Bien que les techniques d’évaluation des biomarqueurs biochimiques soient largement utilisées, ce protocole présente des détails cruciaux pour la normalisation et la réplication de la méthodologie chez les anoures néotropicaux. Le principal avantage de cette technique est son faible coût, sa reproductibilité et son application. Cette technique peut être appliquée pour obtenir des données quantitatives permettant d’évaluer les altérations de la mélanine interne.
Le dosage des comètes est une technique sensible, polyvalente et simple qui permet de déterminer les effets génotoxiques induits par un composé spécifique. Il peut être appliqué à tout type de cellules eucaryotes pour surveiller les dommages à l’ADN, la réparation de l’ADN et évaluer le statut antioxydant des cellules. Pour commencer, ouvrez le logiciel Image-Pro Plus 6.0 et sélectionnez le menu et la barre d’outils comme biologiques.
Pour quantifier la surface occupée par la mélanine, sélectionnez mesurer, puis sélectionner l’étalonnage spatial du grossissement utilisé pour prendre les micrographies photographiques. Après avoir ouvert l’image histologique, sélectionnez le nombre d’outils, puis mesurez les objets. Marquez la coloration à mesurer dans l’image à l’aide de l’outil de sélection des couleurs et de la pipette, puis fermez la fenêtre.
Visualisez les résultats en cliquant sur compter, afficher et statistiques. Incuber un mélange de PBS, de peroxyde d’hydrogène et d’un échantillon dans une cuvette en quartz de trois millilitres avec une longueur de trajet d’un centimètre. Ensuite, retirez l’échantillon conservé dans un tube à centrifuger de 500 microlitres et ajoutez-le dans la cuvette en quartz.
Lisez la cinétique de la catalase à 240 nanomètres pendant deux minutes dans un spectrophotomètre UV et calculez l’activité enzymatique à l’aide de l’équation affichée à l’écran. Diluez l’échantillon de sang prélevé avec un millilitre de PBS. Centrifugez-le à 381 G pendant neuf minutes et remettez le granulé en suspension avec 50 millilitres de PBS.
Mélangez 30 microlitres de l’échantillon de sang dans 70 microlitres d’agarose à bas point de fusion ou LMPA à une concentration de 0,5% d’agarose pour former la deuxième couche. Placez 50 microlitres de la deuxième couche sur une lame préalablement recouverte de la première couche contenant 100 microlitres d’agarose à 0,5 % de point de fusion normal. Couvrez la diapositive avec une lamelle et placez-la au froid à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour solidifier la deuxième couche.
Après solidification, retirez la lamelle. Formez la troisième couche en déposant 100 microlitres de LMPA à 0,5 % et couvrez à nouveau la lame. Une fois la troisième couche solidifiée, retirez la lamelle et plongez chaque lame dans un bocal de 100 millilitres contenant la solution de lyse préparée le même jour.
Placez les bocaux de coplin dans un bain froid à quatre degrés Celsius pendant une heure dans l’obscurité pour que la lyse se produise. À la fin de la lyse, retirez les lames et plongez-les dans la solution tampon d’électrophorèse dans le réservoir d’électrophorèse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour permettre à l’ADN de se dérouler. Après le déroulement de l’ADN nucléaire, effectuez une électrophorèse sur le même tampon à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 25 volts et 250 milliampères.
À la fin de l’électrophorèse, neutralisez les échantillons dans les lames en ajoutant deux millilitres de solution chlorhydrique tris trois fois pendant cinq minutes. Placez les échantillons dans des bocaux coplin de 100 millilitres contenant 95 % d’alcool à quatre degrés Celsius pour déshydrater les échantillons. Colorez les échantillons en ajoutant 10 microlitres de DAPI au centre de la lame.
Ensuite, étalez le colorant sur tout l’échantillon à l’aide d’une lamelle. Examinez les lames à l’aide d’un photomicroscope à fluorescence muni d’un filtre NU. Quantifiez les dommages à l’ADN en évaluant la durée de migration de l’ADN à partir du nucléoïde.
Dans ce cas, déterminez visuellement sur 100 cellules sélectionnées au hasard sans chevauchement. Ensuite, classez les dommages à l’ADN en quatre classes où zéro à un correspond à l’absence de dommages, deux aux dommages minimaux, trois aux dommages moyens et quatre aux dommages maximums. Exprimez les données sous forme de nombre moyen de cellules endommagées et de score moyen de comète pour chaque groupe de traitement.
Enfin, à partir de ces données, calculez l’indice de dommages génétiques ou GDI pour chaque organisme d’essai à l’aide de l’équation affichée à l’écran. L’indice de masse à l’échelle de Boana pulchella et de Leptodactylus luctator adultes est illustré sur cette figure. Pour l’analyse de l’indice de masse à l’échelle, une analyse de régression non linéaire a été effectuée qui démontre la relation de fonction de puissance entre la LMC et la masse corporelle pour l’espèce afin de déterminer l’exposant d’échelle.
L’indice de masse à l’échelle est utile pour comparer des groupes d’adultes ou de juvéniles d’une même espèce. Les coupes histologiques du foie de Boana raniceps sont présentées ici. Une plus grande quantité de c et de plus grandes dimensions de l’hépatocyte et du noyau des hépatocytes peuvent être observées à partir de ces coupes.
Cette figure montre des réponses différentes et complémentaires de biomarqueurs cytogénétiques dans un scénario d’exposition à un herbicide chez Boana pulchella. Ici, les barres noires indiquent 48 heures et les barres grises indiquent 96 heures. Le temps d’exposition et la concentration doivent toujours être considérés comme des facteurs ici, car un temps ou une concentration particulière peut ne pas être suffisant pour induire des dommages.
L’image représentative décrit comment les biomarqueurs sont liés à l’indice de réponse des biomarqueurs. Ici, le bleu indique le groupe de contrôle, tandis que les couleurs orange, jaune et vert indiquent les scénarios d’exposition au BDE 209. Ces données indiquent que la catalase est un biomarqueur efficace pour les situations de stress dans lesquelles le facteur de stress est présent aux concentrations les plus élevées.
Lors du calcul de l’indice d’état corporel, prenez systématiquement des photos à la même distance. Chez les têtards, mesurez la longueur du corps de la LCV jusqu’au tube cloacal, à l’exclusion de la nageoire du collier. Cette approche aborde en toute sécurité la physiologie des amphibiens et l’impact des changements environnementaux.
Bien qu’il existe d’autres biomarqueurs potentiellement invasifs, ces méthodes offrent des informations sur le stress oxydatif, la toxicodynamique et la toxicogénétique. Des mesures enzymatiques supplémentaires liées au stress oxydatif peuvent servir de méthodologies alternatives. La technique d’analyse des différences de couleur évalue les réponses tissulaires dans les photomicrographies en fonction des disparités de couleur.
Pour le système pigmentaire, assurez-vous que l’étalonnage du programme s’aligne sur la photomicrographie. Cette technique avancée est essentielle pour déterminer si les xénobiotiques affectent directement l’ADN dans divers types de cellules, en répondant aux questions concernant les dommages oxydatifs du matériel génétique et les processus de réparation que d’autres techniques cytogénétiques ne peuvent pas traiter.
