maus, bis es vollständig erholt. Keine Lebensmittel oder Wasser zurückzuhalten, nicht von den Mäusen vor der HGD. </li><li> Wärmen Sie die Maus, um die Blutgefäße erweitern. <ol><li> Platzieren Sie die Maus Käfig (mit Einstreu) auf einem Heizkissen für 5 Minuten, so dass die Temperatur der Betten beträgt ca. 38-39 ° C. Die Temperatur sollte niedrig genug, um die Mäuse auf dem Heizkissen für eine haltenZeitraum verlängert. </li><li> Alternativ legen Sie mit der Maus in einen dorsalen Zugang Rainer mit minimaler Zurückhaltung. Wärmen Sie den Schwanz der Maus für 1 min durch leichtes Halten Sie es mit einem Stück Gaze in warmem Wasser benetzt. Ermöglichen Maus neu zu positionieren, wenn nötig. Wischen Sie den Schwanz mit einem Tuch zu trocknen. </li><li> Alternativ warme Maus, indem der Käfig unter einer Wärmelampe für nicht mehr als 2 min. Bei Verwendung einer Wärmelampe, Vorsicht walten lassen, um eine Überhitzung der Maus zu vermeiden. </li></ol></li><li> Large-Volume-Injektion in die Schwanzvene <ol><li> Immobilisieren einen dorsalen Zugang Rainer auf einer ebenen Fläche durch Labor Band. </li><li> Halten am Schwanz, die Maus sanft in den Restrainer und den Stecker. Verwenden Sie so wenig Zurückhaltung wie nötig, um den Schwanz zu halten immobilisiert. Stellen Sie sicher, dass die Maus frei zu atmen. </li><li> Wenn die Maus ist in schwere Bedrängnis zu jedem Zeitpunkt während des Verfahrens, entfernen Sie die Maus aus dem Restrainer sofort und lassen Sie es ruhen. </li><li> Bewegen Sie die Maus soeiner der lateralen Schwanzvenen sichtbar ist. Suchen Sie die seitlichen Schwanzvenen suchen Sie gerade nach unten an der Rückseite der Maus: Die rote Linie in der Mitte des Schwanzes läuft eine Arterie, während die blauen Linien auf beiden Seiten der Schwanz sind die seitlichen Schwanzvenen. </li><li> Wischen Sie den Schwanz der Maus gründlich mit einem Alkoholtupfer. </li><li> Verwendung der Nicht-Einspritz Hand den Schwanz fest zwischen Zeigefinger und Mittelfinger, so dass der Schwanz tritt unter dem Zeigefinger über den mittleren und dritten Finger und unter dem kleinen Finger. Lassen Sie den Daumen frei beweglich zu bleiben. (1A) </li><li> Mit der anderen Hand, wischen Sie die Fläche wieder mit einem Alkoholtupfer eingespritzt werden. Ermöglichen Bereich zu trocknen. </li><li> Nehmen Sie den geladenen Spritze mit der Injektions Hand und halten Sie sie durch den Lauf zwischen Daumen und den anderen vier Ziffern. Nicht auf die Kolben nicht festhalten. </li><li> Positionieren der Spritze parallel zum Heck mit der Nadel in Richtung des Körpers der Maus unddie Schräge (schräge Kante) der Nadel nach oben zeigt. </li><li> Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene. Weiter mit der Injektion, wenn die Vene vollständig entfernt, was sich von der Nadel Einschieben ohne Widerstand. Beachten Sie, dass die Tiefe der Nadelung ist eine Frage des persönlichen Geschmacks jedoch das vollständige Einführen aufgrund eines erhöhten Risikos für das Scheren der Vene empfohlen. Vermeiden Bewegen der Nadel. </li><li> Mit dem Daumen der Schwanz an der Hand, und schließen Sie auf der Nabe der Nadel und drücken Nabe gegen den Schwanz, um die Nadel in Position zu halten. Extremen Druck nicht und sind nicht auf Nadelschaft zu halten, da diese die Strömung der Flüssigkeit in die Vene behindern. Halten Sie den Schwanz mit dem Zeigefinger locker an dieser Stelle, um nicht zu behindern Injektion (Abbildung 1A). </li><li> Re-Positionierung des Spritzenhalte Hand, so dass der Zeigefinger und Mittelfinger sind auf den Flansch Halten und der Daumen auf das Ende des Kolbens (FigurE 1A). </li><li> Drücken Sie auf Kolben in einem, kontinuierliche Bewegung und injizieren das volle Volumen der Flüssigkeit in 6-8 sek. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Vene und die Blutung zu stoppen durch leichten Druck auf den Schwanz mit einem Gewebe. </li><li> Entfernen Sie mit der Maus aus dem Restrainer und Ort der Maus in eine Erholungskäfig auf einem Heizkissen platziert (Bettwäsche sollte 37-38 ° C sein). Wenn der Injektionsraum kalt ist, ist dieser Schritt nicht entscheidend für das Überleben der Mäuse. Halten Sie auf den Schwanz der Maus, bis Blutung stoppt vollständig. </li><li> Beachten Sie die Maus für 1 h folgende hydrodynamischen DNA Lieferung. Eine erste Frist von Keuchen und Unbeweglichkeit ist normal aufgrund der temporären Herzrhythmusstörungen verursacht durch HGD aber stellen Sie sicher, dass die Maus zeigt Anzeichen der Erholung in ca. 5 min. Wenn das Atmen der Maus wird überaus flach, sanft massieren den Bauch der Maus, um die Atmung zu erleichtern. Beachten Sie, dass Verwertungsquote kann etwas von der Mausstamm verwendet, beeinflusst werden. </li><li> Zurück Mausbis Gehäusekäfig und sicherzustellen, dass Maus hat ein reichhaltiges Angebot an Essen und Wasser. </li></ol></li><li> Großvolumige Schwanzveneninjektion mit einer alternativen Handposition <ol><li> Zeigen Maus in den Restrainer und die Vorbereitungen für Einspritzung durch folgende Schritte 4.3.1 bis 4.3.5, wie zuvor beschrieben. </li><li> Legen Sie das nicht injizierenden Hand auf einer ebenen Fläche mit vier Fingern an einer Neunzig-Grad-Winkel gebogen. Die Finger (alle außer Daumen) sollte auf der jeweils anderen ruhen, die Schaffung einer Plattform. Halten Sie den Schwanz der Maus zwischen Daumen und Zeigefinger (Abbildung 1B). </li><li> Mit der anderen Hand, wischen Sie die Fläche wieder mit einem Alkoholtupfer eingespritzt werden. Ermöglichen Bereich zu trocknen. </li><li> Schnappen Spritze mit der Injektions-Hand und halten Sie es an dem Flansch und dem Ende des Kolbens, bereit zur Injektion. </li><li> Füllen Sie das folgende Verfahren durch dieses Protokoll von Schritt 4.3.9 bis 4.3.17 Schritt, wie zuvor beschrieben. </li></ol></li></ol>

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R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors.">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li><li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trypanolytic+factor+of+human+serum.">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li><li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum.">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li><li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum.">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li><li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein.">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li><li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosome+lytic+factor,+a+subclass+of+high-density+lipoprotein,+forms+cation-selective+pores+in+membranes.">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li><li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes.">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li><li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model.">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li><li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei.">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li><li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes.">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans.">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li><li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene.">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li><li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver.">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wenn richtig ausgeführt, ist HGD ein bemerkenswert sicheres und wirksames Mittel der Trans Lieferung. Die kritischen Schritte zur erfolgreichen HGD sind: 1) Bereitstellung der richtigen Menge von DNA in einem großen Volumen an Kochsalzträger 2) in die Schwanzvene der Maus, 3) in weniger als 8 Sekunden. Obwohl der Prozess der Injektion selbst erfordert zweifellos etwas Fingerfertigkeit, der Erfolg dieser sechs zweite Verfahren liegt oft in der sorgfältigen Vorbereitung des Experiments. Di...

Seit der ersten Beschreibung von Liu et al. Und Zhang et al., Hydrodynamische Gentransfer (HGD) hat sich ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung der Genfunktion in Nagetier-Modellsysteme 1, 2. Die Technik beinhaltet die schnelle Injektion (5-7 sec) von einem großen Volumen (8-12% des Körpergewichts) der Lösung in die Schwanzvene von Mäusen, die Aufnahme von Plasmid-DNA durch die Zellen des Zielorganen 1, 2 zu erleichtern. Diese Bedingungen führen zu robusten Genexpression in der Leber und weniger Gen-Expression in der Niere, Milz, Lunge und Herz. Injektion von 10 ug pCMV-LacZ-Plasmid kann so viel wie 40% der Leberzellen zu transfizieren, so dass HGD die effizienteste, nicht-viralen, in vivo Genübertragung Verfahren Beginn 1. Anders als Virusträger, ist pDNA einfach zuzubereiten, ist eine Immunantwort in der Nagetier-Host 3 nicht zu entlocken ist und nicht ein Gesundheitsrisiko darstellen durch Rekombination mit Endeexogenen Viren. Zusätzlich kann, da die DNA-Moleküle durch HGD geliefert brauchen nicht Verpackung, eignet sich dieses Verfahren für die Bereitstellung von künstlichen Bakterienchromosomen (BAC) so groß wie 150 4 kb. Andere Arten von Molekülen, die durch ein hydrodynamisches Verfahren geliefert worden sind, umfassen RNA 5-10, 11 Morpholinos, Proteine ​​12, 13 und andere kleine Moleküle 12, 14. Die Vor-und Nachteile der HGD gegenüber anderen Versandmethoden sind in sehr guten Bewertungen in der Literatur 15-20 diskutiert und eine Reihe von Autoren haben eine detaillierte Beschreibung der Vorgehensweise 21 bis 23 vorgesehen. Einführen von Transgenen in Mäusen durch HGD ist sicher und wirksam 1-3, 24 und das Verfahren wurde bei Ratten mit vergleichbarem Erfolg 25 verwendet. Mit gewissen Modifikationen, Proof-of-Concept-Experimente wurden in 26 Hühner, Kaninchen durchgeführtBits 27 und 28 Schweine, obwohl die in vivo Anwendung dieser Technik bei größeren Tieren bleibt eine Herausforderung. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist eine weitere gemeinsame Einschränkung, dass viele der verfügbaren Säugetierexpressionsvektoren nicht über die Komponenten, um eine anhaltende, hohe Genexpression zu erreichen. Mit einem pCMV-Luc-Plasmid, die Genexpression in den Zielorganen ist offensichtlich so früh wie zehn Minuten nach HGD fällt jedoch die anfängliche, hohe Expressionsniveau stark in der ersten Woche nach der Injektion ein. Langzeit-Expression des Transgens ist möglich, je nach dem Promotor und Intron in Plasmid-Design 3, 24 jedoch, Wartung von High-Level-Genexpression erfordert häufig wiederholte Injektionen verwendet. Aus diesem Grund könnte HGD weniger geeignet, um chronische Krankheiten, die eine Folge der langfristigen Exposition gegenüber schädlichen Proteine ​​oder Proteinprodukte sind zu studieren. Mit diesen Einschränkungen ist HGD ein außergewöhnlich leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der pozial Rolle des Gens und die Wirkung davon Mutanten in vivo, als auch die therapeutischen Wirkungen und Regulation von Proteinen und für die Festlegung von Tiermodellen der Erkrankung (für eine Übersicht siehe 15). Zum Beispiel kann verwendet werden, um Funktion HGD, Domains und Aminosäuren von Proteinen durch Einbringen individuell verschiedene Genkonstrukte in Mäusen, wurden die entsprechenden Gene ausgeknockt zuzuweisen. Darüber hinaus kann diese Technik in jedem Mausstamm verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt HGD bei Mäusen mit einem Fokus auf die technischen Aspekte notwendig, um eine erfolgreiche Transfektion zu erreichen: Die richtige Nadeleinführung in die Vene, Einspritzmenge und die Geschwindigkeit der Lieferung. Die Anwendung dieses Verfahrens ist in einem Mausmodell der afrikanischen Trypanosomiasis, einer tödlichen Erkrankung von Mensch und Vieh 29, 30 gezeigt. Während einige Arten der Trypanosomen verursachen Krankheit in Nutztiere, können die meisten nicht-Krankheit beim Menschen durch Immunkomplexe in b angeborenen verursachenlood genannt Trypanosomen lytische Faktoren (Tlfs) 29, 31, 32. Diese porenbildenden, hochdichten Lipoproteinen (HDL) enthält zwei einzigartige, Primaten-spezifischen Proteinen:. HPR, die Liganden, die die Aufnahme von Tlfs in Trypanosomen erleichtert und APOL-I, die lytische Komponente 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense der Lage ist, Menschen aufgrund der Expression eines mit Serumresistenz assoziierten Proteins (SRA), das bindet und neutralisiert menschliche APOL-I 34, 39 zu infizieren. Baboon TLF wird nicht von SRA aufgrund ihrer divergierenden APOL-I-Protein 40 neutralisiert. Wie bereits berichtet, mit einem Säugetier-Expressionsvektor (pRG977), transgenen Expression von Pavian TLF-Komponenten in Mäusen einen Schutz gegen die Menscheninfektiösen Trypanosomen 40. Die hier präsentierten Daten demonstrieren, wie repräsentativ hydrodynamischen Genübertragung angewendet werden, um die therapeutischen Wirkungen des Proteins zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Prep Wipe</td>
			<td style="width:113px;">Webcol</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6818</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AST kit, Amplite Colorimetric</td>
			<td style="width:113px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical Tube, 50 ml</td>
			<td style="width:113px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:113px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:113px;">KIMTECH</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse Tail Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MTI RST</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pRG977 (mammalian expression vector)</td>
			<td style="width:113px;">Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">NC9054335</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:167px;">Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice

Effiziente Expression von Transgenen in vivo ist von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung der Genfunktion und der Entwicklung von Behandlungen für Krankheiten. In den letzten Jahren hat hydrodynamische Gentransfer (HGD) als eine einfache, schnelle, sichere und effektive Methode für die Bereitstellung von Transgenen in Nagetiere entstanden. Diese Technik beruht auf der von der schnellen Injektion einer großen Menge einer physiologischen Lösung, um die Durchlässigkeit der Zellmembranen des perfundierten Organen erhöhen erzeugte Kraft und liefern somit DNA in Zellen. Einer der Hauptvorteile der HGD ist die Fähigkeit, Transgene in Säugerzellen unter Verwendung nackter Plasmid-DNA (pDNA) einzuführen. Einführen eines exogenen Gens unter Verwendung eines Plasmids ist minimal aufwendig, sehr leistungsfähig und im Gegensatz zu viralen Träger, bemerkenswert sicher. HGD wurde ursprünglich verwendet, um Gene in Mäuse zu liefern, wird nun verwendet, um eine Vielzahl von Stoffen, einschließlich Oligonukleotide, künstliche Chromosomen, RNA, Proteine ​​und kleine Moleküle in Mäuse, Ratten liefernund bis zu einem begrenzten Grad, andere Tiere. Dieses Protokoll beschreibt HGD bei Mäusen und konzentriert sich auf drei zentrale Aspekte der Methode, die entscheidend für den erfolgreichen Durchführung des Verfahrens sind: richtige Einführen der Nadel in die Vene, das Injektionsvolumen und die Geschwindigkeit der Lieferung. Beispiele werden gegeben, um die Anwendung dieser Methode auf die transiente Expression von zwei Genen, die abgesondert wird, Primaten-spezifische Proteine ​​kodieren zeigen, Apolipoprotein LI (APOL-I) und Haptoglobin-related protein (HPR).

Korrekte Positionierung der Nadel in die Schwanzvene der Maus (wie in Fig. 1 dargestellt) ist eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Abgabe eines Transgens durch die Hydrodynamik basierende Transfektion. Oft der schwierigste Teil der Technik ist jedoch die Beibehaltung der Nadel in die Schwanzvene ohne Bewegung, so daß das gesamte Volumen der Injektion innerhalb 6-8 s geliefert werden. Kleinere Fehler beim Einspritzvorgang kann in beträchtlichem Ausmaß verringert Transfektionseffizienz und Protein...

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Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

In-vivo-Transfektion von nackter DNA durch hydrodynamische Genübertragung führt Gene in das Gewebe eines Tieres mit minimalen Entzündungsreaktion. Ausreichende Mengen an Genprodukt erzeugt werden, so dass Genfunktionen und Regelung sowie die Proteinstruktur und Funktion untersucht werden.

Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

transient-expression-of-proteins-by-hydrodynamic-gene-delivery-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

28.3K Aufrufe.  Hunter College, CUNY.  In-vivo-Transfektion von nackter DNA durch hydrodynamische Genübertragung führt Gene in das Gewebe eines Tieres mit minimalen Entzündungsreaktion. Ausreichende Mengen an Genprodukt erzeugt werden, so dass Genfunktionen und Regelung sowie die Proteinstruktur und Funktion untersucht werden. 

Serie: Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.