우리는 처음에 우리에게 기술의 다양한 측면에서 자신의 지속적인 안내 HGD 기술과 러셀 박사 톰슨 (의학의 알버트 아인슈타인 대학)을 가르치는 시아 리우 (Regeneron 제약) 감사합니다. 이 작품은 헌터 칼리지에 의해 투자되었다, CUNY는 기금을 시작하고 NSF 빵 상 IOS-1249166. 우리는 마우스의 간에서 조직학에 대한 NYULMC 조직 병리학 코어 NYUCI 센터 지원 그랜트, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 감사합니다.

여기에 설명 된 모든 실험은 헌터 칼리지의 기관 동물 케어 및 사용위원회, 뉴욕 시립 대학에 의해 승인되었습니다. 독소가없는 플라스미드 DNA의 1. 준비 <ol><li> 갓 줄무늬 선택적 판에서 포유 동물 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 포함하는 박테리아의 하나의 식민지를 선택합니다. </li><li> 박테리아의 성장과 수확에 대한 시판 독소가없는 플라스미드 정제 키트의 수첩에서 발견 된 권장 사항을 따르십시오. </li><li> 시판 엔도톡신 프리 플라스미드 정제 키트의 프로토콜에 따라 박테리아 세포에서 내 독소가없는 플라스미드 DNA를 정제 하였다. </li><li> 독소가없는 플라스틱 제품을 사용하고 독소가 제거 단계 후 DNA 샘플에 다시 도입되지 않도록주의하십시오 DNA를 처리합니다. </li><li> MICR를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 내 독소가없는 플라스미드 DNA의 농도를 측정O-볼륨 UV의 아래 기술 분광 광도계 또는 표준 큐벳 기반 분광 광도계. <ol><li> 다음 마이크로 분광 광도계 샘플 보유 시스템의 하부 및 상부 광학 표면을 청소한다. 하단 광 시스템에 깨끗한 탈 이온수 피펫 1 μL. 레버 암을 닫고 상단 광학 시스템을 목욕을 할 몇 번을 누른 다음 열기 레버를 티슈로 닦아냅니다. </li><li> 마이크로 분광 광도계의 소프트웨어를 열고 핵산 모듈을 선택합니다. </li><li> 레버 암을 낮추고 프로그램 소프트웨어에서 &quot;초기화&quot;를 선택, 하단 광 시스템에 1 μL 깨끗한 탈 이온수를 놓습니다. 초기화는 조직과 완전 깨끗 모두 광학 표면되면 .. </li><li> 프로그램 소프트웨어에서 &quot;공백&quot;을 선택, 내 독소없는 TE 버퍼 (1 ㎜ EDTA 10 mM 트리스로-C1, 산도 8.0) 1 μl를로드하여 빈 측정을 수행합니다. 빈 측정이 완료되면, 깨끗한 모두 광학 표면조직. </li><li> 프로그램 소프트웨어에서 독소없는 DNA 샘플 및 선택 &quot;측정&quot;의 1 μl를로드하여 시료 측정을 수행합니다. DNA 농도를 기록한다. 화면에 나타나는 흡광도 비 280분의 260 nm의 기록에 의해 DNA의 순도를 평가합니다. HGD 순수한 DNA (1.8 280분의 260 비)의 사용이 매우 바람직하기 때문에, 1.7 이하의 280분의 260 비율로 DNA 샘플을 사용하지 마십시오. 측정이 완료되면, 티슈로 모두 광학 표면을 청소합니다. </li></ol></li></ol> 2. 마우스의 무게 <ol><li> 변형의 방식으로 적절한의 마크 쥐. 참고 : 꼬리의 표시는이 절차를 사용하지 않는 것이 좋습니다. <ol><li> 검은 색 마커 자신의 허리에 흰색 모피 (예 : 스위스 웹스터)가 마크 마우스 종. 필요에 따라 시간이 지남에 마크를 다시 적용합니다. </li><li> 귀에서 검은 모피 (예 : C57BL / 6)이 표시 마우스 종은 사전에 몇 일 펀칭. </li></ol></li><li> 쥐 individua에 무게를베드로 부드럽게 동물 계량 팬 또는 양동이에 배치하여 디지털 실험 실용 저울에 배치. 실험 날에, 실험에 사용 된 각 마우스의 무게를 기록한다. </li></ol> 주사기의 3. 준비 <ol><li> 사출 믹스의 제조 <ol><li> 각 마우스의 주입을위한 50 μg 독소 프리 플라스미드 DNA - 5 가정에 필요한 DNA의 양을 계산한다. <ol><li> 실험적으로 플라스미드 DNA의 최적 량을 결정합니다. </li><li> 요구되는 DNA의 양을 결정할 때, 주사기의 적절한 로딩이 어떤 여분 주입 혼합을 필요로하므로, 그룹 당 하나의 부가적인 마우스의 주입을 가정한다. 계산을하기 위해, 다음 예를 살펴 보겠습니다 : 마우스 당 50 μg 플라스미드 DNA와, 4 실험 및 4 제어 마우스, 각 무게 25g을 주입. 각 그룹에 필요한 5 × 50 = 250 μg μg의 DNA :이 경우에 필요한 DNA의 양을 결정하기 위해, 그룹 당 5 마우스를 산출한다. </li></ol></li><li> 각 마우스의 주입 체중의 10 %를 가정하여 필요한 양의 식염수 (0.9 % 염화 나트륨)을 결정한다. <ol><li> 위의 예에 따르면, 2.5 ㎖의 생리 식염수 (2.5 g 액)에서 플라스미드 DNA 50 μg 각 25g 마우스를 주입. </li><li> 마우스의 전체 그룹에 필요한 염분의 양을 결정할 때, 주사기의 적절한로드를 허용 할 그룹 당 추가 마우스의 주입을 가정합니다. 주어진 실험을 고려하여, 각 그룹의 5 마우스에 필요한 염분의 양을 계산 : 5 × 2.5 ML = 각 그룹에 대해 12.5 ㎖의 생리 식염수 (25 ㎖의 총). 참고 : 동일한 그룹 내에서 마우스는 동일한 중량 (체중의 10 % 이상의 차이)되지 않는 경우에, 분사 별도 혼합 준비. </li></ol></li><li> 10 ㎖, 여러 사용 유리 병에, 인간의 사용이 승인 된 방부제 및 독소 무료, 멸균 식염수를 사용합니다. </li><li> 20 ML의 주사기의 루어 잠금 팁에 부착 된 20 게이지 바늘 (x 25mm 0.9 mm)를 사용하여,식염수 병에서 액체를 철회하고 50 ML 원뿔 관에 주사기를 비 웁니다. DNA-식염수 주입 믹스의 준비 기간 동안 생리 식염수의 정확한 피펫 팅을하기 위해, 실험의 모든 생쥐의 주입에 필요한 것보다 더 많은 염분을 수집합니다. 실험에 필요한 식염수 계산 양이 25 ml의 경우에도 위의 실험을 위해, 3 내지 10 ㎖의 바이알 (약 30 ㎖의 전체)에 식염수를 철회. </li><li> 다른 50 ㎖ 원추형 튜브에 DNA의 양을 계산 피펫. 독소의 도입을 방지하기 위해 피펫 몸 관의 측을 만지지 않도록주의하십시오. 예에 따라, 별도의 원뿔 튜브에 실험 플라스미드 DNA의 250 제어 ㎍의 250 μg을 피펫. </li><li> 혈청 피펫을 사용하여 DNA에 식염수의 필요한 금액을 추가합니다. 고려 샘플 실험 마스터 믹스 (실험 및 제어)의 각각에 피펫 12.5 ml의 식염수. </li><li> 모든 솔루션에 도달 할 수 있도록 허용주사 전에 실내 온도. </li></ol></li><li> 주사기의 준비 <ol><li> 각 마우스를 들어, 멸균, 20 - 게이지 바늘 (0.9 mm × 25 mm)를 사용하여 DNA-식염수 믹스 멸균 3 ㎖, 루어 로크 시린지를 채운다. 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. 주입 유량이 매우 잘 제어 될 수없고, 한 손에 큰 주사기를 조작하기 어려운 높은 볼륨으로 주사기를 사용하여 피. 이 재사용 할 수 있으므로 다시 원뿔 튜브에 초과 DNA-식염수 믹스를 꺼냅니다. </li><li> 멸균, 27 게이지 바늘로 바늘을 전환합니다. 완전히 공기 방울을 도입하지 않고 액체로 바늘을 입력합니다. 마우스의 중량을 기준으로 계산 된 DNA-식염수 믹스의 볼륨을 조정한다. </li><li> 캡핑 바늘이 비 멸균 표면을 만지지 않도록하십시오. 다른 손으로 뚜껑을 잡고하지 않고 바늘을 삽입하고 출장 바늘을 누르면, 평평한 표면에 캡을 씌워 : 필요한 경우, 바늘은 한 손 기술을 사용하여 다시 출장 할 수있다바늘에 뚜껑을 확보하기 위해 회사 개체에 대해. 주사기는 이제 꼬리 정맥 주사를위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 유체 역학 DNA 전달 <ol><li> 마취 마우스 가능성을 줄일 수 있습니다. 이 또한 가능성을 줄일 수로, 너무 추운 방에서 HGD을 수행하지 마십시오. 방은 20 ° C의 주변 온도가 마취를 사용하는 경우, 모든 동물의 손실을 방지하기 위해 37 ° C 포스트 절차로 설정 가열 패드에 마우스를 배치합니다. 마취를 사용하는 경우, 마우스의 입과 주둥이가 열 패드에 방해되지 않는 동안하고 완전히 복구 될 때까지 마우스를 준수하는지 확인하십시오. 이전 HGD에 마우스에서 음식이나 물을 원천 징수하지 마십시오. </li><li> 혈관을 팽창하기 위해 쥐를 따뜻하게. <ol><li> 침구의 온도가 약 38 ~ 39 ° C. 수 있도록 5 분 동안 열 패드에서 마우스 케이지 (침구 포함 가능)를 배치 온도에 대한 열 패드에 생쥐를 유지할만큼 충분히 낮아야기간을 연장했다. </li><li> 또한, 최소한의 규제로 등의 접근 제한 수단에 마우스를 놓습니다. 부드럽게 따뜻한 물에 적신 거즈로 잡고 1 분 동안 마우스의 꼬리를 따뜻하게. 필요한 경우, 다시 위치에 마우스를 허용합니다. 건조 티슈로 꼬리를 닦아냅니다. </li><li> 또한, 더 이상 2보다 분 동안 가열 램프 아래에 케이지를 배치하여 따뜻한 마우스. 가열 램프를 사용하는 경우, 마우스의 과열을 방지하기 위해주의를 기울여야합니다. </li></ol></li><li> 대용량 꼬리 정맥 주입 <ol><li> 실험실 테이프를 평평한 표면에 지느러미 액세스 제한 수단을 고정시킨다. </li><li> 꼬리 잡고 천천히 제한 수단에 마우스를 놓고 플러그를 삽입합니다. 고정 꼬리를 유지하기 위해 필요에 따라 적게 억제를 사용합니다. 마우스가 자유롭게 호흡되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마우스가 절차 중 어느 시점에서 심한 고통에있는 경우, 즉시 제한 기에서 마우스를 제거하고 휴식 할 수 있습니다. </li><li> 마우스의 위치를​​ 이렇게측면 꼬리 정맥 중 하나가 표시됩니다. 꼬리의 양쪽에 블루 라인이 측면 꼬리 정맥 동안 꼬리의 중간에 실행하는 빨간색 선은, 동맥입니다 : 마우스의 뒷면에 똑바로보고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다. </li><li> 철저하게 알코올 면봉으로 마우스의 꼬리를 닦아냅니다. </li><li> 꼬리가 중간과 세 번째 손가락에와 새끼 손가락 아래에서 검지 손가락에서 통과되도록 비 주입 손을 사용하여 색인과 중간 손가락 사이에 단단히 꼬리를 개최합니다. 엄지 손가락을 자유롭게 움직일 유지 할 수 있습니다. (그림 1A) </li><li> 다른 손을 사용하여, 알콜 면봉으로 다시 주입 할 영역을 닦아. 지역은 건조하도록 허용합니다. </li><li> 주입 - 손에 넣은 주사기를 들고 엄지 손가락과 다른 네 자리 숫자의 배럴를 잡고. 플런저에 잡지 마십시오. </li><li> 마우스의 몸을 향하여 바늘 가리키는 꼬리 주사기 평행하게 놓고위로 향하게 바늘의 경사 (경사 가장자리). </li><li> 꼬리 정맥에 바늘을 삽입합니다. 저항없이있는 슬라이딩 바늘에서 분명 정맥이 제대로있는 경우에만 주사를 진행합니다. 바늘 삽입의 깊이가 있지만, 전체 삽입 인해 정맥의 전단의 위험이 증가하지 않는 것이 좋습니다 개인 취향의 문제라고합니다. 바늘을 이동하지 마십시오. </li><li> 꼬리를 들고 손의 엄지 손가락을 사용하여 위치에 바늘을 잡아 꼬리에 바늘을 누르 허브의 허브에 폐쇄. 극단적 인 압력을 적용하지 않고 이러한 정맥에 액체의 흐름을 방해하므로, 바늘 축에 보유하지 않습니다. 주입 (그림 1A)를 방해하지 않도록 느슨하게이 시점에서 검지 손가락으로 꼬리를 잡아. </li><li> 집게 손가락과 가운데 손가락 플랜지에 들고 엄지는 플런저의 끝 (Figur에되도록 주사기 손을 잡고 다시는 위치전자 1A). </li><li> 하나, 연속 동작으로 플런저를 아래로 눌러 6 ~ 8 초에서 액체의 전체 볼륨을 주입. </li><li> 정맥에서 바늘을 제거하고 티슈로 꼬리에 부드러운 압력을 적용하여 출혈을 중지합니다. </li><li> 가열 패드의 상단에 배치 복구 케이지에 제한 기 및 장소 마우스에서 마우스를 제거 (침구는 37 ~ 38 ° C에서해야한다). 사출 방 감기의 경우,이 단계는 마우스의 생존을 위해 매우 중요합니다. 출혈이 완전히 정지 할 때까지 마우스의 차려라. </li><li> 유체 역학적 DNA 전달 다음 1 시간 동안 마우스를 관찰합니다. 헥헥과 부동의 초기 기간으로 인해 HGD에 의한 일시적인 부정맥에 정상입니다 만, 마우스가 약 5 분에 회복 조짐을 표시해야합니다. 마우스의 호흡이 상당히 얕은되면, 조심스럽게 호흡을 용이하게하기 위해 마우스의 복부를 마사지. 회복의 속도가 약간 사용되는 마우스의 변형에 의해 영향을받을 수도 있습니다. </li><li> 반환 마우스주택 케이지와 마우스가 풍부한 식량과 물의 공급이 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 다른 손 위치를 사용하여 대용량의 꼬리 정맥 주입 <ol><li> 제한 수단에 마우스를 놓고 전술 한 바와 같이, 4.3.5 단계 4.3.1에 ​​따라 분사를 준비하고 있습니다. </li><li> 구십도 각도로 구부려 네 손가락으로 평평한 표면에 비 주입 손을 놓습니다. 손가락 (엄지를 제외한 전부) 플랫폼을 만들어 서로 위에 쉬어야. 엄지와 손가락을 가리키는 (그림 1B) 사이의 마우스의 꼬리를 잡고. </li><li> 다른 손을 사용하여, 알콜 면봉으로 다시 주입 할 영역을 닦아. 지역은 건조하도록 허용합니다. </li><li> 주입 - 손으로 주사기를 잡고 플랜지 및 주입을위한 준비 플런저의 말을 개최합니다. </li><li> 전술 한 바와 같이, 단계 4.3.17을 통해 단계 4.3.9에서이 프로토콜에 따라 절차를 완료합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li><li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA.">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).</li><li>Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+and+therapeutic-level+hepatic+gene+expression+of+human+factor+IX+after+naked+plasmid+transfer+in+vivo.">Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo.</a> Mol Ther. 3, 947-957 (2001).</li><li>Magin-Lachmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+delivery+of+intact+BAC+DNA+--+comparison+of+different+methods.">In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods.</a> J Gene Med. 6, 195-209 (2004).</li><li>Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+the+human+hepatitis+delta+virus+genome+Is+initiated+in+mouse+hepatocytes+following+intravenous+injection+of+naked+DNA+or+RNA+sequences.">Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences.</a> J Virol. 75, 3469-3473 (2001).</li><li>Giladi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+inhibits+hepatitis+B+virus+replication+in+mice.">Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice.</a> Mol Ther. 8, 769-776 (2003).</li><li>Kobayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector-based+in+vivo+RNA+interference:+dose-+and+time-dependent+suppression+of+transgene+expression.">Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression.</a> J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).</li><li>Layzer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+activity+of+nuclease-resistant+siRNAs.">In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs.</a> Rna. 10, 766-771 (2004).</li><li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+adult+mice.">RNA interference in adult mice.</a> Nature. 418, 38-39 (2002).</li><li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+hepatitis+C+translational+initiation+in+vitro,+in+cultured+cells+and+mice.">Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice.</a> Mol Ther. 5, 676-684 (2002).</li><li>McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+and+specific+morpholino+antisense+inhibitor+of+hepatitis+C+translation+in+mice.">A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice.</a> Hepatology. 38, 503-508 (2003).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroporation+as+the+mechanism+of+hydrodynamic+delivery.">Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery.</a> Gene Ther. 11, 675-682 (2004).</li><li>Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+uptake+and+gene+expression+mechanisms+following+intravenous+administration+of+plasmid+DNA+by+conventional+and+hydrodynamics-based+procedures.">Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures.</a> J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).</li><li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+procedure+involves+transient+hyperpermeability+in+the+hepatic+cellular+membrane:+implication+of+a+nonspecific+process+in+efficient+intracellular+gene+delivery.">Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery.</a> J Gene Med. 6, 584-592 (2004).</li><li>Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+and+its+applications+in+pharmaceutical+research.">Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research.</a> Pharm Res. 28, 694-701 (2011).</li><li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery:+principle,+limitations,+and+recent+progress.">Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress.</a> Aaps J. 11, 671-681 (2009).</li><li>Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery:+what+we+know+and+what+is+next.">Nonviral gene delivery: what we know and what is next.</a> Aaps J. 9, (2007).</li><li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+progress+and+prospects:+hydrodynamic+gene+delivery.">Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery.</a> Gene Ther. 14, 99-107 (2007).</li><li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamics-based+procedure+for+controlling+the+pharmacokinetics+of+gene+medicines+at+whole+body,+organ+and+cellular+levels.">The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).</li><li>Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+delivery.">Hydrodynamic delivery.</a> Adv Genet. 54, 65-82 (2005).</li><li>Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+delivery+of+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+to+livers+of+mice+by+hydrodynamic+injection.">Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection.</a> Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).</li><li>Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence-based+in+vivo+monitoring+of+NF-kappaB+activity+through+a+gene+delivery+approach.">Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach.</a> Cell Commun Signal. 11, (2013).</li><li>Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+delivery+of+DNA.">Hydrodynamic delivery of DNA.</a> Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).</li><li>Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+expression+of+naked+plasmid+DNA+encoding+hepatocyte+growth+factor+in+mice+promotes+liver+and+overall+body+growth.">Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth.</a> Hepatology. 33, 848-859 (2001).</li><li>Maruyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+of+naked+DNA+delivered+to+rat+liver+via+tail+vein+injection.">High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection.</a> J Gene Med. 4, 333-341 (2002).</li><li>Hen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+foreign+genes+in+chicks+by+hydrodynamics-based+naked+plasmid+transfer+in+vivo.">Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo.</a> Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).</li><li>Eastman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+catheter-based+procedures+for+transducing+the+isolated+rabbit+liver+with+plasmid+DNA.">Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).</li><li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume.">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).</li><li>Vanden Bossche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+general+aspects+of+the+distribution+and+epidemiology+of+bovine+trypanosomosis+in+southern+Africa.">Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa.</a> Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).</li><li>Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis:+Epidemiology+and+control.">Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control.</a> Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).</li><li>Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors.">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li><li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trypanolytic+factor+of+human+serum.">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li><li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum.">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li><li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum.">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li><li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein.">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li><li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosome+lytic+factor,+a+subclass+of+high-density+lipoprotein,+forms+cation-selective+pores+in+membranes.">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li><li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes.">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li><li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model.">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li><li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei.">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li><li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes.">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans.">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li><li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene.">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li><li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver.">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

올바르게 수행 할 경우, HGD는 유전자 전달의 매우 안전하고 효과적인 방법입니다. 성공적인 HGD에 중요한 단계는 1)보다 8 초에 마우스 3)의 꼬리 정맥에) 생리 식염수 차량 2의 큰 볼륨에서 DNA의 정확한 양을 제공. 주입 과정 자체가 대단한 약간의 손재주가 필요하지만,이 여섯 번째 절차의 성공은 종종 실험주의 준비에있다. 최대한의 유전자 발현을 달성하기 위해 필요한의 pDN...

에 의해 처음으로 설명하기 때문에 류 등. 및 장 등., 유체 유전자 전달 (HGD)는 설치류 모델 시스템 1, 2 유전자의 기능을 연구하는데 매우 중요한 도구가되고있다. 기술은 표적 기관 1, 2의 세포에 의해 플라스미드 DNA의 흡수를 촉진하기 위하여 마우스의 꼬리 정맥에 용액의 대량 (8~12% 체중)의 급속 주입 (5-7 초)을 포함한다. 이러한 조건은 신장, 비장, 폐와 심장에 간 적은 유전자 발현의 강력한 유전자 발현을 초래할. 10 μg을 pCMV-LacZ를 플라스미드 주입 HGD 날짜 1에 가장 효율적인 비 바이러스 성, 생체 내 유전자 전달 방법을 만드는 간세포의 많은 40 %가 감염 될 수 있습니다. 바이러스 성 항공사와는 달리, pDNA를 준비하기 쉽고, 설치류 호스트 3 면역 반응을 유도하지 않고 끝이 재결합하여 건강 위험하지 않습니다ogenous 바이러스. HGD에 의해 전달 된 DNA 분자가 포장을 필요로하지 않기 때문에 또한,이 방법은 150킬로바이트 4만큼 많은 세균 인공 염색체 (BAC)의 전달에 적합하다. 유체 역학적 방법에 의해 전달 된 분자의 다른 종류의 RNA 5-10, morpholinos와 11, 단백질 12, 13 및 다른 작은 분자 (12, 14)이 (가) 있습니다. 다른 전달 방법에 HGD의 장점과 단점은 문학 15 ~ 20 우수 리뷰에서 논의되었고, 저자의 수는 21-23 절차에 대한 자세한 설명을 제공하고 있습니다. HGD에 의해 마우스에 형질 전환 유전자를 도입하면 안전하고 1-3, 24 효과적이 방법은 비교 성공 (25)와 쥐에 사용되어왔다. 특정의 수정, 개념 증명 실험은 닭 26, RAB에서 실시 된큰 동물이 기술의 생체 내 응용 프로그램이 과제로 남아,하지만, (27)와 돼지 28 비트. 이 방법을 사용할 때, 또 다른 일반적인 제한은 가능한 포유류 발현 벡터의 많은 유전자 발현의 지속성, 높은 수준을 달성하기 성분이 부족하다는 것이다. 대상 기관에서을 pCMV 룩 플라스미드 유전자 발현을 사용하지만, 초기의 높은 발현 수준이 주입 한 후 첫 주에 급격히 인하, HGD 후 십분 빠르면 분명하다. 장기간의 형질 전환 유전자의 발현은 플라스미드 디자인 3, 24 그러나, 높은 수준의 유전자 발현의 유지가 종종 필요 반복 주사에 사용되는 프로모터와 인트론에 따라 가능하다. 이러한 이유로, HGD가 손상 단백질이나 단백질 제품에 장기간 노출의 결과 만성 질환을 연구 덜 적합 할 수 있습니다. 이러한 한계로, HGD는 PO 공부를위한 매우 강력한 도구입니다유전자 및 그것의 효과 tential 역할 (검토를 위해, 15 참조) 생체 내뿐만 아니라 치료 효과와 단백질의 조절에 질병의 동물 모델을 확립하는 돌연변이. 예를 들어, HGD 개별적으로 각각의 유전자가 녹아웃 한 마우스에 다양한 유전자 구성체를 도입하여 도메인 및 단백질의 아미노산에 기능을 할당하는 데 사용될 수있다. 또한,이 기법은 임의의 마우스 균주에서 사용될 수있다. 배달의 정맥 주입 볼륨과 속도에 정확한 바늘 삽입 :이 프로토콜은 성공적으로 형질 전환을 달성하기 위해 필요한 기술적 인 측면에 초점을 생쥐에 HGD에 대해 설명합니다. 이 방법의 적용은 아프리카 트리파노소마, 인간의 치명적인 질병과 가축 (29, 30)의 마우스 모델에서 입증된다. trypanosomes의 몇몇 종 가축에 질병을 일으키는 원인이 있지만, 대부분은 B의 면역 복합체를 타고난에 의한 인간의 질병을 일으킬 수CTRL 키를 누른라고 trypanosome 세포 용해 인자 (TLFs) 29, 31, 32. 이러한 기공 형성, 고밀도 지단백질 (HDL)의 두 가지 고유, 영장류 특정 단백질이 들어 있습니다. trypanosomes에 TLFs의 흡수를 용이하게 HPR, 리간드, 및 APOL-I, 용해성 구성 요소 31, 33 ~ 38을 Trypanosoma을 brucei의 rhodesiense 인해 바인딩과 인간 APOL-I (34), (39)을 중화 혈청 내성 관련 단백질 (SRA)의 표현으로 인간을 감염시킬 수 있습니다. 비비 TLF는 인해 발산 APOL-I 단백질 40 SRA에 의해 중화되지 않습니다. 포유 동물 발현 벡터 (pRG977), 쥐 원숭이 TLF 구성 요소의 형질 전환 식을 사용하여, 이전에보고 된 인간 감염 trypanosomes (40)에 대한 보호 기능을 부여한다. 여기에 제시된 대표적인 데이터는 유체 역학적 유전자 전달이 단백질의 치료 효과를 연구에 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Prep Wipe</td>
			<td style="width:113px;">Webcol</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6818</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AST kit, Amplite Colorimetric</td>
			<td style="width:113px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical Tube, 50 ml</td>
			<td style="width:113px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:113px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:113px;">KIMTECH</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse Tail Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MTI RST</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pRG977 (mammalian expression vector)</td>
			<td style="width:113px;">Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">NC9054335</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:167px;">Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice

생체 내에서 형질 전환 유전자를 효율적으로 발현은 유전자 기능을 연구하고 질병에 대한 치료법 개발에 매우 중요합니다. 지난 몇 년 동안, 유체 유전자 전달 (HGD)이 설치류에 형질 전환 유전자를 전달하기위한, 간단하고, 빠르고, 안전하고 효과적인 방법으로 떠오르고있다. 이 기술은 관류 기관의 세포막의 투과성을 증가시키는 생리 용액의 대량의 급속한 주입에 의해 생성되는 힘에 의존하고, 따라서 세포로 DNA를 전달한다. HGD의 주요 장점 중 하나는 알몸 플라스미드 DNA (pDNA를)를 사용하여 포유류 세포로 형질 전환 유전자를 도입 할 수있는 기능입니다. 플라스미드를 사용하여 외래 유전자를 도입하는 방법은 매우 안전하고, 최소한의 고효율, 힘들고, 바이러스 사업자에 반대합니다. HGD가 처음 생쥐에 유전자를 전달하기 위해 사용 된, 그것은 이제 올리고 뉴클레오티드, 인공 염색체, RNA, 단백질 및 마우스에 작은 분자를 포함한 물질의 넓은 범위, 래트를 전달하는 데 사용와, 제한된 정도, 다른 동물. 이 프로토콜은 생쥐의 HGD에 대해 설명하고 프로 시저를 성공적으로 수행하는 중요한 방법의 세 가지 주요 측면에 초점을 맞추고 : 정맥에 바늘의 정확한 삽입, 분사의 볼륨 및 배달의 속도. 예를 분비, 영장류 특정 단백질을 인코딩하는 두 유전자의 일시적 발현이 방법의 응용 프로그램을 보여 주어, 아포 지단백 LI (APOL-I)과 합 토글 로빈 관련 단백질 (HPR).

마우스의 꼬리 정맥에 바늘의 정확한 위치는 (도 1에 도시 된 바와 같이)을 성공적으로 유체 역학 기반하여 형질 도입 유전자 전달을위한 필수 조건이다. 주입의 전체 볼륨은 6-8의 기간 내에 전달 될 수 있도록 종종 기술의 가장 어려운 부분은, 그러나, 움직임이없는 꼬리 정맥 내 바늘의 유지이다. 사출 과정에서 사소한 오류가 크게 감소 된 형질 전환 효율 및 단백질 발현의 원인이 ?...

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Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

유체 유전자 전달에 의한 벌거 벗은 DNA의 생체 내 형질에서 최소한의 염증 반응과 동물의 조직에 유전자를 소개합니다. 유전자 산물의 충분한 양의 유전자 기능 및 조절뿐만 아니라, 단백질의 구조 및 기능 분석 될 수 있도록 생성된다.

마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.3K 조회수.  Hunter College, CUNY.  유체 유전자 전달에 의한 벌거 벗은 DNA의 생체 내 형질에서 최소한의 염증 반응과 동물의 조직에 유전자를 소개합니다. 유전자 산물의 충분한 양의 유전자 기능 및 조절뿐만 아니라, 단백질의 구조 및 기능 분석 될 수 있도록 생성된다. 

비디오: Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.